Summary
ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。
Abstract
細菌性病原体を阻止するための努力では、ホストは、多くの場合、感染部位での栄養素の利用可能性を制限します。この制限は、細胞の代謝を調節する、調節因子が応答するための鍵代謝物の存在量を変えることができます。近年では、タンパク質やRNAの数は、病原性遺伝子発現の重要な調節因子として浮上しています。例えば、コーディタンパク質は、分枝鎖アミノ酸及びGTPのレベルに応答して、広く、低G + Cグラム陽性細菌で保存されています。 黄色ブドウ球菌のグローバルレギュレーターとして、コーディは、毒性の多数および代謝遺伝子の発現を制御します。私たちは、 黄色ブドウ球菌は、潜在的にホスト環境で遭遇栄養制限条件に適応するための努力でその代謝状態を変更するために、部分的には、コーディを使用すると仮定しました。この原稿は、質量分析と連結した液体クロマトグラフィーを用いて、 黄色ブドウ球菌からの代謝産物を抽出し、分析するための方法を記載していますtrometry、この仮説をテストするために開発されたプロトコル。この方法はまた、このような連続ケモスタット培養を使用することなく、生物学的に定常状態と一定の通気を維持するなど厳しさと再現性を確保するベストプラクティスを、強調しています。 USA200メチシリン感受性黄色ブドウ球菌に対してはUAMS-1親株を分離、同質遺伝子コーディ変異体は、（（ 例えば 、スレオニンおよびイソロイシン）アスパラギン酸に由来するアミノ酸の有意な増加を示し、それらの前駆体の減少、例えば 、アスパラギン酸およびO -acetylhomoserine ）。これらの知見は、RNA配列解析で得られた転写データとよく相関：これらの経路における遺伝子は、 コーディヌル変異体に10〜800倍の間にアップレギュレートしました。トランスクリプトームとメタボロームのグローバルな分析を結合することは、環境または栄養ストレスに直面したとき細菌がPHYのに潜在的な洞察を提供し、彼らの代謝を変化させる方法を明らかにすることができます栄養素の欠乏に関連したiological変化は、感染の間に経験しました。そのような発見は、新規な抗感染薬および治療薬の開発のための道を開くことができます。
Introduction
細菌性病原体は、ホスト環境内の多くの課題に取り組まなければなりません。免疫細胞による直接攻撃に加えて、ホストはまた、栄養免疫1、2を生成し 、細菌の生存および複製に必須の栄養素を隔離します。これらの厳しい環境を生き残るためには、細菌性病原体は、病原性因子を展開します。これらの要因のいくつかは、細菌が免疫応答を回避することができます。他の要因は、組織由来成分3、4、5を消費して不足している栄養素を補充するために、細菌を可能にすることができるようなヒアルロニダーゼ、thermonuclease、およびリパーゼなどの消化酵素を分泌が挙げられます。実際、細菌が毒性、6因子7の産生に対する細胞の生理学的状態を結ぶ調節系を進化させてきました、
証拠の成長体は、代謝および毒性を結ぶ重要な調節因子としてのコーディを指します。第ジペプチドパーミアーゼ（DPP）遺伝子11のリプレッサーとして枯草菌で発見が、コーディは、現在、ほぼ全ての低G + Cグラム陽性細菌12,13によって産生されることが知られており、炭素に関与する遺伝子の多数を調節して窒素代謝14、15、16、17、18、19。病原性の種では、コーディも最も重要な病原性遺伝子の一部20、21の発現を制御し、EF "> 22、23、24、25、26、27コーディは二つの配位子のクラスによってDNA結合タンパク質として活性化される：分岐鎖アミノ酸（BCAA、イソロイシン、ロイシン、およびバリン[ILV]）及びGTP。これらの栄養素が豊富である場合、コーディは抑制する（またはいくつかの場合において、刺激）転写を。これらの栄養素は限らなるように、コーディ活性は徐々に中央代謝に接続された様々な代謝経路を介してその再ルーティング前駆段階的転写応答をもたらす、低減されます28、29、30。
質量分析（LC-MS）に連結されたタンデム液体クロマトグラフィーを正確に小分子の細胞内代謝物31を同定および定量することができる強力な技術です。相互コンダクタンスとペアになったときriptome分析（ 例えば、RNA-配列）、この解析ワークフローは、環境または栄養ストレスに応答して起こる生理的変化への洞察を提供することができます。ここでは、LC-MSを介した黄色ブドウ球菌細胞とその後の分析からの代謝産物の抽出のための方法を提示します。このアプローチは、 黄色ブドウ球菌の生理学上のコーディの多面的な効果を発揮するために使用されています。
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Protocol
緩衝溶液の調製
- 超純と1Xの最終濃度になるように10×PBSのストック溶液を希釈することにより（蒸留及び脱イオン）水;リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS）を調製。
- アセトニトリルを2mL、メタノール2mL、超純H 2 O 1mLの、及びギ酸の19μL（0.1mMの最終濃度）を組み合わせることにより、クエンチング溶液を調製します。
- LC-MSは、超純水にギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を添加することによりA溶媒準備。
- アセトニトリルにギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を添加することによりLC-MSの溶媒Bを調製。
注：すべてのソリューションは、（一般的に高速液体クロマトグラフィーグレード）利用可能な最高純度の試薬を用いて調製されなければなりません。ソリューションは、各実験の前に新たに調製し、使用前に氷上で保存してください。
定常状態黄色ブドウ球菌の成長2.確立
- ストリークS. aureu凍結グリセロールストックからのトリプシン大豆寒天（TSA）の分離のための関心のS株。 16-24時間37℃でインキュベートします。
- トリプシン大豆ブロス（TSB）又は各株の単一コロニーを有する滅菌ガラス培養管に別の適切な培地4mlに植菌。 16-20時間、37℃で毎分60の回転（rpm）で回転させながら傾斜（〜70°の角度）でインキュベートします。
注：細胞生理に影響を与える工程2.2に記載のものを含む、標準的な方法を使用するときに一晩培養物を酸素勾配を受けやすいです。したがって、我々は（以下、ステップを2.4から3.2を参照）、生物学的定常状態を確保するために複数のバック希釈戦略を採用しています。 - 600nmで（OD 600）でのステップ2.2からの培養物の光学密度を測定するために分光光度計を使用します。光学的基準（ブランク）として滅菌媒体を用います。別々の、250mLのデロングフラスコ内（37℃に予め温めておいた）滅菌TSB培地50mlに0.05のOD 600にこれらの細胞を希釈します。
- IncuBATE 280 rpmで振盪しながら水浴中で37℃で培養。
- 30分ごとに、OD 600回の測定を行います。光学濃度が増加するにつれて、それは、分光光度計の線形吸光度範囲内に留まるようにTSBで培養物を希釈することが必要になることができます。
- ステップ2.5からの培養物を〜0.8〜1.0のOD 600を達成したとき、0.01〜0.05のOD 600まで37℃TSB 50mlにそれらを継代培養を繰り返し2.4および2.5ステップ。
3.サンプルのコレクションのセットアップ
- 適当な容器（ 例えば、ガラス皿、アイスバケット、またはクーラー）に砕いたドライアイスのベッドを準備します。
- 培養物の光学濃度が所望の収穫点に近づくと、≥5分間ドライアイス上で35ミリメートル未処理のペトリ皿と予備冷却するために急冷溶液1mLを加えます。
注：「希望収穫ポイントは」実験的な目標に応じて異なります。例えば、一方がMを検査した場合etabolites好気性成長の間、この状態の重要な指標は、酢酸排泄及び後指数増殖期32、33中の酢酸の再同化を含みます。一般に、この点は、特定の成長段階（ 例えば、対数期）以内でなければなりません。この段階に関連する特定のOD 600の値は、異なる細菌株および増殖培地の間で変化してもよいです。 - ゴム栓で（-20℃に予冷）ステンレス鋼フィルターフリットを配置し、ハウス真空または真空ポンプに取り付けられた真空フラスコの上にそれを置きます。
- 真空を適用し、上部に混合セルロースエステル膜（0.22μmの孔径）を置きます。
注：フリットと同等の直径を有するフィルタを使用すると、適切サンプルがフィルタを介してではなく、エッジ上に描画されることを保証するために、このフィルタをセンタリングすることが重要です。氷冷、滅菌H 2 Oを用いて膜を濡らすことを助けることができます膜を配置しています。
4.サンプルの収穫
- OD 600〜0.4〜0.5で、フラスコからの培養物の13 mLのを除去するために血清学的ピペットを使用して、フィルターに試料を適用します。
- 全サンプルを濾過した後、直ちに培地関連代謝産物を洗い流すために氷冷PBSの≥5mLでフィルターを洗浄します。
- 真空を外し、フリットからフィルタを除去するために滅菌ピンセットを使用します。予冷クエンチ溶液にフィルタ（セル側ダウン）を反転させます。
注：これは、すぐに液体が代謝活性を逮捕、細胞の急速冷却を確保するために除去されているように（ すなわち、数秒以内）すぐに上記の手順を実行することが重要であると。 - ≥20分間ドライアイス上でクエンチ溶液中でフィルターをインキュベートします。
- 滅菌ピンセットを用いて、ペトリ皿にフィルタ（セルサイドアップ）を反転し、Tのオフ細胞をリンスするためにマイクロピペットを使用して彼は、クエンチ液に膜。
- 急冷溶液中で細胞を再懸濁し、次いで0.1ミリメートルシリカビーズ〜100μLを含む無菌2mLの耐衝撃性チューブに細胞懸濁液を移します。ドライアイス上または-80°Cでこれを保管してください。
5.代謝物の抽出
- 融解サンプルを湿潤氷上及びサイクル間ドライアイス上で2分間の冷却期間と、6,000rpmで4つの30秒バーストでホモジナイザーで細胞を破壊します。
- 最高速度で予め冷却、冷蔵微量で15分間溶解物を明確に（ すなわち、≤4℃で18213×gで）。
- きれいな微量遠心チューブに上清を移します。
- マイクロピペットを用いて、ステップ6中の残留ペプチド含量の定量化のためのマイクロ遠心チューブにサンプルの小部分を転送します。 -80℃で残りを格納します。
注：予約済み試料の体積は、ステップ6.1で使用されるBCAアッセイに依存して、変化します。このサンプルは、即時の分析のために湿った氷の上に格納されるか、または-80℃で凍結されなければなりません。
6.ビシンコニン酸（BCA）アッセイ
- 各試料の残留ペプチド濃度を決定するために、ステップ5.4からのサンプルを用いて、キットの製造業者によって推奨されるようにBCAアッセイを行います。
7. LC-MS
- ステップ1.4で調製したLC-MS溶媒B、75μLで抽出した黄色ブドウ球菌の75μLを混合します。
- 混合し5分間13,000×gで回転させる渦。
- 液体クロマトグラフィー（LC）バイアルに上清の100μLを置き、それをキャップ。空気の泡が試料中に閉じ込められていないことを確認してください。
- LC-MSオートサンプラーにLCバイアルをロードし、ソフトウェアで実行されているリストを編集「オフラインワークリストエディタ。」
- "サンプル名"を記入（ 例えば、野生型-1）、 "サンプル位置"（ 例えば、P1-A1）、 "メソッド"（ 例えば、ギACID-負の方法）、および"データファイル"（ 例えば、野生型-1）の列。ボタン「保存ワークリスト」ボタンをクリックしてください。 「質量分析データ収集ワークステーション」のソフトウェアと入力以前に保存されたワークリストを開きます。連続LC-MS測定を開始するには、「スタートワークリストファイル名を指定して実行」ボタンをクリックしてください。
- 列上のサンプルを分離し、フライト（TOF）スペクトロメータ、およびLCシステムと結合TOF分析計の時間に列をリンクします。次のように移動相勾配を使用する：0-2分、85％溶媒Bを、 3~5分、80％溶媒B。 6~7分、75％溶媒B。 8~9分、70％溶媒B。 10から11.1分、50％溶媒B。 11.1から14分、20％溶媒B。及び14.1から24分、5％溶媒B。 85％溶媒Bで10分間の再平衡期間と0.4 mLの分-1の流量で終わります。
- アイソクラティックポンプを用いて、同時質量軸の較正を可能にするために実行して基準質量溶液を注入します。
注：この手順標準TOF分析計のマニュアルに基づいています。- リアルタイムキャリブレーションを実行するために、基準質量液として酢酸D4及びヘキサキス（1H、1H、3H-テトラフルオロ）ホスファジンの混合物を使用します。分-1注入用の2.5ミリリットルの流量でアイソクラティックポンプを使用します。
イオン数の8バッチ修正
- （1複製、 例えば、野生型）バッチ補正のための基準サンプルとして機能する任意のサンプルを指します。
- 基準試料内の全ての代謝産物のためのイオンカウントの合計を計算します。すべてのサンプルについてこの計算を繰り返します。
- 比を生成するために、参照試料の総イオンカウントすることにより、各試料の総イオンカウント数を分割します。
- 各代謝産物のバッチ補正イオンカウントを得るために、サンプル/基準比率によってサンプル内の各代謝産物のためのイオンカウントを分けます。
9.ペプチドの正規化
- D各代謝産物の正規化値を生成するためにステップ6でBCAアッセイを用いて決定したペプチド濃度によって、ステップ8で得られた各サンプルのバッチ補正イオンカウント値をivide。
注：ステップ9.1で得られた各代謝産物の正規化、バッチバッチ補正イオンカウントは直接株の間で比較し、統計的分析（-test 例えば、マンホイットニーU）に供することができます。あるいは、いずれかの治療または遺伝的背景により変化しないことが知られている代謝産物は、代謝産物の分解による変化を検出するための正規化として使用することができます。抽出緩衝液中のL-ノルバリン又はgluraric酸の既知量の包含は、試料処理34中の損失を補正するために使用することができます。
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Representative Results
私たちは、豊かな、複雑な培地中でのin vitro成長中の黄色ブドウ球菌における細胞内代謝物プールを分析しました。原理の証明として、我々は比較メチシリン感受性黄色ブドウ球菌骨髄炎の間の代謝産物プロファイルはUAMS-1（野生型[WT]）及びグローバル転写調節コーディ（Δ コーディ ）26を欠く同系株を単離します。プロトコルのステップ2に記載したように、定常状態は、WT及びコーディ株の指数培養物を、TSB培地において確立しました。野生型及びコーディ -null変異体培養物の成長挙動は、成長収率及び速度でのみ軽度の差（ 図1）を用いて、類似していました。 RNA-配列およびマイクロアレイ技術を使用して、我々などがアスパラギン酸に由来するアミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする複数の遺伝子がコーディ -null変異体Cに脱抑制されたことを明らかにしましたTSB中のインビトロ増殖（ 図2）25、27、30の間にWT細胞にompared。また、brnQ1とbrnQ2、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼのコードは、codY-ヌル変異体30、35で過剰発現されています。
この経路に関連した代謝産物の定常状態の細胞内存在量がヌル変異体に変更される程度を決定するために、我々は、LC-MSベースの代謝産物プロファイリングを行いました。 WT及びcodY-ヌル突然変異細胞は、生物学的定常状態まで成長させた、プロトコルのステップ4に記載されているようにサンプリングしました。我々は（材料リストを参照してください）解析ソフトウェアパッケージを使用して、各クロマトグラフィー解決代謝物のために強度イオンのピーク面積を積分することにより、代謝物の存在量を決定しました。私たちは、差分を補正しました各試料の残留ペプチド濃度に代謝産物存在量を正規化することによってバイオマス中erences。我々はさらに、各サンプル内の全ての代謝産物の平均イオン数を計算することにより、基準値として野生型試料を用いて、サンプル間の潜在的なバッチ効果のためにこれらの値を修正しました。このアプローチは、条件にわたって代謝物の存在量のサンプル間の比較を可能にしました。所与の試料中の代謝産物間の比較は、同様に最初の標準添加法を用いて量をモル濃度をイオンカウントから正規化された代謝産物の存在量を変換することによって達成することができます。
我々は、UAMS-1およびそのcodY-ヌル変異体におけるアスパラギン酸経路における重要な中間体のレベルを比較しました。 図3に見られるような前駆体（ 例えばながら、この経路の最終産物（ 例えば、スレオニン、および（イソ） -ロイシン） は 、 コーディ -null変異細胞においてより豊富ですアスパラギン酸およびo -アセチルホモセリン）はWT細胞においてより豊富です。 BrnQの組み合わせアップレギュレーションは36パーミアーゼとILV生合成経路は、おそらく、イソロイシンおよびロイシン30の増加につながります。差が（<4倍）比較的小さいが、LC-MSベースの定量及びバッチ補正コーディによって媒介される転写の変化と一致している堅牢で統計的に有意な変化を明らかにする。
図1： 黄色ブドウ球菌 UAMS-1の増殖挙動およびTSBにおける同系コーディ -null変異体。前培養物がOD 600〜1を達成した後の時間を定常指数増殖に費やされた細胞を拡張するために、培養物を新鮮な培地に0.05の光学密度に逆希釈しました。 LC-MS代謝物分析のためのサンプルを採取しました〜0.5（矢印）の光学密度で実験培養物から。示したデータは、3つの生物学的複製物を代表するものです。
図2：アスパラギン酸に由来する選択された代謝産物の概略図。遺伝子およびその産物イタリック体で示されるアスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の合成を触媒するオペロン。 RNA-配列解析29によって決定されるようにコーディ -null変異体における転写産物量の増加は、野生型と比較して、さらに注目されます。 DHP、2,6- diaminoheptanedioate（2,6-ジアミノピメリン）。
図3：アスパラギン酸ファミリーの代謝物の存在度は、 コーディ変異体に変更されます。で選択した代謝物のlog 2倍の変更UAMS-1（WT）と比較codY-ヌル変異体が示されています。変更は、ウェント・ストレインの三の生物学的複製の平均存在量によってcodY-ヌル株の三の生物学的複製の平均存在量を割ることによって決定しました。各代謝産物のための生物学的複製物間の標準誤差は<35％でした。点線は、log 2 1.5倍の変化、この実験で使用したカットオフを示しています。
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Discussion
すべての小分子代謝物は、中央代謝経路におけるそれらの共通の起源を介して相互に接続されています。指数関数的成長の間、細菌細胞は、特定の条件の下での生理的状態のスナップショットを提供し、生物学的および代謝定常状態です。コーディはILVとGTPに応答することによって栄養素充足を監視します。 ILVとGTPプール降下として、コーディ活性は、おそらく徐々に栄養枯渇30を増加させることに適合するように、その標的遺伝子の発現を調節、低減されます。コーディ欠損株はILVとGTPが環境から除去されたかのように振る舞うだけコーディ熟練株に成長挙動の相対的で非常に軽度の差（ 図1）を示します。したがって、これらの株における代謝物の定常状態プールの比較は栄養素が不足しているとき、代謝が再設定される範囲を明らかにするユニークな機会を提供してくれます。これは、OUことに留意すべきですコーディ活性が最大になるときR実験は（ILVとGTPが指数期に最も豊富に存在する）代謝物の存在量を調査します。しかし、他の質問は、成長の他の段階で対処することができます。例えば、対数期において、トリカルボン酸（TCA）サイクルの活性は非常に低いです。事後対数期に、TCAサイクルが36活性化されます。代謝産物の存在量を含む表現型の数は、この活性化に依存します。また、AGRクオラムセンシングシステムは、固定相37の指数増殖から移行中にアクティブになります。ポスト指数または固定相にサンプルを収集することは、これらのトピックに取り組む研究のためのより適切かもしれません。関係なく、サンプルが採取されるときの、定常状態が乱されるときに生じる代謝産物のターンオーバーを最小限に抑えるために、収集洗浄、および（S内に、IE）できるだけ迅速に抽出バッファーにサンプルを転送することが重要です。
ここで説明するクロマトグラフ法は、極性および非極性アミノ酸と中心炭素代謝化合物の分析に特に適しています。しかし、追加のクラス固有のメソッドをクロマトグラフィーこの方法で解決しない、目的の特定の化合物を定量するために使用することができます。添加剤は、イソロイシンおよびロイシン38の解像度を可能にするために報告されているように、例えば、酢酸とギ酸を置換することによって、クロマトグラフィーの移動相のpHを変化させます。抽出手順を変更すると、同様に、ここで使用される抽出方法に敏感な不安定な代謝物の回収および定量化を可能にすることができます。例えば、ジスルフィド結合形成を起こしやすいシステインなどの化合物が潜在的にエルマン試薬39での誘導体化後に回収することができます。 窒素ガスでスパージング抽出バッファは、NAD +およびNADHを保存することができます比率は、細胞の酸化還元状態40の評価を可能にします。ヌクレオシド三リン酸は、塩基性またはバッファなしのソリューションで分解することができます。抽出溶液を酸性化することは、これらの分子41の回収率を向上させることができます。
指数関数的に増殖する細菌培養では、一以上の栄養素の欠乏は、成長の後に指数関数と固定相への移行につながります。これらの成長期は、異なる代謝状態42によって特徴付けられます。ケモスタットベースの培養は、遺伝子発現および生理学的研究のための事実上の連続生物学的定常状態の理想を生成します。しかし、この方法は、特殊な装置を必要とする技術的要求であり、そして栄養制限が流下細胞の安定な集団を維持するために課されることを必要とします。後者の要件は、変数または再以外の要因による転写および生理学的摂動を引き起こしますgulatorは分析されています。体積比（につながる可能性酸素レベルのわずかな変化：私達のフラスコに基づく結果は定常状態ではなく、二相間の遷移指数関数的に増殖する細胞の代表であることを保証するために、我々は一貫フラスコ二重バック希釈戦略を採用します改変された代謝36、42）。彼らは0.5〜のOD 600に達したときに一晩培養の初期希釈した後、これらの細胞は、ODの600〜0.05に戻って希釈し、OD 600〜1.0に成長し、収穫されています。そのような方法はまた、安定なRNAを含む一晩の成長中に蓄積する細胞質分子を希釈します。実際、RNAIII、AGRクオラムセンシング系のエフェクターは、そのようなRNAであり、コーディ25、43、44と同一の遺伝子標的の一部の発現を調節します。累計RNAIIIはコーディ-DEPをマスクすることができますendent調節、コーディ（シャルマとBrinsmade、未発表結果）によって抑制または刺激の強さの過小評価につながります。
この分析の1つの制限は、それが細胞内代謝産物存在量の瞬間的な一瞥を提供することです。何の結論は、任意の経路を通るフラックスの変化についての結果から引き出すことはできません。例えば、検査二つの株の間でのリジンとメチオニンの存在量はcodY-ヌル株（ 図2および図 3）における生合成酵素の脱抑制にもかかわらず、変化しませんでした。 コーディ -null歪みは、実際にはより多くのリジンおよびメチオニンを生成することができるが、それらは急速に他の化合物に変換することができます。したがって、これらの分子は蓄積しません。 13 C-または15 Nで標識された炭素または窒素源を使用すると、私たちは主要な代謝接合部45を介して炭素及び窒素骨格に従うことができるようになります<SUP>、46。
我々は、 黄色ブドウ球菌、枯草菌 29における代謝物プールにおける変化、 結核菌 47、及びエンテロコッカス・フェシウム 48を解明するために記載された方法を使用しているが、この方法は、他を含む他のグラム陽性およびグラム陰性細菌にも適用することができますヒト病原体は、簡単に実験室で培養しました。実際、メタボロームおよびトランスクリプトーム情報を統合することは感染症を治療するための新しい戦略につながる可能性代謝と毒性の間に予想外の接続を、明らかにすることができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は独立賞にNIH経路（GM 099893を付与）し、教員のスタートアップ資金SRBに、だけでなく、研究プロジェクト助成（GM 042219を付与）によって部分的に資金を供給されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集および解釈、または出版のために仕事を提出するという決定には役割がありませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipmenta | |||
| DeLong Culture Flask (250 mL) | Belco | 2510-00250 | |
| Sidearm Flask, 500 mL | Pyrex | 5340 | |
| 3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
| Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
| Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
| Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
| Impact-resistant tubes, 2 mL | USA Scientific | 1420-9600 | |
| Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
| Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
| Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
| Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
| Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
| Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
| Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
| TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
| Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
| Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
| Chemical | |||
| Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
| Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
| Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1x with ultra-pure water |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
| Software | |||
| MassHunter | Agilent | G3337AA | |
| Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
| SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
| SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
| aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. | |||
References
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