Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Her beskriver vi en protokoll for utvinning av metabolitter fra Staphylococcus aureus og deres påfølgende analyse via væske-kromatografi og massespektrometri.

Abstract

I et forsøk på å hindre bakterielle patogener, verter ofte begrense tilgjengeligheten av næringsstoffer i stedet for infeksjon. Denne begrensningen kan endre Forekomsten av viktige metabolitter som regulatoriske forhold reagerer, justere cellenes stoffskifte. I de senere år har en rekke proteiner og RNA seg å være viktige regulatorer av virulens genekspresjon. For eksempel, svarer Cody proteinet til nivåer av forgrenede aminosyrer og GTP og er mye konservert i lave G + C grampositive bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, styrer Cody ekspresjonen av dusinvis av virulens og metabolske gener. Vi hypotese at S. aureus bruker Cody, delvis for å endre dets metabolske tilstand i et forsøk på å tilpasse seg til næringsbegrensende betingelser potensielt påtreffes i vertsmiljøet. Dette manuskriptet beskriver en metode for ekstrahering og analyse av metabolitter fra S. aureus ved å bruke væskekromatografi kombinert med massespekttrometry, en protokoll som ble utviklet for å teste denne hypotesen. Fremgangsmåten fremhever også fremgangsmåter som vil sikre rigor og reproduserbarhet, som for eksempel å opprettholde biologisk stabil og konstant lufting uten bruk av kontinuerlige kjemostat kulturer. I forhold til de USA200 meticillinfølsom S. aureus isolere UAMS-1 foreldrestammen, det isogen Cody mutant viste betydelige økninger i aminosyrer avledet fra aspartat (for eksempel treonin og isoleucin) og minskning av deres forløpere (for eksempel aspartat og O -acetylhomoserine ). Disse resultatene korrelerer godt med transkripsjonelle data oppnådd med RNA-seq analyse: gener i disse banene ble oppregulert mellom 10- og 800-fold i Cody null mutant. Kobling globale analyser av transkriptom og metabolomet kan avsløre hvordan bakterier endre deres stoffskifte når møtt med miljø eller ernæringsmessig stress, og gir potensial innsikt i Physiological forandringer assosiert med næringsutarming oppleves under infeksjon. Slike funn kan bane vei for utvikling av nye antiinfektiva og terapi.

Introduction

Bakterielle patogener må stri med mange utfordringer innen verten miljøet. I tillegg til direkte angrep av celler i immunsystemet til verten sequesters også næringsstoffer essensielle for bakterieoverlevelse og replikasjon, genererer ernærings immunitet 1, 2. For å overleve disse fiendtlige miljøer, bakterielle patogener distribuere virulensfaktorer. Noen av disse faktorene tillater bakterier å unngå immunrespons; Andre faktorer er utskilt fordøyelsesenzymer, slik som hyaluronidase, thermonuclease, og lipase, noe som kan gjøre det mulig at bakterier for å etterfylle manglende næringsstoffer ved å forbruke vev-avledede komponenter 3, 4, 5. Faktisk har bakterier utviklet reguleringssystemer som binder den fysiologiske tilstanden til cellen for produksjon av virulensfaktorer 6, 7, opp class = "ekstern referanse"> 8, 9, 10.

En økende mengde bevis peker på Cody som en viktig regulator som forbinder metabolisme og virulens. Selv om det først oppdaget i Bacillus subtilis som en undertrykker av dipeptidet permease (DPP) gen 11, Cody nå kjent for å bli produsert av nesten alle de lave G + C Gram-positive bakterier 12, 13 og regulerer mange gener som er involvert i karbon og nitrogenmetabolismen 14, 15, 16, 17, 18, 19. I patogene arter, Cody også styrer ekspresjonen av noen av de viktigste virulensgener 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody aktiveres som et DNA-bindende protein ved to klasser av ligander: forgrenede aminosyrer (BCAA, isoleucin, leucin og valin [ILV]) og GTP . Når disse næringsstoffene er rikelig, undertrykker Cody (eller i noen tilfeller, stimulerer) transkripsjon. som disse næringsstoffene blir begrenset, Cody aktivitet gradvis redusert, noe som resulterer i en gradert transkripsjonen respons på at en overveier forløpere gjennom forskjellige metabolske veier som er koblet til det sentrale metabolisme 28, 29, 30.
Tandem væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) er en kraftfull teknikk som nøyaktig kan identifisere og kvantifisere lavmolekylære metabolitter intracellulære 31. Da sammen med transcriptome analyse (for eksempel RNA-Seq), denne analytiske arbeidsflyt kan gi innsikt i de fysiologiske endringer som oppstår i respons til omgivende eller ernæringsmessige belastning. Her presenterer vi en fremgangsmåte for metabolitt ekstraksjon fra Staphylococcus aureus-celler og etterfølgende analyse via LC-MS. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å demonstrere en mitogen effekt av Cody på S. aureus fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av buffer- oppløsninger

  1. Forbered fosfat-bufret saltvann (PBS; pH 7,4) ved fortynning av en stamløsning av 10 x PBS til en sluttkonsentrasjon på 1 x med ultrarent (destillert og deionisert) vann.
  2. Fremstill bråkjøling oppløsning ved å kombinere 2 ml av acetonitril, 2 ml metanol, 1 ml ultrarent H2O, og 19 ul (0,1 mM sluttkonsentrasjon) maursyre.
  3. Forbered LC-MS løsningsmiddel A ved tilsetning av maursyre (0,2% [v / v] sluttkonsentrasjon) til ultrarent vann.
  4. Forbered LC-MS løsningsmiddel B ved tilsetning av maursyre (0,2% [v / v] sluttkonsentrasjon) til acetonitril.
    NOTE: Alle oppløsninger bør fremstilles ved anvendelse av høyeste renhet reagenser tilgjengelig (vanligvis væskekromatografi grade). Løsninger bør være forberedt frisk før hvert forsøk og lagret på is før bruk.

2. Etablering av steady-state S. aureus Vekst

  1. Streak S. aureus stammer av interesse for isolering på tryptisk soya-agar (TSA) fra en frossen glyserol-stamme. Inkuber ved 37 ° C i 16-24 timer.
  2. Inokulere 4 ml tryptisk soyamedium (TSB) eller et annet egnet medium i sterile glass inkubasjonsrørene med enkle kolonier av hver stamme. Inkuber tilbøyelig (~ 70 ° vinkel) med rotasjon ved 60 omdreininger pr minutt (rpm) ved 37 ° C i 16-20 timer.
    MERK: Over natten kulturer er utsatt for oksygen gradienter ved bruk av standard metoder, inkludert de som er beskrevet i trinn 2.2, som påvirker cellulær fysiologi. Således har vi et multiplum tilbake-fortynning strategi for å sikre biologisk stabil tilstand (se trinn 2,4-3,2, nedenfor).
  3. Bruke et spektrofotometer for å måle den optiske tetthet av kulturene fra trinn 2,2 ved 600 nm (OD 600). Bruk sterilt medium som en optisk referanse (blank). Fortynn disse cellene til en OD 600 på 0,05 i 50 ml sterilt TSB-medium (forvarmet til 37 ° C) i separate, 250 mL DeLong kolber.
  4. Incubate kulturene ved 37 ° C i et vannbad med rysting ved 280 rpm.
  5. Hvert 30 min, ta OD 600 målinger; som de optiske tettheter øker, kan det bli nødvendig å fortynne kulturene med TSB slik at de forblir innenfor det lineære absorbans spekter av spektrofotometeret.
  6. Når kulturer fra trinn 2.5 oppnår en OD600 på 0,8-1,0 ~, subkultur dem inn i 50 ml 37 ° C TSB til en OD600 på 0,01 til 0,05 og gjenta trinn 2.4 og 2.5.

3. Prøvetaking Setup

  1. Fremstill en seng av knust tørris i et passende kar (for eksempel glasstallerken, is bøtte, eller kjøligere).
  2. Ettersom de optiske densiteter for de kulturene nærme seg den ønskede avling punkt, tilsett 1 ml av bråkjøling løsning til en 35 mm petriskål og ubehandlet pre-kule på tørris i ≥5 min.
    MERK: "ønsket innhøsting point" vil variere avhengig av eksperimentelle mål. For eksempel, hvis en skulle undersøke metabolites under aerob vekst, viktige indikatorer på denne tilstanden innbefatter acetat utskillelse og re-assimilering av acetatet i løpet av den post-eksponensiell vekstfase 32, 33. Generelt bør dette punkt være innenfor en spesifikk veksttrinn (f.eks eksponensiell fase). De spesifikke OD-600-verdier i forbindelse med dette trinn kan variere mellom de forskjellige bakteriestammer og vekstmedia.
  3. Plassere et filter av rustfritt stål fritte (på forhånd avkjølt til -20 ° C) i en gummipropp og plassere den på toppen av en termosflaske er festet til et hus vakuum eller vakuumpumpe.
  4. Påfør vakuum og plassere en blandet celluloseestermembran (0,22 pm pore-størrelse) på toppen.
    Merk: Det er viktig å bruke et filter med en diameter lik den for den fritte og til riktig sentrere dette filteret for å sikre at prøven er trukket gjennom filteret i stedet for over kanten. Fukting membranen med iskaldt, sterilt H2O kan hjelpemed posisjonering av membranen.

4. Prøve Harvest-

  1. Ved en OD600 på 0,4-0,5 ~, bruker en serologisk pipette for å fjerne 13 ml av kulturen fra kolben og å påføre prøven til filteret.
  2. Etter at hele prøven har blitt filtrert, straks vask filteret med ≥5 ml av iskald PBS for å vaske vekk mellom forbundet metabolitter.
  3. Koble fra vakuumet og bruke et par av sterile pinsetter for å fjerne filteret fra fritten. Invertere filteret (celle-siden ned) i pre-avkjølt kjøle løsning.
    Merk: Det er viktig å utføre de ovennevnte trinn hurtig (dvs. i løpet av sekunder) og så snart væsken er blitt fjernet for å sikre hurtig bråkjøling av cellene stanse metabolsk aktivitet.
  4. Inkuber filteret i kjøle løsning på tørris i ≥20 min.
  5. Ved hjelp av sterile pinsetter, invertere filteret (cellesiden opp) i petriskål, og bruk av en mikropipette for å skylle cellene ut av than membran inn i kjøleløsning.
  6. Re-suspenderte cellene i kjøle oppløsning og deretter overføre cellesuspensjonen til en steril 2 ml slagfast rør inneholdende ~ 100 ul 0,1 mm silikakuler. Lagre denne på tørris eller ved -80 ° C.

5. Metabolitt Ekstraksjon

  1. Tine-prøver på våt is og bryte cellene i en homogenisator med fire 30 s spenningstopper ved 6000 rpm, med 2 min perioder for avkjøling på tørris mellom syklusene.
  2. Klargjøre lysatet i 15 minutter i en på forhånd avkjølt, nedkjølt mikrosentrifuge ved maksimal hastighet (dvs. 18.213 xg ved ≤4 ° C).
  3. Overfør supernatanten til en ren mikrosentrifugerør.
  4. Ved hjelp av en mikropipette, overføre en liten porsjon av prøven til et mikrosentrifugerør for kvantifisering av gjenværende peptid innhold i trinn 6; lagre resten ved -80 ° C.
    MERK: Volumet av reserverte prøve dessuten varierer, avhengig av BCA-analyse anvendt i trinn 6.1. DettePrøven må lagres på våt is for umiddelbar analyse eller frosset ved -80 ° C.

6. Bicinchoninic Acid (BCA) Assay

  1. Utføre en BCA-analyse som anbefalt av produsenten kit, anvendelse av prøver fra trinn 5.4 for å bestemme rest peptidkonsentrasjonen for hver prøve.

7. LC-MS

  1. Bland 75 ul av S. aureus ekstrakt med 75 ul av LC-MS løsningsmiddel B, fremstilt i trinn 1.4.
  2. Vortex å mikse og spinn på 13 000 xg i 5 min.
  3. Plasser 100 ul supernatant til en væskekromatografi (LC) og hetteglasset cap den. Sørg for at ingen luftbobler er fanget i prøven.
  4. Laste LC ampuller på LC-MS autosampler og redigere løpende liste i programvaren "Offline Worklist Editor".
    1. Fyll ut "Prøvenavn" (for eksempel, villtype-1), "prøveposisjon" (for eksempel, P1-A1), "Method" (for eksempel, maursyre Acid-Negativ Method), og "Data File" (f.eks villtype-1) kolonner. Klikk på knappen "Lagre arbeidsliste" -knappen. Åpne "massespektrometri Data Acquisition Workstation" software og innspill den tidligere lagrede arbeidsliste. Klikk på "Start Worklist Kjør" -knappen for å starte kontinuerlig LC-MS måling.
  5. Atskille komponentene på en kolonne, link kolonnen til en time of flight (TOF) spektrometer, og par av TOF-spektrometer med LC system. Bruke en mobilfase gradient som følger: 0-2 min, 85% løsningsmiddel B; 3-5 min, 80% løsningsmiddel B; 6-7 minutter, 75% løsningsmiddel B; 8-9 min, 70% løsningsmiddel B; 10 til 11,1 min, 50% løsningsmiddel B; 11,1 til 14 min, 20% løsningsmiddel B; og 14,1 til 24 min, 5% løsningsmiddel B; ende med en 10 min re-ekvilibrering perioden på 85% løsningsmiddel B og en strømningshastighet på 0,4 ml min-1.
  6. Ved anvendelse av et isokratisk pumpe, tilfører en referansemasseoppløsning med kjøringen for å tillate samtidig masseakse kalibrering.
    MERK: Dette trinneter basert på standard TOF spektrometer manualen.
    1. Bruk blanding av eddiksyre og D4 hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluorpropoksy) phosphazine som referansemasse løsning for å utføre sanntids kalibrering. Bruk isokratisk pumpe med en strømningshastighet på 2,5 ml min-1 for infusjonen.

8. Batch Korreksjon av Ion Tellinger

  1. Betegne enhver prøven for å tjene som en referanseprøve for batch-korreksjon (som villtype, replikere 1).
  2. Beregn summen av de ion-tellinger for alle metabolitter etter referanseprøven. Gjenta denne beregningen for alle prøvene.
  3. Dele den totale ion telling av hver prøve av den totale ion telling av referanseprøven, for å generere et forholdstall.
  4. Fordel ion antall for hver metabolitt i en prøve ved at prøven / referanse-forhold for å oppnå en batch-korrigert ion antall for hver metabolitt.

9. Peptid Normalisering

  1. Divide batch-korrigerte ion telleverdier for hver prøve oppnådd i trinn 8 av peptidkonsentrasjonen bestemt ved BCA-analyse i trinn 6, under dannelse av en normalisert verdi for hver metabolitt.
    MERK: De normaliserte, batch-batch korrigert ion Tellingene for hver metabolitt oppnådd i trinn 9.1 kan sammenlignes direkte mellom stammene og underkastet statistisk analyse (for eksempel en Mann-Whitney U-test). Alternativt ble det til en metabolitt som er kjent å være uforandret, enten ved behandling eller genetisk bakgrunn kan brukes som en normalisereren for å detektere endringer på grunn av metabolitten spaltning. Inkluderingen av en kjent mengde av L-norvalin eller gluraric syre i ekstraksjonen buffer kan anvendes for å korrigere for tap under prøvebehandling 34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har analysert intracellulære metabolitt bassenger i S. aureus i løpet av in vitro-vekst i et rikt, komplekst medium. Som bevis på prinsippet, sammenlignet vi metabolittprofiler mellom meticillinfølsom S. aureus osteomyelitt isolere UAMS-1 (villtype [WT]) og en isogen stamme som mangler den globale transcriptional regulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state, ble det eksponensielle kulturer av WT og Cody stammer etablert i TSB-medium, som beskrevet i trinn 2 av protokollen. Veksten oppførsel av villtype og mutante Cody -null kulturer var like, med bare små forskjeller i vekst utbytte og hastighet (figur 1). Ved hjelp av RNA-Seq og mikromatriser, vi og andre avslørte at flere gener som koder for enzymer som er involvert i biosyntesen av aminosyrer avledet fra aspartat ble de-undertrykt i Cody -null mutant compared til WT celler under in vitro vekst i TSB (figur 2) 25, 27, 30. Videre brnQ1 og brnQ2, som koder for forgrenede aminosyrer permeaser som er overuttrykt i de codY- null mutant 30, 35.

For å bestemme i hvilken grad steady-state intracellulære Forekomsten av metabolitter er knyttet til denne reaksjonsveien blir endret i nullmutant, utførte vi LC-MS-baserte metabolittprofilering. WT og codY- null mutante celler ble dyrket til biologisk stabil tilstand og ble prøvetatt som beskrevet i trinn 4 av protokollen. Vi har fastslått metabolitten forekomster for ved å integrere topparealet ion intensitet for hver kromatografisk løst metabolitt anvendelse av en analytisk programvarepakke (se Materialer List). Vi korrigert for differences av biomasse ved å normalisere metabolitt forekomster til den gjenværende peptidkonsentrasjon på hver prøve. Vi korrigerte videre disse verdiene for potensielle satseffekter mellom prøvene ved å beregne gjennomsnittet ion teller for alle metabolitter etter hver prøve, og ved hjelp av villtype prøve som referanseverdi. Denne tilnærmingen aktivert inter-prøve sammenligninger av metabolitt hopetall over forholdene. Inter-metabolitten sammenligninger innenfor en gitt prøve kan likeledes bli oppnådd ved først å omdanne normaliserte metabolitt Forekomsten fra ion tellinger til molare mengder ved hjelp av den metoden for standard tilsetning.

Vi har sammenlignet med nivåene av nøkkelmellomprodukter ved aspartat reaksjonsveien i UAMS-1 og dets codY- null mutant. Som vist i figur 3, til sluttproduktene ifølge denne reaksjonsvei (f.eks, treonin- og (iso) -leucin) er mer rikelig i Cody -null mutante celler, mens forløpere (f.eksaspartat og O-acetyl homoserin) er mer rikelig i WT-celler. Den kombinerte oppregulering av BrnQ permeaser 36 og ILV-biosyntetiske vei fører sannsynligvis til økninger i isoleucin og leucin 30. Selv om forskjellene er forholdsvis små (<4 ganger), LC-MS-baserte kvantifisering og batch korrigering åpenbare robuste og statistisk signifikante endringer som er forenlig med transkripsjonelle endringer mediert av Cody.

Figur 1
Figur 1: Vekst oppførsel av S. aureus UAMS-1 og en isogen Cody -null mutant i TSB. For å forlenge den tid cellene brukt i steady-state eksponentiell vekst, ble kulturene igjen fortynnet til en optisk tetthet på 0,05 i friskt medium etter at forkulturer oppnås en OD600 på ~ 1. Prøver for LC-MS-analyse ble oppsamlet metabolittfra forsøkskulturer ved en optisk tetthet på ~ 0,5 (piler). De viste data er representative for tre biologiske replikater.

Figur 2
Figur 2: Skjema av markerte metabolitter avledet fra aspartat. Gener og operoner med produkter som katalyserer syntesen av aspartat-familien aminosyrene er angitt i kursiv; økningen i transkriptet overflod i en Cody -null mutasjon sammenlignet med villtypen, som bestemt ved hjelp av RNA-seq analyse 29, er også angitt. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelatdehydrogenase).

Figur 3
Figur 3: Forekomsten av metabolitter i aspartat familien blir endret i en Cody mutant. De log 2 ganger forandringer av utvalgte metabolitter icodY- null mutanten sammenlignet med UAMS-1 (WT) er vist. Forandringen ble bestemt ved å dividere den gjennomsnittlige overflod av tre biologiske replikater av den codY- null belastning av den gjennomsnittlige overflod av tre biologiske replikater av WT-stammen. Standardfeilen mellom biologiske replikater for hver metabolitt var <35%. De stiplede linjene indikerer en log 2 1.5 ganger endring, cutoff anvendt i dette forsøk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle lavmolekylære metabolitter er forbundet med hverandre gjennom deres felles opprinnelse i sentral metabolske veier. I løpet av eksponensiell vekst, bakterieceller er ved biologisk og metabolsk stabil tilstand, noe som gir et øyeblikksbilde av den fysiologiske tilstand som under visse betingelser. Cody overvåker næringsforsyning ved å svare på ILV og GTP. Som ILV og GTP bassenger slipp, er Cody aktivitet sannsynligvis gradvis redusert, justering av ekspresjon av dens målgener for å tilpasse seg stadig næringsutarming 30. En CODY-manglende stamme oppfører seg som om ILV og GTP uttømmes fra omgivelsene, men bare viser en meget svak forskjell i vekst oppførsel i forhold til den Cody-dyktig stamme (figur 1). Således sammenligning av steady-state bassenger av metabolitter i disse stammene gir oss en unik mulighet til å avdekke hvorvidt forbrenningen rekonfigureres når næringsstoffer er mangelvare. Det bør bemerkes at our eksperimenter undersøke metabolitt abundances når Cody aktivitet er maksimert (ILV og GTP er mest rikelig i eksponensiell fase). Imidlertid kan andre spørsmål rettes i andre faser av vekst. For eksempel, er i den eksponensielle fase, er trikarboksylsyre (TCA) syklus aktivitet meget lav; i post-eksponensiell fase, blir den TCA-syklus aktivert 36. Et antall fenotyper, inklusive metabolitten forekomster, er avhengig av denne aktiveringen. I tillegg blir det agr beslutningsdyktig følersystem aktiv i løpet av overgangen fra eksponensielle vekst til stasjonær fase 37. Prøvetaking i post-eksponensiell eller stasjonær fase kan være mer relevant for undersøkelser rettet mot disse emnene. Uansett når prøvene blir høstet, er det viktig å samle inn, vaske, og overføre prøvene til utvinning buffer så raskt som mulig (dvs. innenfor e) for å minimalisere metabolitten omsetningen som oppstår når stabil tilstand er perturbert.

Den kromatografiske metode som er beskrevet her er særlig egnet til analyse av polare og ikke-polare aminosyrer og sentrale karbon metabolisme forbindelser. Imidlertid kan ytterligere klassespesifikke metoder anvendes for å kvantifisere spesifikke forbindelser av interesse som ikke kromatografisk løst ved denne metoden. For eksempel, å endre pH i den mobile fase kromatografisk ved å erstatte maursyre sammen med eddiksyre, som et additiv har blitt rapportert å muliggjøre oppløsning av isoleucin og leucin 38. Endring av ekstraksjonsprosedyren kan likeledes gjøre det mulig for gjenvinning og kvantifisering av labile metabolitter som er følsomme for utvinning metoden som brukes her. For eksempel kan forbindelser som for eksempel cystein som er utsatt for disulfidbindingsdannelse potensielt kan utvinnes etter derivatisering med Ellmans reagens 39. Spyling ekstraksjon buffere med nitrogengass kan bevare NAD + og NADHforhold, noe som muliggjør en vurdering av den cellulære redoks tilstand 40. Nukleosidtrifosfater kan dekomponeres i basiske eller bufrede oppløsninger; surgjøring av ekstraksjonsoppløsningen kan forbedre utvinningen av disse molekylene 41.

I en eksponentielt voksende bakteriekultur, uttømming av ett eller flere næringsstoffer fører til overgangen til den post-eksponentielle og stasjonære faser av vekst. Disse vekstfaser er karakterisert ved forskjellige metabolske tilstander 42. Kjemostat-baserte kulturer generere en praktisk talt kontinuerlig biologisk stabil tilstand ideell for genekspresjon og fysiologiske studier. Imidlertid krever fremgangsmåten spesialisert utstyr, er teknisk krevende og nødvendiggjør at et næringsstoff begrensning pålegges for å opprettholde en stabil populasjon av cellene under strømning. Sistnevnte krav fører til transkripsjonelle og fysiologiske forstyrrelser som skyldes en annen enn den variable eller re faktorergulator som analyseres. For å sikre at våre kolbe-baserte resultatene er representative for celler som vokser eksponentielt ved stabil tilstand og ikke av en overgang mellom to faser, benytter vi en dobbel-tilbake fortynning strategi med en konsistent kolbe: volum-forhold (små endringer i oksygennivå kan føre til endret metabolisme 36, 42). Etter en innledende fortynning av natten kulturer, er disse cellene dyrket til en OD600 på ~ 1,0, tilbake-fortynnet til en OD600 på ~ 0,05, og høstet når de når en OD600 på ~ 0,5. En slik metode fortynner også cytoplasma-molekyler som akkumuleres i løpet av natten vekst, inkludert stabile RNA. Faktisk RNAIII, effektor AGR beslutningsdyktig avlesningssystemet, er et slikt RNA og regulerer ekspresjonen av noen av de samme genmål som Cody 25, 43, 44. Akkumulert RNAIII kan maskere Cody-dependent regulering, som fører til en undervurdering av styrken av undertrykkelse eller stimulering av Cody (Sharma og Brinsmade, upubliserte resultater).

En begrensning av denne analysen er at den tilveiebringer en inst glimt av antibiotikum abundances inne i cellen; ingen konklusjoner kan trekkes fra resultatene for endringer i for fluks gjennom en gitt bane. For eksempel, de Forekomsten av lysin og metionin mellom de to stammene som ble undersøkt ble ikke endret, til tross for de-undertrykkelse av biosyntetiske enzymer i codY- null belastning (figurene 2 og 3). Den Cody -null stamme kan faktisk være å generere mer lysin og metionin, men de kan hurtig omdannes til andre forbindelser; Dermed trenger disse molekylene ikke akkumuleres. Ved hjelp av 13C- eller 15 N-merkede karbon- eller nitrogenkilder vil tillate oss å følge karbon- og nitrogen skjeletter gjennom hoved-metabolske knutepunktene 45 <sup>, 46.

Vi har brukt den beskrevne fremgangsmåten for å belyse endringer i metabolitt bassenger i S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47, og Enterococcus faecium 48, men fremgangsmåten kan anvendes på andre Gram-positive og Gram-negative bakterier, blant annet humane patogener lett dyrkes i laboratoriet. Faktisk, integrere metabolomic og transcriptomic informasjonen kan avsløre uventede forbindelser mellom metabolisme og virulens, som kan føre til nye strategier for å behandle infeksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert delvis av en NIH Pathway to Independence Award (gi GM 099 893) og fakultet oppstart midler til SRB, samt et forskningsprosjekt Grant (gi GM 042 219). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og tolkning, eller beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

Biochemistry utgave 121 mikrobiologi bakteriell fysiologi metabolomikk, Cody aminosyrer metabolitter virulens patogenese metabolisme massespektrometri væskekromatografi
Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter