Summary
Atleter absorberer flere hundrede milde traumatiske hjerneskade (mTBI) / hjernerystelse hvert år; Men konsekvensen af disse på hjernen er dårligt forstået. Derfor er en dyremodel af enkelt og gentagen mTBI, der konsekvent replikerer klinisk relevante symptomer, der giver midler til at fremme studiet af mTBI og hjernerystelse.
Abstract
Mild traumatisk hjerneskade (mTBI) kan resultere i det akutte tab af hjernefunktion, herunder en forvirringsperiode, et bevidsthedsbevidstløshed (LOC), fokal neurologiske underskud og endda amnesi. Atleter, der deltager i kontaktsporter, er i stor risiko for udsættelse for stort antal mTBI'er. Med hensyn til skadesniveauet hos en sportsudøver defineres en mTBI som en mild skade, der ikke forårsager grove patologiske forandringer, men forårsager kortvarige neurologiske underskud, som spontant løses. På trods af tidligere forsøg på at modellere mTBI hos mus og rotter har mange rapporteret om grove bivirkninger, herunder kraniebrud, intracerebral blødning, axonal skade og neuronal celledød. Her beskriver vi vores stærkt reproducerbare dyremodel af mTBI, som reproducerer klinisk relevante symptomer. Denne model bruger en specialfremstillet pneumatisk støddæmper til at levere traume med lukket hoved. Denne indvirkning er lavet under præcise hastigheds- og deformationsparametre,Skabe en pålidelig og reproducerbar model for at undersøge de mekanismer, der bidrager til virkninger af enkelt eller gentaget hjernerystelse mTBI.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er defineret som en hovedskade forårsaget af en ekstern fysisk kraft, hvilket resulterer i forstyrrelse af normal hjernefunktion. Det repræsenterer en betydelig socioøkonomisk og sundhedsmæssig byrde, med rapporten fra Center for Sygdomsbekæmpelse og Forebyggelse 2015 til Kongressen, der vurderer, at 2,5 millioner amerikanere opretholder en TBI hvert år. Dette påvirker ikke blot patientens livskvalitet, men også en ekstremt høj økonomisk omkostning for samfundet, der i øjeblikket anslås til 76,5 mia. Dollars årligt. Mængden af faktisk hjerneskader overført, og de akutte fasesymbolologier er, hvad der definerer mild, moderat og alvorlig TBI.
Mild Traumatic Brain Injury (mTBI), også kaldet hjernerystelse, tegner sig for over 70% af TBIs rapporteret hvert år 1 . Det er mest almindeligt blandt atleter, der deltager i højrisiko kontakt sport, herunder boksning og fodbold 2 . I modsætning til moderatEller alvorlige former for TBI, er de øjeblikkelige skader og symptomer forbundet med mTBI nogle gange ikke så udtalte 3 . I modsætning hertil kan de langsigtede virkninger af mTBI være lige så svækkende som dem, der ses i moderate og svære former. Dem, der lider af gentagende mTBI, har vist sig at udvikle kronisk traumatisk encephalopati (CTE) samt andre kognitive og degenerative sygdomme 4 . Derfor er det vigtigt at få en større forståelse for de mekanismer, der bidrager til de kortvarige symptomer og den samlede langvarige skade, der opstår efter mTBI.
Hos mennesker definerer definitionen af hjernerystelse som defineret af den fjerde internationale konference om hjernerystelse i sport (Zürich 2012) 5 , at skadesniveauet for sportshjernerystelse er mildt, ikke forårsager grove patologiske forandringer, men forårsager kortvarige neurologiske underskud Der er spontant løst. Faktisk er en receNt-undersøgelse undersøgte effekten af mTBI på kognitiv svækkelse hos gymnasiale fodboldspillere ved hjælp af telemetrisystemer med hovedvirkninger. Denne undersøgelse viste, hvor mange gange spillerne har haft hjelmpåvirkninger> 20 g i en enkelt sæson spænder fra et lavpunkt på 226 (gennemsnitligt 4,7 pr. Session) til en høj på 1855 (gennemsnitligt 38,6 pr. Session) 6 . De fleste af disse virkninger resulterede ikke i den kliniske diagnose af en hjernerystelse; Men tegn på funktionelle ændringer i hjernefunktionen kunne observeres ved anvendelse af fMRI 6 . Hjernen ændrer sig, fordi disse funktionelle ændringer er ukendte, og derfor er der et presserende behov for at have en pålidelig og reproducerbar model for at lette undersøgelsen af virkningerne af hjernerystelse og subkoncussive mTBI.
På trods af tidligere forsøg på at modellere mTBI hos mus og rotter 7 , rapporterer mange bivirkninger. Især er de fleste gnavermodeller begrænset i deres gentagne natur ved at bruge færre thEn påvirkning af fem mTBI'er samt negative bivirkninger, herunder intracerebral blødning, kraniebrud, alvorlig axonskader, neuronal celledød og øget dødelighed 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Her beskriver vi en musemodel af mTBI, der er tættere på den sande definition af hjernerystelse hos mennesker. Denne model recapitulerer mange af de symptomer, der observeres i humant mTBI, såsom den mekaniske kraft, der resulterer i det forbigående bevidstløshed uden åben brutto hjernepatologi. Desuden er det fordelagtigt, at det kan anvendes til både enkeltvirkende og gentagne påvirkningsparamigmer over lange perioder som tidligere rapporteret 13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse undersøgelser blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr i National Institutes Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Georgetown University. Mus blev anbragt i en temperaturreguleret dyreanlæg og blev holdt på en 12 h lys / 12 h mørk cyklus. Fødevarer og vand var tilgængelige ad libitum .
1. Fremstilling af mTBI-apparatet
BEMÆRK: MTBI-apparatet indeholder en DAQ-boks til dataovervågning for at styre slagparametre, en højhastighedst pneumatisk støddæmper til udførelse af impaktionen og en støbt gelfyldt base for at decelerere hovedet efter slag.
- Tænd trykluft og initialiser pneumatisk slagblæser med høj hastighed til en trykindstilling på 861,85 kPa.
- Kalibrere DAQ-styresystemet til følgende parametre-stempelhastighed på 2,35 m / s, overfladetid timE på 31,5 ms.
- Placer den støbte gelfyldte base (kompressibilitet 64 kPa / mm), således at midterlinien er vinkelret med stødstangen af slagspidsen.
2. mTBI Impaction
- Optag vægten af alle mus der skal bruges.
- Bedøve mus med 3% isofluran i oxygen i 120 s i et induktionskammer.
- Overfør mus til mTBI apparat, fortsætte anæstesi via en bøjelig, ikke-fast næsekegle.
- Mens du er i næsekegle, placer musekop på gelpuden, så den flade overflade af kraniet præsenteres vinkelret på slagspidsen.
- Placér tape over musens hoved for at skabe en flad overflade og hold ørerne væk fra slagstedet.
- Sænk polytetrafluoretylens slagspids for at justere med sagittal midtlinjen i midten af hovedet. Den anvendte tændstikspids er 10 mm i diameter og dækker hårbundets område lige bag øjnene til ørens midterlinie. Juster støvsugeren, så det er juSt rører på overfladen af musens hoved.
- Træk slagspidsen tilbage, og drej manuelt ned den nødvendige afbøjningsdybde (7,5 mm).
- Drej DAQ-styresystemet og tryk udløserknappen for at påvirke musens hoved, enten en enkelt eller gentagne påvirkninger. Gentagende virkninger leveres hver gang uden forsinkelse mellem hver indvirkning.
- Umiddelbart efter den endelige indvirkning skal musen fjernes fra anæstesi og mTBI-apparatet og placeres i ryglæn.
- Ved hjælp af et stopur måles latensen af tilbagekoblingen af højre refleks (liggende til udsat) for at bestemme tab af bevidsthedstid samt tid til ambulation (uhindret gang).
- Overvåg musen og ved genopretning til normal opførsel, vend tilbage til sit hjem bur.
- Sham mus modtager identisk håndtering og anæstesi, men får ingen effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brugen af denne nye mTBI-enhed muliggør enkelt og gentagne milde hovedskader uden risiko for kraniebrud eller strukturelle hjerneskade. Modellen anvender en specialfremstillet pneumatisk Teflon slagord enhed til at levere en mekanisk energi påvirkede lukkede hoved. Virkningen er lavet under præcise hastigheds- og deformationsparametre, hvilket skaber en pålidelig og reproducerbar model for at undersøge mekanismerne, der bidrager til effekten af enkelt eller gentaget hjernerystelse mTBI ( figur 1 ).
Tilstedeværelsen eller fraværet af LOC er et nyttigt værktøj til graden af hjernerystelse i dyremodeller. Returreaktionstidens tilbagesendelse er en akut neurologisk vurdering af skadeværdigheden, at vi plejede at kvantificere LOC efter en enkelt og gentag mTBIs (7,5 mm dybde, figur 2 ). Under proceduren modtager mus i alt 3 min isofluran I ilt, og således har alle mus inklusive shams en LOC-periode efter anæstesi tilbagetrækning. Enkelt mTBI resulterer i signifikant øget LOC sammenlignet med sham-mus (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, figur 2A ). Dette korrelerede også med øgede ambulationstider efter en enkelt mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figur 2B ). I gentagne skadesparadigmer (i alt 30 virkninger, 5 indvirkninger pr. Dag i 6 dage) var der signifikant forhøjede LOC og ambulationstider på alle testdage (gentaget målinger af tovejsanalyse af variansskadeseffekt F 1,14 = 22,92, P <0,0003). Under hele undersøgelsen var den gennemsnitlige LOC over de 6 dage Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, figur 2C og gennemsnitlige ambulationstider Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figur 2D. Iba1-farvning for microglia / makrofager afslørede ingen ændring mellem sham og single mTBI-mus, men omfattende Iba1-immunreaktivitet i optisk kanal i gentagne mTBI-mus ( figur 3 ). Gentag mTBI-mus viste ingen tegn på inflammation af gråstof i cortex ( figur 3 ) eller andre hjerneområder.
Figur 1 : Illustrativ repræsentation af musemodellen af mTBI. ( A ) Opstillingen af alle materialer, der kræves for at udføre mTBI. ( B ) Mus anbragt i isofluran induktionskammer i 2 minutter. ( C ) På mTBI-apparatet placeres musen i en ikke-fast næsekegle for at fortsætte anæstesi. ( D ) Forsigtigt bånd musen hoved for at skabe en flad overflade og holde ører tilbage. ImpactoR spidsen sænkes for bare at røre hovedets overflade. ( E ) Impactor spids tilbagetrukket og krævet nedbøjningsdybde sænkes ved hjælp af drejeknappen (indsats). MTBI udført ved at trykke på udløserknappen. ( F ) Bevidstløshed målt efter den tid, der er taget for tilbagekobling af korrektionsreflex (liggende til udsat). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Single og Repeat mTBIs øger transienttab af bevidsthed og vender tilbage til ambulationstider. Mus, der modtager en enkelt mTBI, har signifikant forøget ( A ) tab af bevidsthed (LOC) og ( B ) ambulationstider i forhold til sham-kontrolmus (n = 5 pr. Gruppe, ** p <0,01). ( C - D ) Gentagen mTBI (5 indvirkninger pr. Dag i 6 dage) øger signifikant daglig LOC og ambulationstider i forhold til sham mus (n = 8 pr. Gruppe, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Data udtrykt som middel ± SEM, analyseret ved tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA med en Bonferroni post-hoc test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Gentag mTBI inducerer Microglia / Makrofager Aktivering i Optisk Trakt. ( A ) Iba1 farvning i sham mus viser afsløret microglia / makrofager i cortex (a1 - a3) og begrænset farvning i optisk kanal (a4-a6). ( B ) Mus, der modtager en enkelt mTBI(7,5 mm) har lignende Iba1-farvningsprofiler som sham-mus i både cortex (b1-b3) og optisk kanal (b4-b6), 24 h efterpåvirkning. ( C ) Gentag mTBI-mus (5 påvirkninger pr. Dag i 6 på hinanden følgende dage) viser et stærkt inflammatorisk respons i optisk tarmkanal (c4-c6), men ikke i cortex (c1-c3), 24 timer efter den sidste virkning ). Forstørrede billeder, der demonstrerer morphologien af Iba-1-positive microglia / makrofager i cortexen (a3, b3, c3) og optisk kanal (a6, b6, c6) af sham, enkelte og gentagne mTBI-mus. Skalestænger = 200 μm (A, B, C); 50 μm (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, forstørrede paneler). Billeder repræsenterer n = 6 pr. Gruppe. Cortex (cx), optisk kanal (opt), mild traumatisk hjerneskade (mTBI). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hos mennesker er mTBI karakteriseret ved en funktionssvigt i fravær af strukturel skade. Dette kan forekomme med eller uden et bevidsthedstab 1 . Eksponering for gentagelse af hjernerystelse er for tiden tænkt som grundlag for udviklingen og / eller progressionen af neurodegenerative sygdomme som CTE 4 . Det er godt dokumenteret, at CTE er almindeligvis fundet i boksere og fodboldspillere, og selv om eksponering for gentagne hjernerystelse (herunder dem der ikke medfører bevidsthedstab) vides at være et væsentligt element i udviklingen af CTE, ved vi endnu ikke hvorfor De mekanismer, hvormed gentagelse af hjernerystelse forårsager de forskellige ændringer, der opstår i hjernen.
En vigtig hindring for at forstå disse mekanismer er vanskeligheden ved at udvikle modeller, der nøjagtigt rekapitulerer de vigtigste symptomologier, der observeres hos personer, der opretholder en mTBI-virkning. Det betyder det akutte og kroniske biologiske patHays underliggende hjernerystelse er vanskelige at undersøge, og nye behandlinger kan ikke udvikles. I særdeleshed er eksisterende dyremodeller af gentagelse af hjernerystelse meget alvorlige, idet der kun anvendes 2-3 gentagelsesvirkninger, der forårsager omfattende neuronalt celletab, kraniebrud og tab af hjernevæv 8 , 10 , 11 , 12 . Denne grad af skade forekommer ikke efter gentagelse af hjernerystelser hos mennesker, hvilket viser behovet for en ny model af enkelt og gentagende mild hovedpåvirkning.
Her beskriver vi en ny model af mTBI, der bruger en specialfremstillet diffus skadeanordning, der er specielt designet til at overføre energi gennem kraniet og hjernen og væk fra musen. Gennem både enkeltvirkende og repetitive virkningsparadigmer giver modellen mulighed for at begynde at undersøge, hvordan hjernerystelse bidrager til neurologisk svækkelse senere i livet. Den enkelte hDet paradigme recapitulates de kendetegnende karakteristika ved mild traumatisk hjerneskade observeret hos mennesker, mens det gentagne paradigme muliggør undersøgelse af, hvordan disse tilsyneladende milde skader bidrager til kronisk og vedvarende degeneration over tid. Enheden muliggør gentagne mTBI-hovedpåvirkninger uden risiko for kraniebrud eller strukturelle hjerneskade.
Som det er tilfældet med mange teknikker, er visse aspekter af denne protokol vigtige at bemærke for genereringen af nøjagtige og pålidelige resultater. Under kammer induktion og mTBI skader er det vigtigt at opretholde en ensartet anæstesi til hver mus. På grund af det faktum, at retning og ambulationstid er en vigtig resultatmåling af denne mTBI-procedure, bør forskerne sørge for, at både mTBI-skader og skamdyr udsættes for sammenlignelige niveauer af anæstesi. Specielt for hele procedurens løbetid bør musene kun under anæstesi i 3 minutter i alt (2 min i denInduktionskammer, 1 min med mTBI-næsekegleanordningen). Dette lavt niveau og varighed af anæstesi er en stor fordel i forhold til mange andre mTBI-modeller, og giver konsistente retens refleksrespons gange (sham mus 20-40 s, mTBI mus 50-100 s). Derudover er det vigtigt at opretholde en registrering af musemængder hver dag i undersøgelsens varighed, når man bruger gentaget mTBI-paradigme. Dette skal sikre konsekvent overvågning af stress og generel dyrevelfærd gennem hele tiden i mTBI-procedurerne. Denne procedure resulterer ikke i, at mus bliver trukket eller isoleret. Normal pleje, spise og drikke skal overholdes inden for den første time efter proceduren.
Efter skader er der ingen grov morfologisk patologi i hjernevævet, der skyldes enten enkelt eller flere virkninger over et 1 ugers tidskursus . Efter en enkelt mTBI er det kun observerede cellulære respons en forbigående reduktion i excitatoriske synapser; thEre er ingen betændelse, tab af grå eller hvid stof, axonal skade eller celledød. Med 30 gentagelses mTBI (5 pr. Dag over 6 dage) er der kronisk inflammation i optisk tarm på lignende niveauer som tidligere kvantificeret 1 . Kronisk hvid stofbetændelse er blevet observeret mange år efter en enkelt mTBI 14 , og kronisk inflammation kan detekteres hos levende atleter med en historie med gentagelse af mTBI 15 . Begrænsningerne af denne model er, at den ikke kan bruges til at studere axonal skade uden for optisk kanal eller mekanismer for celledød, da disse er fraværende i vores model. Også baseret på vores tidligere offentliggjorte data inducerer denne model ikke ændringer i amyloid- eller tau-patologi ved 1 måned efter mTBI i en musemodel af Alzheimers sygdom 13 . Vi mener, at denne mangel på amyloid og tau patologi er relateret til fraværet af aksonal patologi i vores model. Vores model giver en platform til at undersøgeSpiste diskrete ændringer i neuronnetværk, synaptisk integritet og sammensætning og ændringer i adfærd efter gentagelse af hjerteblødninger. Baseret på disse resultater producerer denne nye model klinisk relevant symptomologi på en kontrolleret, streng og effektiv måde. Yderligere brug af denne model vil muliggøre undersøgelsen af de mekanismer, der ligger til grund for den akutte og kroniske patofysiologi af mTBI og hjernerystelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01 NS067417 fra National Institute for Neurological Disorders and Stroke (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
- McMahon, P., et al. Symptomatology and functional outcome in mild traumatic brain injury: results from the prospective TRACK-TBI study. J Neurotrauma. 31 (1), 26-33 (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The molecular pathophysiology of concussive brain injury. Clin Sports Med. 30 (1), 33-48 (2011).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76 (5), 886-899 (2012).
- Levin, H. S., Diaz-Arrastia, R. R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. Lancet Neurol. 14 (5), 506-517 (2015).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport: the 4th International Conference on Concussion in Sport, Zurich, November 2012. J Athl Train. 48 (4), 554-575 (2012).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between pre-clinical research and clinical reality. J Neurochem. 129 (6), 916-931 (2014).
- Creed, J. A., et al. Concussive brain trauma in the mouse results in acute cognitive deficits and sustained impairment of axonal function. J Neurotrauma. 28 (4), 547-563 (2011).
- Hamberger, A., et al. Concussion in professional football: morphology of brain injuries in the NFL concussion model--part 16. Neurosurgery. 64 (6), 1174-1182 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosci Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Prins, M. L., et al. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Dev Neurosci. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Tang, Y. P., et al. A concussive-like brain injury model in mice (II): selective neuronal loss in the cortex and hippocampus. J Neurotrauma. 14 (11), 863-873 (1997).
- Winston, C. N., et al. Dendritic Spine Loss and Chronic White Matter Inflammation in a Mouse Model of Highly Repetitive Head Trauma. Am J Pathol. 186 (3), 552-567 (2016).
- Johnson, V. E., et al. Inflammation and white matter degeneration persist for years after a single traumatic brain injury. Brain. 136, Pt 1 28-42 (2013).
- Barrio, J. R., et al. In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 2039-2047 (2015).
