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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Abstract

Em um esforço para frustrar patógenos bacterianos, os anfitriões muitas vezes limitam a disponibilidade de nutrientes no local da infecção. Esta limitação pode alterar as abundâncias de metabólitos chave para os quais fatores regulatórios respondem, ajustando o metabolismo celular. Nos últimos anos, um número de proteínas e de ARN surgiram como importantes reguladores da expressão de genes de virulência. Por exemplo, a proteína Cody responde a níveis de aminoácidos de cadeia ramificada e de GTP e é amplamente conservada em baixo G + C bactérias Gram-positivas. Como um regulador global em Staphylococcus aureus, Cody controla a expressão de dúzias de genes de virulência e metabólicas. Nossa hipótese é que S. aureus usa Cody, em parte, para alterar seu estado metabólico em um esforço para se adaptar às condições de limitação de nutrientes potencialmente encontrados no ambiente de host. Este manuscrito descreve um método para a extracção e análise de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massatrometry, um protocolo que foi desenvolvido para testar esta hipótese. O método também destaca as melhores práticas que irão garantir rigor e reprodutibilidade, tais como manter o estado estacionário biológico e aeração constante sem o uso de culturas quimiostato contínuas. Em relação aos USA200 sensível à meticilina S. aureus isolar UAMS-1 estirpe parental, o mutante isogico Cody exibiram aumentos significativos na aminoácidos derivados a partir de aspartato (por exemplo, treonina e isoleucina) e diminui em seus precursores (por exemplo, aspartato e O -acetylhomoserine ). Estes resultados correlacionam-se bem com os dados obtidos com análise de transcrição de ARN-seguintes: os genes nestas vias foram supra-regulados entre 10 e 800 vezes no mutante nulo Cody. Acoplamento análises globais do transcriptoma e metaboloma pode revelar como as bactérias alterar o seu metabolismo, quando confrontado com o estresse ambiental ou nutricional, proporcionando potencial visão sobre as physmudanças iological associados com esgotamento de nutrientes experimentado durante a infecção. Tais descobertas podem abrir o caminho para o desenvolvimento de novos anti-infecciosos e terapêutica.

Introduction

patógenos bacterianos devem lidar com muitos desafios dentro do ambiente de host. Além de ataque directo por células do sistema imunológico, o hospedeiro também sequestra nutrientes essenciais para a sobrevivência das bactérias e a replicação, gerando imunidade nutricional 1, 2. Para sobreviver nestes ambientes hostis, patógenos bacterianos implantar fatores de virulência. Alguns destes factores de permitir que as bactérias para evadir a resposta imune; Outros factores incluem segregada enzimas digestivas, tais como hialuronidase, termonuclease, e lipases, que podem permitir que as bactérias para reabastecer nutrientes em falta por consumir constituintes derivadas de tecido 3, 4, 5. Com efeito, as bactérias têm evoluído sistemas reguladores que ligam o estado fisiológico da célula para a produção de factores de virulência 6, 7, -se class = "xref"> 8, 9, 10.

Um crescente corpo de evidências aponta para Cody como um regulador crítico que liga o metabolismo e virulência. Embora descoberto pela primeira vez em Bacillus subtilis como um repressor do gene dipéptido permease (dpp) 11, Cody é agora conhecido por ser produzido por quase todas as bactérias em G + C Gram-positivos baixos 12, 13 e regula dezenas de genes envolvidos em carbono e metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19 de azoto. Em espécies patogénicas, Cody também controla a expressão de alguns dos mais importantes genes de virulência de 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody é activada como uma proteína de ligação de ADN por duas classes de ligandos: aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA, isoleucina, leucina, e valina [ILV]) e GTP . Quando estes nutrientes são abundante, Cody reprime (ou em alguns casos, estimula) a transcrição. Como estes nutrientes tornam-se limitadas, actividade Cody é progressivamente reduzido, o que resulta em uma resposta transcripcional graduada que re-rotas precursores por meio de várias vias metabólicas ligados ao metabolismo central 28, 29, 30.
Em tandem cromatografia luida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) é uma técnica poderosa que pode identificar e quantificar com precisão pequenas moléculas metabolitos intracelulares 31. Quando emparelhado com transcanálise riptome (por exemplo, ARN-SEQ), este fluxo de trabalho analítico pode fornecer informações sobre as alterações fisiológicas que ocorrem em resposta ao stress ambiental ou nutricional. Aqui, apresentam-se um método para a extracção de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus e subsequente análise por meio de LC-MS. Esta abordagem tem sido usada para demonstrar os efeitos pleiotrópicos das Cody sobre S. aureus fisiologia.

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Protocol

1. Preparação de Soluções Tampão

  1. Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) por diluição de uma solução de reserva de 10x PBS para uma concentração final de 1x com água ultrapura (desionizada destilada e).
  2. Preparar a solução de têmpera através da combinação de 2 mL de acetonitrilo, 2 mL de metanol, 1 mL de H2O ultra-pura, e 19 uL (concentração final 0,1 mM) de ácido fórmico.
  3. Prepare LC-MS solvente A pela adição de ácido fórmico (0,2% [v / v] concentração final) de água ultrapura.
  4. Prepare LC-MS solvente B por adição de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentração final) a acetonitrilo.
    Nota: Todas as soluções devem ser preparadas utilizando os reagentes de maior grau de pureza disponível (geralmente de alto desempenho de grau de cromatografia luida). Soluções deve ser preparada fresca antes de cada experiência e armazenados em gelo antes do uso.

2. Estabelecimento de estado estacionário S. aureus Crescimento

  1. Streak S. aureus estirpes de interesse para o isolamento em agar de soja tríptica (TSA) a partir de um stock de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h.
  2. Inocular 4 ml de caldo tríptico de soja (TSB) ou outro meio adequado de incubação em tubos de vidro estéreis, com colónias únicas de cada estirpe. Incubar inclinada (~ 70 ° de ângulo), com rotação a 60 rotações por minuto (rpm) a 37 ° C durante 16-20 h.
    NOTA: Culturas durante a noite são propensos a gradientes de oxigénio quando são usados ​​métodos convencionais, incluindo os descritos na etapa 2.2, que afectam a fisiologia celular. Assim, nós empregamos uma estratégia de múltiplos back-diluição para garantir estado de equilíbrio biológico (veja as etapas 2,4-3,2, abaixo).
  3. Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica das culturas a partir do passo 2.2 a 600 nm (OD 600). Use meio estéril como uma referência óptica (em branco). Dilui-se estas células para uma DO600 de 0,05 em 50 ml de meio TSB estil (pré-aquecido a 37 ° C) em separado, 250 mL DeLong frascos.
  4. incuBATE as culturas a 37 ° C em um banho de água com agitação a 280 rpm.
  5. Cada 30 minutos, tomar OD 600 medições; como as densidades ópticas aumentar, pode tornar-se necessário diluir as culturas com TSB para que permaneçam dentro do intervalo linear de absorvância do espectrómetro.
  6. Quando as culturas a partir do passo 2.5 atingir uma OD 600 de ~ 0,8-1,0, subcultura-los em 50 ml de 37 ° C TSB para um OD 600 de 0,01-0,05 e repetir os passos 2.4 e 2.5.

Setup Coleção 3. Amostra

  1. Prepara-se uma cama de gelo seco esmagado num recipiente apropriado (por exemplo, um prato de vidro, balde de gelo, ou mais frio).
  2. À medida que as densidades ópticas das culturas aproximar do ponto de colheita desejada, adicionar 1 mL de uma solução não tratada para um prato de Petri 35 mm, e pré-arrefecer em gelo seco para têmpera ≥5 min.
    NOTA: O "ponto de colheita desejada" irá variar dependendo objetivos experimentais. Por exemplo, se alguém fosse examinar metabolites durante o crescimento aeróbico, os principais indicadores desse estado incluem excreção de etilo e re-assimilação do acetato de durante a fase de crescimento exponencial pós-32, 33. Geralmente, este ponto deve estar dentro de uma fase de crescimento específico (por exemplo, fase exponencial). Os 600 valores de DO específicos associados com esta fase pode variar entre diferentes estirpes bacterianas e meios de crescimento.
  3. Coloque uma frita de filtro de aço inoxidável (pré-arrefecido a -20 ° C) em uma rolha de borracha e colocá-la no topo de um frasco de vácuo ligada a uma câmara de vácuo ou bomba de vácuo.
  4. Aplicar o vácuo e colocar uma membrana de éster de celulose misturados (0,22 de tamanho de poro) no topo.
    NOTA: É importante a utilização de um filtro com um diâmetro igual ao da frita e para centrar correctamente este filtro para garantir que a amostra é retirada através do filtro, em vez de ao longo da borda. Molhar a membrana com gelo-frio, H2O esterilizada pode ajudarcom o posicionamento da membrana.

4. Colheita de Amostra

  1. A uma DO600 de ~ 0,4-0,5, utilizar uma pipeta serológica para remover 13 ml de cultura a partir do frasco e para aplicar a amostra ao filtro.
  2. Depois de toda a amostra foi filtrada, lava-se imediatamente o filtro com ≥5 mL de PBS gelado para lavar metabolitos associados a médias.
  3. Desligar o vácuo e usar um par de pinças estéreis para remover o filtro de frita. Inverter o filtro (no lado da célula para baixo) para a solução de paragem pré-gelada.
    NOTA: É importante realizar os passos acima rapidamente (isto é, dentro de segundos) e, assim que o líquido tiver sido removida para assegurar a rápida extinção das células, prendendo actividade metabólica.
  4. Incubar o filtro numa solução de arrefecimento rápido em gelo seco para ≥20 min.
  5. Usando pinças estéreis, inverter o filtro (-lado célula para cima) na placa de petri e usar uma micropipeta para lavar as células fora de tele membrana na solução de extinção.
  6. Re-suspendeu as células em solução de paragem e, em seguida, transferir a suspensão de células para um tubo resistente a impacto 2 mL estéril contendo ~ 100 mL de esferas de sílica de 0,1 mm. Conserva-se a em gelo seco ou a -80 ° C.

5. Metabolito Extraction

  1. Descongelar amostras em gelo húmido e perturbar as células em um homogeneizador com quatro rajadas s 30 a 6.000 rpm, com períodos de arrefecimento 2 min em gelo seco entre os ciclos.
  2. Esclarecer os lisados durante 15 minutos numa pré-arrefecido, de microcentruga refrigerada a velocidade máxima (isto é, 18,213 xg à ≤4 ° C).
  3. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
  4. Usando uma micropipeta, transferir uma pequena parte da amostra para um tubo de microcentrífuga para a quantificação do teor de péptido residual no passo 6; armazenar o restante à temperatura de -80 ° C.
    NOTA: O volume da amostra reservados varia, dependendo do ensaio BCA usado no passo 6.1. esteamostra deve ser armazenada em gelo húmido para análise imediata ou congeladas a -80 ° C.

6. ácido bicinconínico (BCA) Ensaio

  1. Realizar um ensaio de BCA tal como recomendado pelo fabricante do kit, utilizando amostras a partir do passo 5.4 para determinar a concentração de péptido residual para cada amostra.

7. LC-MS

  1. Misturar 75 mL de S. aureus extracto com 75 ul de LC-MS solvente B, preparado no passo 1.4.
  2. Vortex para misturar e centrifugação a 13000 xg durante 5 min.
  3. Colocar 100 uL de sobrenadante para uma cromatografia líquida (LC) frasco e cap. Garantir que nenhuma bolha de ar estão presos na amostra.
  4. Coloque os frascos LC para o amostrador automático LC-MS e editar a lista de execução no software "offline Worklist Editor."
    1. Para preencher o "Nome da Amostra" (por exemplo, de tipo selvagem-1), "Amostra Posição" (por exemplo, P1-A1), "Processo" (por exemplo, fórmico Umcid-negativa Método), e (por exemplo, de tipo selvagem) 1-colunas "do ficheiro de dados". Clique no botão "Salvar Lista de trabalho". Abra o software "Mass Spectrometry Aquisição de Dados da Estação de Trabalho" e insira a lista de trabalho salva anteriormente. Clique no botão "Iniciar Lista de trabalho Executar" para iniciar a medição contínua LC-MS.
  5. Separaram-se as amostras numa coluna, ligar a coluna para um tempo de voo (TOF) espectrómetro, e acoplar o espectrómetro TOF com o sistema de LC. Utilizar um gradiente de fase móvel como se segue: 0-2 min, 85% de solvente B; 3-5 min, 80% de solvente B; 6-7 min, 75% de solvente B; 8-9 minutos, 70% de solvente B; 10-11,1 min, 50% de solvente B; 11,1-14 min, 20% de solvente B; e 14,1-24 min, 5% de solvente B; acabar com um período de re-equilíbrio de 10 min a 85% de solvente B e uma velocidade de fluxo de 0,4 ml min -1.
  6. Usando uma bomba isocrática, infundir uma solução de massa de referência com o correr para permitir a calibração do eixo massa simultânea.
    NOTA: Este passoé baseado no manual de TOF espectrômetro padrão.
    1. Utilizar a mistura de ácido acético D4 e hexaquis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) fosfazina como a solução de massa de referência para realizar a calibração em tempo real. Utilizar a bomba isocrática com o caudal de 2,5 ml min -1 para a infusão.

8. Lote Correcção de Contagem de iões

  1. Designa qualquer exemplo para servir como uma amostra de referência para o lote de correcção (por exemplo, de tipo selvagem, replicar 1).
  2. Calcular a soma das contagens de iões para todos os metabolitos dentro da amostra de referência. Repita este cálculo para todas as amostras.
  3. Dividir a contagem total de iões de cada amostra por contagem do total de iões da amostra de referência para gerar um rácio.
  4. Dividir a contagem de iões para cada metabolito dentro de uma amostra pela relao entre a amostra / de referência para se obter uma contagem de iões corrigido-lote para cada metabolito.

9. Péptido Normalização

  1. Divide os valores de contagem de iões corrigido-lote para cada amostra obtida no passo 8 pela concentração de péptido determinado com o ensaio BCA no passo 6, para se obter um valor normalizado para cada metabolito.
    NOTA: As normalizados, lote-batch corrigido contagens de iões para cada metabolito obtido na etapa 9.1 pode ser directamente comparada entre estirpes e sujeitos a análise estatística (por exemplo, um U de Mann-Whitney -teste). Alternativamente, um metabolito conhecido por ser inalterada quer pelo tratamento ou fundo genético pode ser usado como um normalizador para detectar mudanças devido ao metabolito decomposição. A inclusão de uma quantidade conhecida de L-norvalina ou ácido gluraric no tampão de extracção pode ser utilizado para corrigir a perda durante o processamento da amostra 34.

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Representative Results

Analisamos piscinas metabolitos intracelulares em S. aureus durante crescimento in vitro num meio rico, complexo. Como prova de princípio, foram comparados os perfis de metabolitos entre o S. aureus sensível à meticilina osteomielite isolar UAMS-1 (tipo selvagem [WT]) e uma estirpe isogénica sem o regulador transcricional mundial Cody (Δ Cody) 26. O estado estacionário, culturas exponenciais das estirpes WT e Cody foram estabelecidas em meio TSB, tal como descrito no passo 2 do protocolo. O comportamento de crescimento do tipo selvagem e mutantes culturas Cody -null foram semelhantes, com apenas ligeiras diferenças no rendimento e taxa de crescimento (Figura 1). Usando a tecnologia de microarray de ARN-SEQ e, nós e outros revelou que vários genes que codificam para as enzimas envolvidas na biossíntese de aminoácidos derivadas a partir de aspartato foram desreprimido no Cody -null mutante compared às células WT durante crescimento in vitro em TSB (Figura 2) 25, 27, 30. Além disso, brnQ1 e brnQ2, que codificam para permeases de aminoácidos de cadeia ramificada, são sobre-expressos no codY- mutante nulo 30, 35.

Para determinar a extensão em que em estado estacionário abundâncias intracelulares de metabolitos associados com esta via são alteradas no mutante nula, que realizada perfil metabólico com base em LC-MS. WT e codY- células mutantes nulos foram cultivadas até ao estado estacionário biológica e foram amostradas, tal como descrito no passo 4 do protocolo. Nós determinamos abundâncias de metabólitos, integrando a área do pico ion intensidade para cada metabólito cromatograficamente resolvidos usando um pacote de software de análise (ver Lista de Materiais). Nós corrigido para diffrências em biomassa por normalizar as abundâncias de metabolitos para a concentração de péptido residual de cada amostra. Nós corrigida ainda mais esses valores para os potenciais efeitos de lote entre as amostras através do cálculo da média de contagem de iões para todos os metabolitos em cada amostra e utilizando a amostra de tipo selvagem como o valor de referência. Esta abordagem permitiu comparações entre amostras de abundâncias de metabólitos em todo condições. comparações inter-metabolitos dentro de uma dada amostra pode igualmente ser conseguida convertendo primeiro abundâncias metabolito normalizados a partir das contagens de iões a molar quantidades, utilizando o método de adição de padrão.

Comparamos os níveis de intermediários chave na via de aspartato em UAMS-1 e o seu mutante nulo codY-. Como pode ser visto na Figura 3, os produtos finais desta via (por exemplo, treonina e (iso) -leucina) são mais abundantes nas células mutantes Cody -null, enquanto precursores (por exemplo,aspartato e O-acetil homoserina) são mais abundantes nas células WT. A regulao positiva combinada de BrnQ permeases 36 e a via de biossíntese ILV provavelmente conduz a aumentos de isoleucina e leucina 30. Embora as diferenças são relativamente pequeno (<4 vezes), LC-MS baseado em quantificação e correcção lote revelar alterações robustos e estatisticamente significativos que são consistentes com alterações de transcrição mediadas por Cody.

figura 1
Figura 1: comportamento de crescimento de S. aureus UAMS-1 e um mutante Cody -null isogénico em TSB. Para prolongar o tempo as células utilizadas em crescimento exponencial de estado estacionário, as culturas foram novamente diluídas para uma densidade óptica de 0,05 em meio fresco após os pré-culturas atingiram uma DO600 de ~ 1. As amostras para análise de metabolitos de LC-MS foram recolhidosa partir de culturas experimentais a uma densidade óptica de 0,5 ~ (setas). Os dados apresentados são representativos de três réplicas biológicas.

Figura 2
Figura 2: Representação esquemática de derivados de metabolitos seleccionados aspartato. Os genes e operões cujos produtos catalisar a síntese de ácidos aminados aspartato-família são indicados em itálico; o aumento na abundância transcrição em um mutante -null Cody em comparação com o tipo selvagem, tal como determinado por análise de RNA-seq 29, é também observada. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelato).

Figura 3
Figura 3: A abundância de metabolitos na família aspartato são alterados em um mutante Cody. O registo de 2 vezes de alterações de metabolitos seleccionados nocodY- mutante nula em comparação com UAMS-1 (WT) são mostrados. A alteração foi determinada dividindo a abundância média de três réplicas biológicas da estirpe nula codY- pela abundância média de três réplicas biológicas da estirpe WT. O erro padrão entre réplicas biológicas para cada metabolito era <35%. As linhas tracejadas indicam uma mudança de log 2 de 1,5 vezes, o corte utilizado nesta experiência.

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Discussion

Todos os metabolitos de pequenas moléculas são ligadas uma à outra através das suas origens comuns em vias metabólicas centrais. Durante o crescimento exponencial, as células bacterianas são em estado estacionário biológica e metabólica, fornecendo um instantâneo do estado fisiológico sob condições específicas. Cody monitora suficiência de nutrientes por responder a ILV e GTP. Como ILV e GTP piscinas gota, actividade Cody é provável progressivamente reduzido, ajustando a expressão dos seus genes-alvo para se adaptar ao aumento da depleção de nutrientes 30. Uma estirpe deficiente Cody-se comporta como se ILV e GTP está empobrecido a partir do ambiente, mas apenas exibe uma diferença muito ligeira no comportamento de crescimento em relação à estirpe Cody-proficientes (Figura 1). Assim, a comparação de piscinas de estado estacionário de metabólitos nestas cepas nos proporciona uma oportunidade única para revelar a extensão em que o metabolismo é reconfigurado quando os nutrientes são escassos. Deve-se notar que UOr experiências investigar abundâncias metabolito, quando a actividade Cody é maximizada (ILV e GTP são mais abundantes na fase exponencial). No entanto, outras questões podem ser abordadas em outras fases de crescimento. Por exemplo, em fase exponencial, ácido tricarboxílico actividade do ciclo (TCA) é muito baixo; em fase de pós-exponencial, o ciclo de TCA 36 é activado. Um número de fenótipos, incluindo abundâncias metabolitos, são dependentes esta activação. Além disso, o sistema de sensor de quorum de agr torna-se activo durante a transição do crescimento exponencial para a fase estacionária 37. Coleta de amostras na fase pós-exponencial ou estacionária pode ser mais relevante para os estudos que abordam estes temas. Independentemente de quando as amostras são colhidas, isto é importante para recolher, lavar, e transferir as amostras para o tampão de extracção tão rapidamente quanto possível (isto é, dentro s) para minimizar o volume de negócios metabolito que ocorre quando o estado estacionário é perturbado.

O método cromatográfico descrito aqui é especialmente adequado para analisar os aminoácidos polares e não-polares e os compostos do metabolismo de carbono central. No entanto, os métodos específicos de classe adicionais podem ser usadas para quantificar os compostos específicos de interesse não cromatograficamente resolvida por este método. Por exemplo, alterando o pH da fase móvel cromatográfica através da substituição de ácido fórmico com ácido acético, como um aditivo tem sido relatado para permitir a resolução de isoleucina e leucina 38. Modificando o processo de extracção pode permitir a recuperação de forma semelhante e quantificação de metabolitos lábeis que são sensíveis ao método de extracção utilizado aqui. Por exemplo, compostos tais como a cisteína que são propensas à formação de ligação de dissulfureto pode, potencialmente, ser recuperada na sequência de derivatização com reagente de Ellman 39. Tampões de extracção de borbulhamento com azoto gasoso pode preservar NAD + e NADHíndices, permitindo uma avaliação do estado redox celular 40. trifosfatos de nucleósidos pode se decompor em soluções básicas ou sem buffer; acidificação da solução de extracção, pode melhorar a recuperação dessas moléculas 41.

Em uma cultura de bactérias em crescimento exponencial, a depleção de uma ou mais nutrientes leva à transição para as fases pós-exponencial e estacionária de crescimento. Estas fases de crescimento são caracterizadas por estados metabólicos distintas 42. culturas baseadas em quimiostato gerar um biológica estável ideal estado praticamente contínuo para a expressão do gene e estudos fisiológicos. No entanto, o método requer equipamento especializado, é tecnicamente exigente, e que necessita de uma limitao de nutrientes ser aplicada para manter uma população estável de células sob fluxo. Este último requisito provoca perturbações da transcrição e fisiológicas, devido a outros do que a variável ou re factoresgulator sendo analisado. Para assegurar que os nossos resultados baseados em balão são representativas de células em crescimento exponencial em estado estacionário e não de uma transição entre duas fases, que empregam uma estratégia de diluição dupla volta com um balão consistente: proporção em volume (ligeiras modificações nos níveis de oxigénio podem levar a metabolismo alterado 36, 42). Depois de uma diluição inicial de culturas de uma noite, as células são crescidas até uma DO600 de ~ 1,0, volta-diluído para uma DO 600 de 0,05 ~, e colhida quando atingem uma DO 600 de ~ 0,5. Um tal método também dilui moléculas citoplásmicas que se acumulam durante o crescimento durante a noite, incluindo ARN estáveis. Com efeito, RNAIII, o efector do sistema sensorial de quorum de agr, é um tal ARN e regula a expressão de alguns dos genes alvos mesmos como Cody 25, 43, 44. ARNIII acumulada pode mascarar Cody-depregulação endent, conduzindo a uma sub-estimativa da força de repressão ou de estimulação por Cody (Sharma e Brinsmade, resultados não publicados).

Uma limitação desta análise é que ela fornece uma visão instantânea de abundâncias metabolitos dentro da célula; não é possível tirar conclusões a partir dos resultados em relação a mudanças no fluxo através de qualquer via. Por exemplo, as abundâncias de lisina e metionina entre as duas estirpes examinadas não se alterou, apesar de-repressão de enzimas biossintéticas na estirpe nula codY- (Figuras 2 e 3). A estirpe -null Cody pode, de facto, estar a gerar mais lisina e metionina, mas que pode ser rapidamente convertido em outros compostos; assim, estas moléculas não se acumulam. Fontes de carbono ou azoto, utilizando 13C ou 15N marcados permitiria a seguir esqueletos de carbono e azoto através de junções principais metabólicas 45 <sup>, 46.

Nós temos utilizado o método descrito para a elucidação das alterações em piscinas de metabolito em S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47, e Enterococcus faecium 48, mas o método pode ser aplicado a outras bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo outros agentes patogénicos humanos facilmente cultivada em laboratório. Na verdade, integrando informações metabolômica e transcriptomic pode revelar conexões inesperadas entre o metabolismo e virulência, o que poderia levar a novas estratégias para tratar infecções.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH Pathway to Prêmio Independência (conceder GM 099.893) e os fundos de arranque faculdade de SRB, bem como um projeto de Grant Research (conceder GM 042.219). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de enviar o trabalho para publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em
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Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

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