对于代谢物分析基于法 - 串联液相色谱 - 质谱法金黄色葡萄球菌

Summary

在这里，我们描述了用于通过液相色谱法和质谱分析法从金黄色葡萄球菌和它们的后续分析的代谢物的提取的协议。

Abstract

在努力阻止细菌病原体，主机往往限制了营养素在感染部位的可用性。这种限制可以改变，其调控因子做出响应，调节细胞代谢关键代谢物的丰度。近年来，一些蛋白质和RNA已成为致病基因表达的重要调节器。例如，科迪蛋白响应支链氨基酸和GTP的水平并广泛保守的低G + C革兰氏阳性细菌。如金黄色葡萄球菌全球监管机构，科迪控制数十种毒性和代谢基因的表达。我们推测， 金黄色葡萄球菌使用CODY，部分地改变在努力适应宿主环境可能遇到的营养限制条件的代谢状态。这个手稿描述了使用加上质谱液相色谱法从金黄色葡萄球菌提取并分析代谢物的方法trometry，开发是为了检验这一假设的协议。该方法还强调，将确保严密性和可重复性的最佳做法，如维持生物稳态和不断充气，无需使用连续恒化培养。相对于USA200甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌分离UAMS-1亲本菌株，同基因的突变体科迪表现出从天门冬氨酸（ 例如 ，苏氨酸和异亮氨酸）衍生的氨基酸显著增加和它们的前体下降（ 例如 ，天冬氨酸和O- -acetylhomoserine ）。这些发现与RNA-SEQ分析获得的转录数据良好相关:基因在这些途径均在科迪无效突变体10和800倍之间上调。耦合转录组和代谢组的整体分析可以揭示细菌如何改变它们的代谢，当面对的环境或营养应激，提供潜在洞察的PHY与养分枯竭相关iological变化感染期间经历。这些发现可能铺平新型抗感染药物和治疗学的发展道路。

Introduction

细菌病原体必须与主机环境中的诸多挑战抗衡。除了通过免疫细胞直接攻击时，主机还吸收营养物质对细菌的生存和复制，产生营养免疫力^1，2至关重要。为了生存，这些恶劣的环境中，细菌病原体部署致病因子。其中的一些因素使得细菌逃避免疫反应;其他因素包括分泌的消化酶，如透明质酸酶，热核反应的，和脂肪酶，其可以使得细菌通过消耗组织来源的成分^3，4，5以补充缺少的营养成分。事实上，细菌已经进化出扎细胞的生理状态到生产毒力因子^6,7的调节系统^， 向上类= "外部参照"> ^{8，9，10。}

越来越多的证据指向身体科迪到作为一个关键调节器连接代谢和毒性。虽然在枯草芽孢杆菌首先发现作为二肽通透（DPP）基因¹¹的阻遏，科迪现在已知要....

Protocol

1.缓冲溶液的制备

1. 制备磷酸盐缓冲盐水;通过稀释10倍的PBS中的储备溶液，以1倍的用超纯水的最终浓度（PBS pH 7.4）中（蒸馏水和去离子）水。
2. 通过组合2毫升乙腈，2毫升甲醇，1毫升超纯H ₂ O和甲酸的19微升（0.1毫摩尔终浓度）制备骤冷溶液。
3. 制备LC-MS通过添加甲酸（0.2％[v / v]的终浓度），以超纯水溶剂A。
4. 通过添加甲酸（0.2％[v / v]的终浓度），以乙腈制备LC-MS溶剂B。
   注:所有的溶液应使用最高纯度的试剂可用（通常高效液相色谱级）来制备。解决方案应准备每次实验前新鲜的和储存到使用前的冰。

2.稳态金黄色葡萄球菌生长的建立

1. 条纹S.黄色葡萄球菌从冷冻甘油股票的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）隔离兴趣小号株。孵育在37℃下16-24小时。
2. 接种4毫升的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）或与各菌株的单菌落无菌玻璃试管孵育另一种合适的介质中。孵育倾斜（〜70°角），在37℃下16-20小时在每分钟（rpm）的60转旋转。
   注:过夜培养物使用标准方法时，包括在步骤2.2中所述，这会影响细胞生理学容易发生氧梯度。因此，我们采用了多背稀释战略，以确保生物稳态（见步骤2.4-3.2，下同）。
3. 使用分光光度计从步骤2.2在600nm（OD

Results

在一个丰富的，复杂的媒体在体外生长过程中我们分析了金黄色葡萄球菌胞内代谢库。作为原则证明，我们比较了甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌骨髓炎之间代谢特征隔离UAMS-1（野生型WT]）和缺少全局转录调节科迪（Δ 科迪 ^）26的等基因菌株。稳态中，WT和Cody菌株的指数培养物建立于TSB培养基，如在该协议的步骤2中描述。野生型和Cody -null突变体培养物的生长行为是相似的，与仅在生长产量和速率（ 图1）轻微的差异。使用RNA-Seq的和微阵列技术，我们和其他人发现，多个基因编码参与从天门冬氨酸衍生的氨基酸生物合成酶在科迪 -null突变ç去压抑在TSB中的体外生长（ 图^{2）25，27，30}

Discussion

所有小分子代谢物通过中央的代谢途径的共同起源地相互连接。在指数生长，细菌细胞在生物和代谢稳定状态下，在特定条件下提供所述生理状态的快照。 CODY通过响应ILV和GTP监视养分充分。由于ILV和GTP池下降，科迪活性很可能逐渐减少，调整它的靶基因的表达，以适应增加的养分耗竭^30。甲科迪缺陷型菌株的行为就像ILV和GTP从环境耗尽但仅表现出相对生长行为的科迪-精通应变一个非常温和的差异（ 图1）。因此，代谢物的稳态池的在这些菌株的比较为我们提供了一个独特的机会以显示于其中，当养分匮乏代谢被重新配置的程度。应当指出的是，欧[R实验研究代谢物丰度时，科迪活性最大化（ILV和GTP是最丰富的指数期）。然而，其他问题可以在发展的其他阶段加以解决。例如，在指数生长期，三羧酸（TCA）循环的活性是非常低的;在指数后阶段，TCA循环被激活^36。一些表型，包括代谢物的丰度，取决于该活化。此外，该AGR群体感应系统从指数生长至稳定期³⁷的转换期间被激活。在指数后期.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料/设备a
DeLong 培养瓶 （250 mL）	Belco	2510-00250
侧臂培养瓶，500 mL	Pyrex	5340
3 孔橡胶塞，#7	Fisher	14-131E
不锈钢过滤器支架/筛板	VWR	89428-936
培养皿，35 mm	康宁	430588	未组织培养处理
混合纤维素酯膜，0.22 &μ;m 孔径	Millipore	GSWP02500
抗冲击管，2 mL	USA Scientific	1420-9600
硅胶珠，0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 匀浆器	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	Pierce （Thermo Scientific）	23235
Cogent Diamond 氢化物 C 型色谱柱	Agilent	70000-15P-2
精确质量飞行时间 （TOF） LC-MS，6200 系列	Agilent	G6230B
Quat 泵，1290 系列	Agilent	G4204A
仓泵，1290 系列	Agilent	G4220A
阀驱动，1290 系列	Agilent	G1107A
等度泵，1290 系列	Agilent	G1310B
TCC， 1290 系列	Agilent	G1316C
进样器，1290 系列	Agilent	G4226A
温控器，1290	安捷伦	G1330B
化学
胰蛋白酶大豆肉汤	Becton Dickinson	211825
Difco 琼脂，颗粒状	Becton Dickinson	214530	固体培养基含有 1.5% [w/v] 琼脂
磷酸盐缓冲盐水 （pH 7.4） 10x	Ambion	AM9624	用超纯水乙腈
	稀释至 1x 新鲜Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
甲醇	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS;有毒
甲酸	Sigma Aldrich	94318	用于质谱分析，98%
软件
MassHunter	Agilent	G3337AA
细菌菌株	物种	菌株	基因型
SRB 337	金黄色葡萄球菌	USA200 MSSA UAMS-1	野生型
SRB 372	金黄色葡萄球菌	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY：：erm
a列出的化学品和材料特定于所述方法，不包括标准实验室化学品或用品。