单次与重复性轻度创伤性脑损伤的小鼠模型

摘要

运动员每年会遭受数百次轻度创伤性脑损伤（mTBI）或脑震荡；然而，这些损伤对大脑所造成的影响尚不明确。因此，建立一种能够稳定重现临床相关症状的单次及重复性mTBI动物模型，将有助于推动对轻度创伤性脑损伤和脑震荡的研究进展。

摘要

轻度创伤性脑损伤（mTBI）可导致脑功能的急性丧失，包括一段时间的意识混乱、意识丧失（LOC）、局灶性神经功能缺损，甚至遗忘症。参加对抗性运动的运动员面临反复遭受大量mTBI的高风险。就运动员的损伤程度而言，mTBI被定义为一种不会引起明显病理性改变的轻度损伤，但会引起可自行恢复的短期神经功能缺损。尽管此前已有多种在小鼠和大鼠中建立mTBI模型的尝试，但许多模型均报告出现了明显的不良反应，包括颅骨骨折、脑内出血、轴突损伤以及神经元细胞死亡。本文中，我们描述了一种高度可重复的mTBI动物模型，能够再现临床上相关症状。该模型采用自行设计的气动冲击装置实施闭合性头部创伤，冲击过程在精确控制的速度和形变参数下进行，从而建立一种可靠且可重复的模型，用于研究单次或重复性震荡性mTBI所涉及的作用机制。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是指由外部物理力量导致的头部损伤，引起正常脑功能的中断。该疾病对社会经济和公共卫生构成重大负担。根据美国疾病控制与预防中心2015年向国会提交的报告估计，每年约有250万美国人遭受创伤性脑损伤。这不仅影响患者的生活质量，也给社会带来极高的经济负担，目前估计每年高达765亿美元。实际脑损伤的程度以及急性期症状的表现决定了轻度、中度和重度创伤性脑损伤的分类。

轻度创伤性脑损伤（mTBI），也称为脑震荡，占每年报告的创伤性脑损伤（TBI）病例的70%以上¹。该损伤在参与高风险接触性运动（如拳击和足球）的运动员中最常见²。与中度或重度TBI不同，mTBI相关的即时损伤和症状有时并不明显³。然而，mTBI的长期影响可能与中度和重度TBI所见的影响同样严重。反复遭受mTBI的个体已被证实会发展为慢性创伤性脑病（CTE），以及其他认知功能障碍和退行性疾病⁴。因此，深入理解导致mTBI后短期症状及整体长期损伤的机制至关重要。

在人类中，脑震荡的定义由第四届国际运动脑震荡会议（苏黎世，2012年）所界定⁵ 指出运动性脑震荡的损伤程度较轻，不会引起明显的病理性改变，但会导致短暂的神经功能缺损，且可自行恢复。事实上，最近一项研究利用头盔撞击遥测系统，探讨了轻度创伤性脑损伤（mTBI）对高中橄榄球运动员认知功能障碍的影响。该研究记录了运动员头盔受到撞击的次数 >单个季节内20克的产量范围从最低226（平均每次4.7）到最高1855（平均每次38.6）⁶这些影响大多数并未导致临床上的脑震荡诊断；但通过fMRI可以观察到脑功能发生功能性改变的证据。⁶导致这些功能改变的脑部变化尚不明确，因此迫切需要一种可靠且可重复的模型，以促进对震荡性和亚震荡性轻度创伤性脑损伤（mTBI）影响的研究。

尽管此前已有尝试在小鼠和大鼠中建立轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型⁷，但许多模型均报告了不良效应。特别是，大多数啮齿类动物模型在重复性方面存在局限，通常仅使用少于五次的mTBI冲击，且伴随多种不良病理事件，包括脑内出血、颅骨骨折、严重的轴突损伤、神经元细胞死亡以及死亡率升高^8,9,10,11,12。本文中，我们描述了一种更接近人类脑震荡真实定义的小鼠mTBI模型。该模型重现了人类轻度创伤性脑损伤中的多种症状，例如由机械力导致的一过性意识丧失，而无明显的宏观脑部病理改变。此外，该模型具有优势，可用于单次冲击以及长期重复冲击的实验范式，正如先前报道所述¹³。

方案

这些研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。实验方案经乔治城大学机构动物护理和使用委员会批准。小鼠饲养于温度可控的动物设施中，并维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下。食物和水均自由供应。 随意摄取.

1. 轻度创伤性脑损伤装置的准备

注意：轻度创伤性脑损伤（mTBI）装置包含一个数据采集（DAQ）盒，用于控制冲击参数；一个高速气动冲击器，用于实施冲击；以及一个填充凝胶的模制底座，用于在冲击后减缓头部运动。

1. 打开压缩空气，将高速气动冲击器初始化至压力设定值 861.85 kPa。
2. 将数据采集（DAQ）控制系统校准至以下参数：活塞速度 2.35 m/s，表面停留时间 31.5 ms。
3. 放置已注满凝胶的模制基座（压缩性 64 kPa/mm），使其中线与冲击头的运动轨迹垂直。

2. 轻度创伤性脑损伤撞击

1. 记录所有待使用小鼠的体重。
2. 在诱导室中使用3%异氟烷与氧气混合气体对小鼠麻醉120秒。
3. 将小鼠转移至轻度创伤性脑损伤（mTBI）装置，通过柔软且非固定的鼻罩持续维持麻醉。
4. 在鼻罩中，将小鼠头部置于凝胶垫上，使颅骨平面垂直于撞击头的撞击方向。
5. 用胶带覆盖小鼠头部以形成平整表面，并将耳朵固定于撞击区域之外。
6. 降低聚四氟乙烯撞击头，使其对准头部中央的矢状中线。所用撞击头直径为10 mm，覆盖范围从眼睛后方至耳部中线区域。调整撞击头位置，使其刚好接触小鼠头部表面。
7. 回撤撞击头，并手动设定所需的偏转深度（7.5 mm）。
8. 启动数据采集（DAQ）控制系统，按下触发按钮以对小鼠头部实施单次或重复撞击。重复撞击连续进行，各次之间无延迟。
9. 最后一次撞击后立即停止麻醉，将小鼠从mTBI装置中取出并置于仰卧位。
10. 使用秒表测量翻正反射恢复的潜伏期（从仰卧转为俯卧），以确定意识丧失时间，同时记录自主行走（无障碍行走）所需时间。
11. 监测小鼠状态，待其行为恢复正常后，将其放回原饲养笼。
12. 假手术组小鼠接受相同的处理和麻醉操作，但不施加撞击。

结果

使用这种新型轻度创伤性脑损伤（mTBI）装置可在无颅骨骨折或结构性脑损伤风险的情况下，实现单次和重复性的轻度头部损伤。该模型采用定制的气动聚四氟乙烯撞击装置，传递闭合性头部机械能量冲击。撞击在精确的速度和形变参数下进行，从而建立一种可靠且可重复的模型，用于研究单次或重复性脑震荡型轻度创伤性脑损伤（mTBI）效应的潜在机制（图1）。

LOC 的存在或缺失是评估动物模型中脑震荡严重程度的有用工具。翻正反射恢复时间是一种急性神经功能损伤严重程度的评估方法，我们利用该指标来量化单次和重复性轻度创伤性脑损伤（mTBI）后的 LOC（撞击深度 7.5 mm，图 2）。在操作过程中，小鼠接受总共 3 分钟的异氟烷氧气麻醉，因此包括假手术组在内的所有小鼠在麻醉撤除后均会出现一段 LOC 时期。与假手术小鼠相比，单次 mTBI 导致 LOC 显著延长（...

讨论

在人类中，轻度创伤性脑损伤（mTBI）的特点是在无结构性损伤的情况下出现功能障碍，这种情况可伴有或不伴有意识丧失¹。目前认为，反复发生脑震荡是导致神经退行性疾病（如慢性创伤性脑病，CTE）发生和/或进展的基础⁴。已有充分文献记载，CTE 常见于拳击运动员和橄榄球运动员；尽管已知反复脑震荡（包括未导致意识丧失的脑震荡）是发生 CTE 的必要因素，但我们尚不清楚反复脑震荡引发脑内特异性改变的具体机制。

理解这些机制的主要障碍在于难以建立能够准确重现轻度创伤性脑损伤（mTBI）个体所表现出的关键症状的模型。这意味着难以研究脑震荡影响背后的急性和慢性生物学通路，也阻碍了新疗法的开发。特别是，现有的重复性脑震荡动物模型损伤程度过于严重，通常仅采用2到3次重复冲击，便导致广泛的神经元细胞丢失、颅骨骨折以及脑组织丧失^8,10,1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Powerlab 8SP 数据采集 (DAQ) 控制箱	（AD instruments）
VIP 3000 校准蒸发器	Matrx
异氟烷	Henry Schein 动物健康公司	29405
氧气			市售可得
压缩空气			市售可得
美纹纸胶带			市售可得
秒表	Fisher Scientific	02-261-840
C57 Bl/6 小鼠	Jackson 实验室
电子天平及称量容器	Fisher Scientific	20031
抗 Iba1 抗体	Wako	019-19741
HRP 标记的二抗	Jackson Immunoresearch	111-035-003