Introduction
본 연구의 목적은 양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT) 마우스의 특정 조직에 혈류에서 포도당의 생체 실시간 흡수를 정량화 기반 방법을 개발 하였다. 이는 세포 내 공간 플라즈마 세포 내 공간으로부터 전송 속도와의 속도로 플라즈마로부터 18 F-FDG 흡수율을 추정하기 위해 당 흡수 및 동역학 모델을 측정하기 위해 18 F 표지 fluorodeoxyglucose (FDG)를 사용하여 이루어졌다 18 F-FDG 인산화.
설치류에서 18 F-FDG 수많은 암 치료 1, 종양 진행이 종양 대사 3의 연구뿐만 아니라 갈색 지방 창고 4, neuroinflamation 5 및 뇌 대사 (6)의 영상의 전임상 평가에 사용되어왔다
일반적으로 각 조직 7 안락사, 조직 수집하고 방사 활성을 측정 하였다 3 H 또는 14 C 중 2- 데 옥시 글루코오스의 방사성 표지 된 치료를 포함하는 마우스 (쥐)에서 글루코스의 조직 특이 적 흡수를 검사하는 데 사용되는 전통적인 방법. PET / CT의 사용은 살아있는 동물에서 동시에 다수의 기관 및 지역 당 흡수 및 대사의 비 침습성 측정을 허용한다. 안락사가 필요한 것은 아닙니다으로 또한,이 기술은 종 연구에 사용하기에 적합하다.
제 2 형 당뇨병 (T2DM)이 파괴 포도당 대사 및 인슐린에 대한 감소 된 반응성 조직 이차적 고혈당증 (인슐린 저항성) 및 인슐린 (8)의 충분한 양을 생성하는 췌장 β- 세포의 무능력을 특징으로한다. 포도당의 흡수와 대사의 운동 분석에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다조치 및 치료 개입의 효과의 메커니즘뿐만 아니라 질병의 진행의 고급 모니터링 할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구에서 설명하는 모든 절차는 시드니 지역 보건 지구와 시드니 동물 윤리위원회의 대학 승인 및 관리 및 실험 동물의 사용, 여덟 번째 에디션 (2011)에 대한 NIH 가이드를 따라했다.
1. 동물 준비
참고 :이 프로토콜 남성 DB에 / db 마우스 (BKS.Cg- Dock7의 m + / + Lepr dB / J)는 6 주령까지 그룹 차우하는 광고 임의로 액세스 할 수있는 주택과 물에 유지되었다. 촬상시에 쥐는 ~ 30g을 칭량. 이 프로토콜에서 사용 된 모든 마우스는 10, 14 밀리몰 / L 사이, 공복 혈당했다.
- 필요한 경우, 마우스를 빠르게. 본 실시 예에서, 실험 절차 전에 5 시간 동안 마우스를 빠르게.
- 촬상 개시 전에 원하는 제 (예 : 약물, 단백질, 펩티드)로 쥐를 치료. 이 예에서, (3) 인슐린 피하 주사 (관리U / kg 인간 인슐린) 상당 체적 PBS 30 분의 촬상 개시에 앞서.
2. 설정 워크 플로우
참고 :이 프로토콜은 PET / CT 스캐너에 구현되었다. CT 데이터를 수집 한 다음 제 PET 데이터를 획득.
- PET 설정 :
- 18 F 등을 선택 동위 원소, 3,600 s로 주사 기간을 설정하고, 350 keV의 상하도 에너지 레벨 판별 - 650 keV의 (기본) NS 3.432 (디폴트)의 일치 타이밍 창. 탐침 주사 후 60 분 - 기간 0 16 프레임 (6 × 10 초, 4 × 60 초, 1 × 300 (S), 5 × 600 (S))에 히스토그램 목록 모드 데이터. 줌 1.5 2D-FBP를 사용하여 sinograms 방출을 재구성.
주 : 재구성 된 이미지 128 × 128 × 159 복셀로 동적 16 개 프레임들 각각의 구성 및 0.52 × 0.52 × 0.796 mm (3)의 복셀 사이즈.
- 18 F 등을 선택 동위 원소, 3,600 s로 주사 기간을 설정하고, 350 keV의 상하도 에너지 레벨 판별 - 650 keV의 (기본) NS 3.432 (디폴트)의 일치 타이밍 창. 탐침 주사 후 60 분 - 기간 0 16 프레임 (6 × 10 초, 4 × 60 초, 1 × 300 (S), 5 × 600 (S))에 히스토그램 목록 모드 데이터. 줌 1.5 2D-FBP를 사용하여 sinograms 방출을 재구성.
- CT 설정 :
- 에 대한전체 몸의 CT 스캔은 50 kV로, 노출 시간을 500 밀리 초 및 360 회 이상의 돌기 200에서 500에서의 전압을 전류로 설정. (PET FOV 전체 범위를 커버하는) 3, 30,722,048 베드에 위치 수 뷰 (FOV)의 검출 영역을 설정 베드 위치 = 30.234713 % 및 제 4 검출기 비닝 간의 오버랩.
주 : CT 재구성은 보정 후, 바이 리니어 보간 Shepp-로건 필터 콘빔 단층 화상 재구성 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다.
- 에 대한전체 몸의 CT 스캔은 50 kV로, 노출 시간을 500 밀리 초 및 360 회 이상의 돌기 200에서 500에서의 전압을 전류로 설정. (PET FOV 전체 범위를 커버하는) 3, 30,722,048 베드에 위치 수 뷰 (FOV)의 검출 영역을 설정 베드 위치 = 30.234713 % 및 제 4 검출기 비닝 간의 오버랩.
- 18 F-FDG :
- 충분한 18 F-FDG 주문 (예를 들면, 0.5 ㎖의 450 MBq의) 로컬 공급자는 제 ~ 주사 전 30 분에 도착한다. 동물이받을 수 있도록 나누어 및 0.1 ㎖의 최종 부피로 18 ~ F-10 MBq의 FDG를 18 F-FDG 희석.
3. 이미징 프로토콜
- 무균 상태를 유지하기 위해 80 % (v / v)의 에탄올 유도 챔버 촬상 베드 닦아. 괞 찮아유도 챔버에 마우스를 CE 및 산소 5 % 이소 플루 란 마취.
- 1 L / min의 유량으로 - (2 % 정비, 1.5) 이소 플루 란을 전달하도록 체온을 유지하기위한 전기 가열 패드와 정밀 증발기 노즈콘 장착 촬상 침대 위에 마우스를 놓는다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용합니다.
- 호흡 모니터링 마취 적절한 평면이 유지되도록하기위한 센서 패드에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 위치.
- 측면 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 2 분 - 1 열 팩을 사용하여 꼬리를 따뜻하게. 측면 꼬리 정맥으로 30 게이지 바늘을 삽입하여 측면 꼬리 정맥 카테 테르를 꽂다. 수술 접착제와 장소에 바늘을 안전하고 카테터를 고정합니다.
- 로드 영상 스캐너로 베드 카테터가 기기의 후면으로부터 액세스 할 수 있도록 시스템을 통해 이동 베드.
- SYR에서 18 F-FDG 주사기에 카테터를 연결잉게 드라이버. 주사 투여 할 수있는 양 (<100 μL, 10 초에 걸쳐 주사) 전에 주사기 활동에 기초하여 정확히 18 F-FDG 도즈 (10 MBq 내지)를 계산한다.
- 당 흡수의 변화에 마취의 영향을 최소화하기 위해, 마취 유도 (예를 들면, 30 분) 18 F-FDG의 분사 사이에 일정한 시간을 보장한다.
- 애완 동물은 18 F-FDG의 주입 직전에 스캔 시작. 애완 동물 검사 (3,600 S)를 마무리 한 후, 조직과 추적자 흡수 공동 등록을 허용하기 위해 CT 스캔 (~ 10 분)을 수행한다.
- , 시작 위치로 영상 침대를 이동 침대에서 동물을 제거합니다.
- 이 시점에서 동물을 안락사하거나 복구 할 수 있습니다 :
- 안락사를 들어, 마취 여전히 동안 자궁 경부 전위를 수행하고 이후의 분석을 위해 관심의 장기를 수집합니다.
- 마우스를 복구 할 수있는 경우, 가열 패드에 단일 하우징에 마우스를 올려 놓거나가열 램프의 앞에. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 모니터합니다. 마우스가 그룹 하우징에 반환하기 전에 1 시간 동안 복구 할 수 있습니다.
4. PET 영상 처리
참고 : 이미지 재건은 연구 직장 소프트웨어 버전 4.2에서 수집 직장 소프트웨어 v1.5.0.28 및 분석을 사용 하였다.
- CT와 PET 영상을 공동 등록 정렬이 3 차원 올바른지 확인.
- '파일'메뉴에서 '폴더 검색 / 가져 오기'를 선택하고 데이터가 들어있는 폴더를 선택합니다. 원하는 PET와 CT 데이터를 선택하고 '일반 분석'탭을 클릭합니다.
- 정렬 CR은 '원본'지정되고 PET가 '타겟'을 지정하도록 데이터. '워크 플로우'메뉴에서 '등록'을 선택합니다. 이미지가 조정이 필요한 경우 일의 도구를 사용하여 올바르게 등록 된 공동 될 수 있습니다E '등록'메뉴를 선택합니다.
- '워크 플로우'메뉴에서 '투자 수익 (ROI) 정량화'를 선택합니다.
- 원하는 지역을 찾습니다 '이미지'탭의 '팬'과 '줌'기능을 사용합니다. '도구'메뉴에서 '만들기'탭을 선택하고 붓 아이콘을 클릭합니다. 이미지에 투자 수익 (ROI)을 그립니다
- '저장'메뉴 '저장 ROI 정량'을 선택하여 활성 시간 곡선을 추출한다. CSV 파일로 데이터를 저장합니다.
- 조직의 cm 3 당 BQ로 방사능 흡수를 정량화. CSV는 스프레드 시트 파일을로드하여 3 cm (%의 ID / cm 3) 당 주입 도즈 비율 값으로 변환한다.
5. 입력 기능
- 시스템 점 확산 함수를 수정하기 위해, 이전에 9 바와 같이 반 reblurred Cittert 컨벌루션의 방법을 이용하여 5 번 반복에 대한 추정 시스템 PSF를 deconvolve.
참고 :이 때문에 마우스의 베나 카바의 작은 크기로 필요합니다. - 전술 한 바와 같이 혈액 입력 기능 시간 - 활성 곡선을 생성하기 위해 포스트 컨벌루션 이미지를 사용한다.
6. 운동 모델링
주 : FDG 두 조직 구획 모델 (도 1)은 플라즈마 입력 기능을 필요로한다.
- CSV에서 한 혈액 입력 기능은 다음의 수학 식 10을 이용하여 플라즈마 입력 기능으로 파일 변환 : Input_plasma = Input_blood를 × (0.386 E - 0.191t + 1.165).
- 운동 모델링 도구에서 '운동'버튼을 클릭합니다. 조직 및 플라즈마 총 활동 '메뉴'에서 '로드 시간 활동 곡선'을 선택하여 운동 모델링 도구로 CSV 파일을 계산 가져옵니다.
- '모델'메뉴에서이 개 조직 구획을 선택합니다. 다음 K4의 상자가 선택되지 않은 것을 확인그리고, 초기 피팅 0 값 입력 용 VB에서 박스 (혈액 부피 분율)을 취소하고 2 %의 값을 입력한다.
- '맞춤 현재 지역'을 클릭합니다. 분산액 (11) (12)에 대한 관심의 추출 영역을 수정한다. 다른 분산 시간의 FDG 모델의 카이 제곱 값을 최소화하여이를 달성.
- (K 1 -k에게 3) 지역 속도 상수를 계산하는 VB는 부동 값 (VB에서 다음 박스 용 체크 박스를 선택)하고, 최적의 분산 값을 이용하여 제 피팅을 수행. 난 = (1 × K K 3) K 상수 지역 유입 / (2 + K (K) (3))를 계산한다.
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Representative Results
우리는 이전에 포도당의 흡수와 대사 (13)의 반응 속도에 플라즈마 apoA-I의 수준을 증가의 영향을 조사하기 위해 모델 db / db 마우스를 사용하고 있습니다. 본 연구에서 우리는 실시간으로 비복근 근육 내로 플라즈마로부터 18 F-FDG의 흡수를 모니터링하기 위해 PET / CT 이미징의 유용성을 입증하기 위해 인슐린 치료 dB / db 마우스를 사용 하였다.
6 주 오래 dB / db 마우스를 마취하고, 30 분간 애완 스캔의 시작 전에 피하 주사를 통해 3 인간 인슐린 U / kg, 또는 동등한 볼륨 PBS로 처리 하였다. 마우스를 60 분 동안 측정 PET 정맥 주사 및 흡수를 통해 F-18 FDG 10 MBq의 받았다. CT 스캔은 해부학 참조 하였다.
관심의 영역은 F (중부 표준시 이미지를 사용하여 대정맥과 비복근 근육에 그려진igure 2). 인슐린 dB / db 마우스의 치료는 수집 기간 (도 3a) 위에 비복근의 ROI에서 18 F-FDG 활성을 증가. 대정맥의 ROI에 대해 얻어진 값은 혈장 혈액 값으로 변환하고, 제어부 (도 3b)에 대하여 인슐린 처리 된 마우스에서 인슐린 치료에 의해 변경되지 않았다.
시간 활동 곡선 운동 매개 변수의 계산을위한 운동 모델링 툴에로드. 데이터는 초기 (PBS 각각 인슐린 처리 된 마우스, 80 개 (S) 70 개 (S)) 분산 값을 계산하기 위해 2 % V의 B (혈액 부피 분율) 값 K 4 = 0 두 조직 구획 방식으로 장착시켰다. 다음은 피팅 된 상기 분산 값을 플로팅 V B 값을 이용하여 수행 하였다.
18의 비율에 큰 차이가 없습니다 F-세포 내 공간 (K (1)) 또는 세포 내 공간에서 플라즈마 (K 2)으로의 동맥 플라즈마로부터 FDG 전송을 제어 (표 1)에 비해 인슐린을 처리 한 마우스에서 관찰되었다. 18 F-FDG 인산화 (K 3)의 비율은 상당히 2.26 ± 0.72 × 10-2 분 -1 각각 PBS 인슐린 투여군에 대한 대 인슐린을 처리 한 마우스 (7.06 ± 6.60 × 10-3 증가 하였다 p <0.05 ). 인슐린 치료는 크게 (각각 2.01 ± 0.28 × 10-3 mL의 최소 -1 g -1 대 5.51 ± 4.25 × 10-4; p <0.05)를 PBS 처리 동물에 비해 유입 상수 (K i)를 증가.
도 1 : 활성 지역 시간 곡선은 2 tissu에 맞았다 즉, 세 개의 구획 모델, C1 및 C2는 플라즈마 및 C3은 각각 조직 FDG 인산화 FDG의 농도에서 FDG의 농도로 존재. K는 하나의 조직에서 FDG 흡수 속도, 다시 상기 플라즈마 구획 및 K 3 FDG의 인산화 속도로 조직으로부터 K 2 제거율을 나타낸다. FDG의 탈 인산화는 (K 4 = 0) 무시할 수있는 것으로 가정 하였다.
도 2 : 공동 등록 PET-CT 이미지 비복근 근육 (A) 및 베나 카바 (B)의 관심 영역의 실시 예 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 3 : 비복근 근육 (A) 및 베나 카바 (B)의 관심 영역에 대한 활성 시간 곡선. 남성 dB / db 마우스는 종래 3 U / kg 인슐린 (적색) 또는 동등한 볼륨 PBS (블랙)의 수신에 4.5 시간 동안 금식 하였다. 18 F-FDG (10 MBq 내지)를 정맥 내 주사하고 60 분 동안 PET / CT 결정된 비복근 근육과 베나 카바 18 F-FDG 레벨로 전달 하였다. 값은 평균 ± SD이며 시야 전체의 (N = 4 / 그룹)에서 계산 된 선량 주입의 비율로 나타냈다. 코크란 외에서 개질. 13 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 치료 | 2 케이 | 3 케이 | K의 난 | |
| (ML 분 -1 g -1) | (분 -1) | (분 -1) | (ML 분 -1 g -1) | |
| PBS | 1.31 ± 0.42 × 10 -2 | 0.12 ± 0.11 | 7.06 ± 6.60 × 10 -3 | 5.51 ± 4.25 × 10 -4 |
| 인슐린 | 1.45 ± 0.59 × 10 -2 | 0.09 ± 0.05 | 2.26 ± 0.72 × 10-2 * | 2.01 ± 0.28 × 10-3 * |
표 1 : 인슐린 치료 DB에서 비복근 근육에 플라즈마 증가 18 F-FDG의 운동 분석 /db 마우스. 값은 평균 ± SD 있습니다. * P <A-맨 휘트니 시험 (N = 4 / 그룹)에 따른 PBS VS 0.05.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 마우스에서 혈액 조직으로 스트림 이후 대사에서 당 흡수의 동력학을 결정하는 강력한 비 침습적 방법을 나타낸다.
DB를 / DB 마우스는 인슐린 저항성과 관련 개입을 조사하기 위해 광범위하게 사용 된 제 2 형 당뇨병 (14)의 잘 확립 된 동물 모델입니다. 그러나 이전의 연구는 심장 (15)와 심장과 골격 근육 (16)에 엔드 포인트의 흡수를 정량화했다.
생리 학적 속도 상수를 결정하고 조직으로 플라즈마로부터 18 F-FDG의 흡수를 모델링하는 운동 분석의 사용은 당 흡수 및 대사에 당뇨병 치료 효과에 대한 통찰력을 허용한다. 또한, 이러한 실험을 평가하기 위해 길이 방향으로 수행 할 수 있습니다, 예를 들어, 포도당 대사에 연령 다이어트의 영향. 이 ADVA입니다관심의 기관의 안락사 및 수집이 필요하며, 따라서 단 하나의 시점에서 정보를 제공하는 기존의 방법에 비해 ntageous.
입력 기능 이전 전심 (17)뿐만 아니라, 심장, 간 및 생쥐의 혈액 샘플 (18)을 사용하여 측정 하였지만, 여기에 설명 된 프로토콜 대정맥 19 이상 관심 영역을 이용한 입력 기능의 계산을 허용한다. 이는 PET 연구 중에 동맥 혈액 시료를 이용한 입력 기능을 산출하는 것도 가능하다. 그러나, 이는 생쥐의 혈액 작은 볼륨으로 비실용적이다.
플라즈마 입력 기능보다는 전혈에서 F-18 FDGsignal 사용 마우스 적혈구 (20)에 F-18 FDG의 섭취에 기인한다. 또한, 적혈구 연관된 활동 적혈구 안에 18 F-FDG를 나타내고, 따라서 인다른 조직 구획으로 수송 쉽게 사용할 수 없습니다.
이 프로토콜에서는 대정맥에 마우스의 몸을 통하여 18 F-FDG의 덩어리의 전달을 위해 꼬리 정맥에 배치 카테터의 정확한 위치를 확인하는 것이 중요합니다. 꼬리 온난화 꼬리 정맥 크게이 카테터 삽입의 용이성을 향상 팽창한다. CT 이미지에 그려진 ROI 영역이 제대로 PET 신호에 대응되도록 PET과 CT 영상을 제대로 coregistered되도록하는 것이 중요하다.
포도당 흡수를 조사 연구에 마취제의 선택을 통해 어떤 토론이있다. 이소 플루 란은 일반적으로 사용되는 동물은 마취 동안, 세보 플루 란의 사용은 18 F-FDG PET 실험 21에서 유리할 수있다. 이 프로토콜에서는 betw 시간을 유지하여 이소 플루 란 마취와 관련된 잠재적 인 편견이 최소화되도록하는 것이 중요하다EEN 마취의 유도 및 촬상 상수의 개시.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
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