Summary
Les athlètes absorbent plusieurs centaines de blessures cérébrales traumatiques légères (mTBI) / commotions cérébrales chaque année; Cependant, la conséquence de ces derniers sur le cerveau est mal comprise. Par conséquent, un modèle animal de mTBI unique et répétitif qui réplique constamment des symptômes cliniquement pertinents fournit les moyens de faire avancer l'étude de mTBI et de commotion cérébrale.
Abstract
Les lésions cérébrales traumatiques légères (mTBI) peuvent entraîner une perte aiguë de la fonction cérébrale, y compris une période de confusion, une perte de conscience (LOC), des déficits neurologiques focaux et même de l'amnésie. Les athlètes participant aux sports de contact courent un risque élevé d'exposition à un grand nombre de mTBI. En ce qui concerne le niveau de blessure chez un athlète sportif, un mTBI est défini comme une blessure légère qui ne cause pas de changements pathologiques grossiers, mais qui entraîne des déficits neurologiques à court terme résolus spontanément. Malgré les tentatives précédentes de modéliser le mTBI chez la souris et le rat, beaucoup ont signalé des effets indésirables grossiers, y compris des fractures du crâne, des saignements intracérébraux, des lésions axonales et des décès de cellules neuronales. Dans ce document, nous décrivons notre modèle animal hautement reproductible de mTBI qui reproduit des symptômes cliniquement pertinents. Ce modèle utilise un dispositif de frappe pneumatique personnalisé pour délivrer un traumatisme à tête fermée. Cet impact est réalisé dans des paramètres précis de la vitesse et de la déformation,En créant un modèle fiable et reproductible pour examiner les mécanismes qui contribuent aux effets de mTBI cérébral unique ou répétitif.
Introduction
La lésion cérébrale traumatique (TBI) est définie comme une blessure à la tête subie par une force physique externe, ce qui entraîne une perturbation de la fonction cérébrale normale. Cela représente un important fardeau socioéconomique et de santé publique, avec le rapport du Centre pour la lutte contre la maladie et la prévention 2015 au Congrès estimant que 2,5 millions d'Américains subissent un TBI chaque année. Cela affecte non seulement la qualité de vie du patient, mais aussi un coût économique extrêmement élevé pour la communauté, actuellement estimé à 76,5 milliards de dollars par an. La quantité de lésions cérébrales réelles transmises et les symptômes de phase aiguë définissent le TBI léger, modéré et sévère.
Les lésions cérébrales traumatiques légères (mTBI), également appelée commotion cérébrale, représentent plus de 70% des TCE déclarés chaque année 1 . Il est plus fréquent chez les athlètes qui participent à des sports de contact à haut risque dont la boxe et le football 2 . Contrairement à modéréOu des formes sévères de TBI, les dégâts immédiats et les symptômes associés au mTBI ne sont parfois pas aussi prononcés 3 . En revanche, les effets à long terme de mTBI peuvent être aussi débilitants que ceux observés dans les formes modérées et sévères. Ceux qui souffrent de mTBI répétitif ont montré qu'ils développent une encéphalopathie traumatique chronique (CTE), ainsi que d'autres maladies cognitives et dégénératives 4 . Par conséquent, il est important de mieux comprendre les mécanismes qui contribuent aux symptômes à court terme et à l'ensemble des dommages à long terme qui surviennent après mTBI.
Chez l'homme, la définition de la commotion cérébrale telle que définie par la quatrième Conférence internationale sur la Concurrence dans le sport (Zurich 2012) 5 indique que le niveau de blessure de la commotion sportive est doux, ne provoque pas de changements pathologiques grossiers, mais entraîne des déficits neurologiques à court terme Qui sont résolus spontanément. En effet, une receNt study a étudié l'effet de mTBI sur la déficience cognitive chez les joueurs de football du secondaire, en utilisant des systèmes de télémétrie à impact de tête. Cette étude a montré que le nombre de fois que les joueurs subissaient des impacts de casque> 20 g en une seule saison variait d'un minimum de 226 (moyenne, 4,7 par session) à un sommet de 1855 (moyenne, 38,6 par session) 6 . La plupart de ces impacts n'ont pas abouti au diagnostic clinique d'une commotion cérébrale; Mais la preuve de changements fonctionnels dans la fonction cérébrale pourrait être observée à l'aide d'IRMF 6 . Les changements de cerveau qui causent ces changements fonctionnels sont inconnus et, par conséquent, il est urgent de disposer d'un modèle fiable et reproductible pour faciliter la recherche sur les effets du mTBI concussif et subconscient.
Malgré les tentatives précédentes de modélisation de mTBI chez la souris et le rat 7 , beaucoup signalent des effets néfastes. En particulier, la plupart des modèles de rongeurs sont limités dans leur nature répétitive en utilisant moinsUn impact de cinq mTBI, ainsi que des événements pathologiques indésirables, y compris des saignements intracérébrés, des fractures du crâne, une lésion axonale sévère, une mort de cellules neuronales et une mortalité accrue 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Dans ce document, nous décrivons un modèle de souris de mTBI qui est plus proche de la véritable définition de la commotion cérébrale chez l'homme. Ce modèle récapitule plusieurs des symptômes observés chez le mTBI humain, comme la force mécanique qui entraîne une perte de conscience transitoire sans pathologie cervicale manifeste. En outre, il est avantageux de pouvoir utiliser pour des paradigmes à impact unique et à impact répétitif sur de longues périodes comme indiqué précédemment 13 .
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Protocol
Ces études ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes Health. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'Université de Georgetown. Les souris ont été logées dans une installation animale contrôlée par la température et ont été conservées sur un cycle de lumière de 12 h / 12 h. La nourriture et l'eau étaient disponibles ad libitum .
1. Préparation de l'appareil mTBI
REMARQUE: L'appareil mTBI comprend une boîte de saisie de données (DAQ) pour contrôler les paramètres d'impact, un impacteur pneumatique à grande vitesse pour effectuer l'impaction et une base moulée en gel pour décélérer la tête après l'impact.
- Activez l'air comprimé et initialisez l'impacteur pneumatique à grande vitesse pour un réglage de pression de 861,85 kPa.
- Calibrer le système de contrôle DAQ aux paramètres suivants - vitesse du piston de 2,35 m / s, durée de vie de surface timE de 31,5 ms.
- Placez la base moulée remplie de gel (compressibilité 64 kPa / mm) de telle sorte que la ligne médiane soit perpendiculaire à la trajectoire de la pointe de l'impact.
2. Impaction mTBI
- Enregistrez les poids de toutes les souris à utiliser.
- Anesthésier les souris avec 3% d'isoflurane dans de l'oxygène pendant 120 s dans une chambre d'induction.
- Transférer des souris dans un appareil mTBI, continuer l'anesthésie via un cône de nez flexible et non fixe.
- Alors que dans le cône du nez, placez la tête de la souris sur le tampon de gel afin que la surface plane du crâne soit présentée perpendiculairement à la pointe de l'impact.
- Placez le ruban sur la tête de la souris pour créer une surface plane et éloigner les oreilles du site d'impact.
- Abaisser la pointe de l'impact du polytétrafluoroéthylène pour aligner la ligne médiane sagittale au centre de la tête. La tige de frappe utilisée mesure 10 mm de diamètre et recouvre la zone du cuir chevelu juste derrière les yeux jusqu'à la ligne médiane des oreilles. Ajustez l'élément de frappe de sorte qu'il soit juEn touchant la surface de la tête de la souris.
- Rétractez la pointe de l'impacteur et composez manuellement la profondeur de déflexion requise (7,5 mm).
- Accrochez le système de contrôle DAQ et appuyez sur le bouton de déclenchement pour influer sur la tête de la souris, soit des impacts singuliers ou répétitifs. Les impacts répétitifs sont transmis successivement sans délai entre chaque impact.
- Immédiatement après l'impact final, retirez la souris de l'anesthésie et de l'appareil mTBI et placez-la en position couchée.
- L'utilisation d'un chronomètre mesure la latence du réflexe du réflexe de redressement (supine à propice), afin de déterminer la perte de temps de conscience, ainsi que le temps d'ambulation (marche sans entrave).
- Surveillez la souris et, après la récupération, à un comportement normal, retournez dans sa cage à domicile.
- Les souris Sham reçoivent une manipulation et une anesthésie identiques, mais ne reçoivent aucun impact.
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Representative Results
L'utilisation de ce nouveau dispositif mTBI permet des blessures légères et répétitives légères sans risque de fracture du crâne ou de lésions cérébrales structurelles. Le modèle utilise un dispositif de frappe en Téflon pneumatique sur mesure pour réaliser un impact d'énergie mécanique en tête fermée. L'impact est réalisé dans des paramètres précis de la vitesse et de la déformation, en créant un modèle fiable et reproductible pour examiner les mécanismes qui contribuent aux effets du mTBI cérébral simple ou répétitif ( figure 1 ).
La présence ou l'absence de LOC est un outil utile pour classer la gravité de la commotion cérébrale dans les modèles animaux. Le retour du temps de réflexe de redressement est une évaluation neurologique aiguë de la gravité de la blessure que nous avons utilisé pour quantifier le LOC après un mTBI unique et répété (profondeur de 7,5 mm, figure 2 ). Au cours de la procédure, les souris reçoivent un total de 3 min d'isoflurane Dans l'oxygène, et donc toutes les souris, y compris les shams, ont une période LOC après le retrait de l'anesthésie. Le mTBI unique entraîne une augmentation significative de la LOC par rapport aux souris simulées (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, figure 2A ). Cela a également été corrélé avec des temps d'ambulation accrus après un mTBI unique (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figure 2B ). Dans les paradigmes de blessures répétées (30 impacts au total, 5 impacts par jour pendant 6 jours), il y a eu des taux de LOC et d'ambulation significativement élevés sur tous les jours de test (mesures répétées à deux sens de l'effet de blessure par variance F 1,14 = 22,92, P <0,0003). Pendant la totalité de l'étude, la LOC moyenne au cours des 6 jours était Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, Figure 2C et temps d'ambulation moyens Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figure 2D. La coloration par Iba1 pour la microglie / les macrophages n'a révélé aucun changement entre les souris simulées et mTBI simples, mais une immunoréactivité Iba1 étendue dans le tractus optique chez les souris mTBI répétées ( Figure 3 ). La répétition des souris mTBI n'a montré aucune évidence d'inflammation de la matière grise dans le cortex ( Figure 3 ) ou dans d'autres zones du cerveau.
Figure 1 : Représentation illustrative du modèle de souris de mTBI. ( A ) La configuration de tous les matériaux nécessaires à l'exécution de mTBI. ( B ) Souris placée dans une chambre d'isoflurane pendant 2 min. ( C ) Sur l'appareil mTBI, la souris est placée dans un cône de nez non fixe pour continuer l'anesthésie. ( D ) Tapez doucement la tête de la souris pour créer une surface plane et retirez les oreilles. ImpactoR pointe pour simplement toucher la surface de la tête. ( E ) La pointe de l'impact est rétractée et la profondeur de déviation requise est abaissée à l'aide de la molette (insertion). MTBI effectué en appuyant sur le bouton de déclenchement. ( F ) Perte de conscience mesurée par le temps pris pour le retour du réflexe de redressement (en décubitus). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : les mTBI simples et répétées augmentent la perte de conscience transitoire et le retour aux temps d'ambiance. Les souris qui reçoivent un mTBI unique ont considérablement augmenté ( A ) la perte de conscience (LOC) et ( B ) les temps d'ambulation par rapport aux souris témoins simulés (n = 5 par groupe, ** p <0,01). ( C - D ) Le mTBI répétitif (5 impacts par jour pendant 6 jours) augmente de manière significative le temps quotidien de LOC et d'ambulation par rapport aux souris simulées (n = 8 par groupe, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Données exprimées en moyenne ± SEM, analysées par ANOVA à répétition bidirectionnelle avec test Bonferroni post-hoc. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : la répétition de mTBI induit l'activation de microglie / macrophages dans le domaine optique. ( A ) La coloration Iba1 chez la souris simulée révèle une microglie / macrophages reposants dans le cortex (a1 - a3) et une coloration limitée dans le tractus optique (a4-a6). ( B ) Des souris qui reçoivent un mTBI unique(7,5 mm) ont des profils de coloration Iba1 similaires en tant que souris simulées dans le cortex (b1-b3) et le tractus optique (b4-b6), 24 heures après l'impact. ( C ) Répétez les souris mTBI (5 impacts par jour pendant 6 jours consécutifs) présentent une forte réponse inflammatoire dans le tractus optique (c4-c6) mais pas dans le cortex (c1-c3), 24 heures après le dernier impact (Jour 7 ). Des images agrandies démontrant la morphologie de la microglie / macrophages positives d'Iba-1 dans le cortex (a3, b3, c3) et le tractus optique (a6, b6, c6) de souris simulées, simples et répétitives mTBI, respectivement. Barres d'échelle = 200 μm (A, B, C); 50 μm (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, panneaux agrandis). Images représentatives de n = 6 par groupe. Cortex (cx), voie optique (opt), lésion cérébrale traumatique légère (mTBI). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Chez l'homme, le mTBI se caractérise par une altération fonctionnelle en l'absence de lésions structurelles. Cela peut se produire avec, ou sans, une perte de conscience 1 . On pense actuellement que l'exposition à des commotions de répétition sous-tend le développement et / ou la progression de maladies neurodégénératives telles que le CTE 4 . Il est bien documenté que le CTE se retrouve couramment chez les boxeurs et les joueurs de football et bien que l'exposition aux commotions répétées (y compris celles qui n'entraînent pas une perte de conscience) est un élément essentiel dans le développement du CTE, nous ne savons pas encore pourquoi Les mécanismes par lesquels la commotion répétée provoque les changements distincts qui se produisent dans le cerveau.
Un obstacle majeur à la compréhension de ces mécanismes est la difficulté d'élaborer des modèles qui récapitulent avec précision les principales symptômes observés chez les individus qui subissent un impact mTBI. Cela signifie que la peau biologique aiguë et chroniqueLes répercussions de la concussion sont difficiles à étudier et de nouveaux traitements ne peuvent être développés. En particulier, les modèles animaux existants de commotion répétitive sont très sévères, en utilisant seulement 2-3 impacts répétés qui causent une perte de cellules neuronales étendue, une fracture du crâne et une perte de tissu cérébral 8 , 10 , 11 , 12 . Cette étendue de lésion ne se produit pas après la répétition de la commotion cérébrale chez les humains, ce qui démontre la nécessité d'un nouveau modèle d'impact unique et répétitif sur la tête.
Nous décrivons ici un nouveau modèle de mTBI, en utilisant un dispositif de blessure diffusée sur mesure qui a été spécialement conçu pour transférer de l'énergie à travers le crâne et le cerveau et loin de la souris. À travers les paradigmes à impact unique et à impact répétitif, le modèle permet de commencer à étudier comment la commotion soulève une déficience neurologique plus tard dans la vie. Le single hCe paradigme récapitule les caractéristiques caractéristiques des lésions cérébrales traumatiques légères observées chez les humains, tandis que le paradigme répétitif permet d'examiner comment ces blessures apparemment douces contribuent à une dégénérescence chronique et persistante au fil du temps. L'appareil permet des effets répétitifs sur la tête de mTBI sans risque de fracture du crâne ou de lésions cérébrales structurelles.
Comme c'est le cas avec de nombreuses techniques, certains aspects de ce protocole sont importants à noter pour la génération de résultats précis et fiables. Pendant l'induction de la chambre et les blessures au mTBI, il est essentiel de maintenir un niveau d'anesthésie constant à chaque souris. Étant donné que le temps de redressement et d'ambulation est une mesure de résultat clé de cette procédure mTBI, les chercheurs devraient s'assurer que les blessures au mTBI et les animaux simulés sont exposés à des niveaux comparables d'anesthésie. Plus précisément, pendant toute la durée de la procédure, les souris ne doivent être soumises qu'à une anesthésie pour un total de 3 min (2 minChambre de production, 1 min avec le dispositif mTBI nose cone). Ce faible niveau et la durée de l'anesthésie est un avantage majeur par rapport à de nombreux autres modèles de mTBI, et donne des temps de réponse réflexes de redressement cohérents (souris simulées 20-40 s, souris mTBI 50-100 s). De plus, lorsque vous utilisez le paradigme répétitif mTBI, il est important de conserver un record de poids de souris tous les jours pendant la durée de l'étude. Il s'agit d'assurer une surveillance cohérente du stress et du bien-être général des animaux tout au long du cours des procédures mTBI. Cette procédure n'entraîne pas que les souris soient retirées ou isolées. Un traitement normal, un repas et une consommation d'alcool devraient être observés au cours de la première heure après l'intervention.
Après une blessure, il n'y a pas de pathologie morphologique grave dans le tissu cérébral résultant d'impacts individuels ou multiples sur un cours de 1 semaine . À la suite d'un seul mTBI, la seule réponse cellulaire observée est une réduction transitoire des synapses excitatrices; ThIl n'y a pas d'inflammation, de perte de matière grise ou blanche, de lésions axonales ou de mort cellulaire. Avec 30 répétition de mTBI (5 par jour, plus de 6 jours), il y a une inflammation chronique du tractus optique, à des niveaux similaires à ceux quantifiés antérieurement 1 . L'inflammation chronique de la substance blanche a été observée plusieurs années après un seul mTBI 14 , et une inflammation chronique peut être détectée chez les athlètes vivants ayant une histoire de répétition de mTBI 15 . Les limites de ce modèle sont qu'il ne peut pas être utilisé pour étudier une lésion axonale à l'extérieur du tractus optique ou des mécanismes de décès cellulaire car ils sont absents dans notre modèle. Également basé sur nos données publiées précédemment, ce modèle n'indique pas les changements dans la pathologie amyloïde ou tau à 1 mois post-mTBI dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer 13 . Nous croyons que ce manque de pathologie amyloïde et tau est lié à l'absence de pathologie axonale dans notre modèle. Notre modèle fournit une plate-forme pour enquêterA mangé des changements discrets dans les réseaux de neurones, l'intégrité synaptique et la composition, et des altérations du comportement suite à des coups répétés de concussion. Sur la base de ces résultats, ce nouveau modèle produit une symptomatologie cliniquement pertinente de manière contrôlée, rigoureuse et efficace. Une utilisation plus poussée de ce modèle permettra l'étude des mécanismes qui sous-tendent la pathophysiologie aiguë et chronique du mTBI et de la commotion cérébrale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par R01 NS067417 de l'Institut national pour les troubles neurologiques et les accidents vasculaires cérébraux (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
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