Summary
Vaskulære endotel styrer stramt leukocyt rekruttering. Utilstrækkelig leukocyt ekstravasation bidrager til menneskers inflammatoriske sygdomme. Det er derfor nødvendigt at designe bedre behandlinger til inflammatoriske lidelser søger roman regulerende elementer i endothelial aktivisering. Her beskriver vi en omfattende metode til at karakterisere romanen endotel regulatorer, der kan ændre leukocyt handel under betændelse.
Abstract
I endothelial lag er afgørende for at opretholde homeostase i kroppen ved at styre mange forskellige funktioner. Regulering af den inflammatoriske reaktion i endothelial lag er afgørende for effektiv bekæmpelse af skadelige input og støtte i inddrivelse af beskadigede områder. Når i endothelial celler er udsat for en inflammatorisk miljø, såsom den ydre del af gram-negative bakterier membran, LPS (LPS), de express opløselige pro-inflammatoriske cytokiner, såsom Ccl5, Cxcl1 og Cxcl10, og udløse den aktivering af det cirkulerende leukocytter. Derudover udtryk af adhæsionsmolekyler E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1 på i endothelial overflade giver mulighed for interaktion og vedhæftning af de aktiverede leukocytter i endothelial lag, og i sidste ende ekstravasation mod det betændte væv. I dette scenario skal i endothelial funktion være stramt reguleret fordi overdreven eller defekte aktivering i leukocyt ansættelse kunne føre til inflammatoriske-relaterede lidelser. Da mange af disse lidelser ikke har en effektiv behandling, skal nye strategier med fokus på det vaskulære lag undersøges. Vi foreslår omfattende assays, der er nyttig til søgning af roman endotel regulatorer, der ændrer leukocyt funktion. Vi analyserer endotel aktivering ved hjælp af specifikke udtryk mål involveret i leukocyt rekruttering (f.eks, cytokiner, kemokiner og adhæsionsmolekyler) med flere teknikker, herunder: real-time kvantitativ polymerase kæde reaktion ( RT-qPCR), western-skamplet, flow flowcytometri og vedhæftning assays. Disse tilgange bestemme endotelfunktion i forbindelse med inflammatoriske og er meget nyttigt at foretage screening-assays for at karakterisere romanen endotel inflammatoriske lovgivere, der er potentielt værdifulde for at designe nye terapeutiske strategier.
Introduction
Inflammation er en gavnlig biologisk reaktion mod smitsomme agenser, med det vigtigste mål at eliminere patogenet og reparere beskadiget væv. Under visse betingelser, såsom kroniske infektioner eller autoimmune sygdomme, kan betændelse ikke fortolkes. Der er derimod en afvigende reaktion med kontinuerlig infiltration af leukocytter, hvilket resulterer i en langvarig immunrespons, der fører til vævsskader, fibrose, tab af funktion, og den samlede, handicap og i nogle tilfælde døden af patienten. Disse menneskers lidelser, katalogiseret som inflammatoriske sygdomme, alle involverer blodkar til kontrol af leukocyt ekstravasation1,2.
I endothelial celler spille en grundlæggende rolle i reguleringen af det inflammatoriske respons ved at kontrollere leukocyt handel. Når i endothelial lag er udsat for inflammatoriske mediatorer som LP'ER, hvilende endotelet aktiveres og udtrykker pro-inflammatoriske cytokiner (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) og adhæsionsmolekyler (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1) at favor rekruttering af det cirkulerende leukocytter til webstedet infektion. Leukocytter primet af de frigivne cytokiner derefter mægle rullende og interaktion med i endothelial lag gennem de korrespondent selvklæbende modstykker: PSGL-1 til selectin, α4β1 integrin til VCAM-1 og αLβ2 integrin til ICAM-1. Endelig, leukocytter migrere over Vaskulaturen mod betændelse3fokus.
Den vigtige rolle af endotel i reguleringen af det inflammatoriske respons er påvist på mus, der var genetisk modificeret til at udtrykke LP'ER receptor, toll-lignende receptor 4 (TLR4), kun på endotelceller. Disse endotel-TLR4 dyr var i stand til at reagere på en LPS-medieret betændelse og opdage infektionen genereret efter bakterier podning, og dermed opnå infektion opløsning og overlevelse på nogenlunde samme niveau som vildtype mus4 , 5.
For pathway endotel-regulerede inflammatorisk reaktion har været postuleret at hæmning på visse stadier af leukocyt-endotelet interaktion ville resultere i en reduktion af trans-endotel migration og en bedre prognose for inflammatoriske-relaterede sygdomme. Faktisk er flere strategier rettet mod endotel aktivering og leukocyt-endotelet samspillet designet til at hindre ekstravasation af immunceller som en behandling af inflammatoriske lidelser6,7.
I denne rapport beskriver vi en grundig gruppe af in vitro- teknikker til fuldt ud at beskrive den endotel aktivitet som svar på inflammatoriske stimulus LP'ER og dens rolle i leukocyt aktivering og vedhæftning til den vaskulære lag. Endotel celle model bruges i dette håndskrift var mus lunge endotel cellelinje (MLEC-04), som beskrevet af Hortelano et al. 8. the MLEC-04 cellelinie er blevet valideret i litteraturen til at være et passende system til at studere endotel aktivering9,10. Baseret på forskningsmæssige interesser, disse tilgange kan nemt ekstrapoleres til enhver endotel eller leukocyt systemer og inflammatoriske profil. Når i endothelial parametre i de valgte betingelser er defineret, kan systemet teste nye lægemidler på de foreslåede eksperimenter til at evaluere den vaskulære aktivering. I den inflammatoriske forbindelse, endotel celler testet med sammensatte af interesse kan sammenlignes med kontrol betingelser af cellerne, og eventuelle deraf følgende forskelle kan underrette lægemidlets prognostiske resultatet på udvikling og progression af betændelse. Afslutningsvis foreslår vi et relevant system til at karakterisere nye stof mål til i endothelial celler, som kan påvirke udformningen af roman kar-specifikke behandlinger mod inflammatoriske-relaterede sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. endotel cellekultur
- vævskultur behandlet plader
- frakke 100 mm vævskultur plader med 2,5 mL gelatine løsning (autoklaveres, 0,1% gelatine i destilleret vand) i 30 minutter ved 37 ° C; dette kan ekstrapoleres til det krævede godt format. Opsug gelatine løsning og forlade plader til at lufttørre i vævskultur hood.
- Vævskultur betingelser
- dyrker MLEC-04 celler inde i en biologisk inkubator (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO 2). Vokser celler i komplet medier af Dulbecco ' s ændret Eagle Medium: næringsstof blanding F-12 (DMEM/F-12) suppleret med 10% føtal bovin Serum (FBS) og 100 enheder/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin (Poulsen).
- Tæller cellerne af metoden standard Neubauer kammer, og tilføje MLEC-04 celler til 100 mm gelatine-behandlede plader i 10 mL komplet media, på 2-11 x 10 4 celler/cm 2 lav befolkningstæthed. Opdel celler 1:3, når de når sammenløbet.
Bemærk: Dette sker normalt efter to til tre dage i kultur. - Subkultur celler ved at vaske pladerne med 10 mL sterilt phosphat bufferet saltvand (PBS) efterfulgt af tilføjer 2 mL trypsin-EDTA-oploesning (0,25% trypsin, 5 mM EDTA) og Inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
- Stoppe trypsin-EDTA reaktion og genoprette de suspenderede celler ved at tilføje 10 mL komplet media. Spin ned celler (300 x g, 5 min), supernatanten, resuspenderes cellulære i komplet media og subkultur passende.
2. LP'ER behandling og mæglerne
- plade MLEC-04 celler i komplet media på sub confluence i formatet godt: 7 x 10 5 celler/brønd på 6-godt plader og 2,5 x 10 5 celler/brønd på 96-brønd plader.
- Ruger kultur for 6 h i en celle inkubator (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO 2). Skifte cellerne til ufuldstændige media (DMEM-F12, P/S) og efterlade natten over (på) til at synkronisere og reducere celleaktivitet.
- Fjerne medier og teste nye farmakologiske forbindelser ved at inkubere i endothelial celler med (eller uden) det pågældende stof (fx DT 10) fortyndet i ufuldstændig medierne (30 min, 37 ° C), tilføje 1,4 mL/godt for 6-godt plade eller 0,14 mL/godt for 96-brønd plader).
- Udfordrer cellerne ved at tilføje LP'ER til inkubation medier (100 ng/mL, endelige koncentration) i perioden angivet i hvert assay. Bruge PBS som en kontrol.
3. Evaluering af Transcriptional profil på aktiveret endotelet af RT-qPCR
- frø MLEC-04 celler på sub confluence i 6-og kultur plader (7 x 10 5 celler/brønd). Inkuber i 6 timer (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO 2) og bagefter gå videre til serum sult (Inkubér ON).
- Fjerne medier og behandle (eller ikke behandle) i endothelial cellen kulturer med stof af interesse fortyndet i ufuldstændig medierne (Inkubér 30 min, 37 ° C), tilføje 1,4 mL/godt for 6-godt plade (30 min, 37 ° C).
- Udfordre cellerne ved at tilføje 100 ng/mL LP'ER rugede medierne (som beskrevet i trin 2.3) og inkuberes for 6 h. Stop reaktionen ved at vaske to gange med koldt PBS og holde pladerne på-80 ° C indtil prøven forarbejdning.
- RNA udvinding
- tø pladerne og tilsæt 1 mL/hul RNA ekstraktionsbuffer (38% phenol og 0,8 M guanidinium isothiocyanat; se tabel over materialer). Forlade i 30 min. ved stuetemperatur (RT) under agitation og indsamle homogenatet i 1,5 mL rør.
- Tilføje 200 µL chloroform og gnub forsigtigt i 15 s. Incubate for 3 min på RT og centrifuge (11,600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Overføre vandig fase til en anden 1,5 mL tube. Bundfald RNA ved at tilføje 500 µL isopropanol efterfulgt af en 10 min inkubation ved RT og derefter centrifugering (11.600 x g, 4 ºC).
- Supernatanten og vaske pellet med 75% ethanol af vortex agitation og derefter centrifugering (7.500 x g, 4 ºC).
- Lufttørre pellet og solubilize RNA i 25 µL ren H 2 O ved at inkubere for 10 min. ved 55 ° C. holde RNA ved-80 ° C indtil prøven forarbejdning.
- Antal og renhed af RNA
- kvantificere RNA-koncentrationen ved at måle Absorbansen for prøven på 260 nm i et spektrofotometer (Se Tabel of Materials).
- Foranstaltning på 230 nm og 280 nm at bestemme RNA renhed.
Bemærk: Ratio på 260/280 angiver protein eller phenol forurening. Forholdet tæt på 2 er acceptabel. Forholdet på 260/230 angiver EDTA, kulhydrater eller phenol forurenende stoffer. Værdier mellem 2,0-2,2 accepteres.
- Kontrol RNA integritet
- kører 2 µg total RNA og en RNA stige på en 1,5% denatureringen agarosegel; visualisere på en gel dokumentationssystem (Se Tabel of Materials).
Bemærk: En 2:1 ratio af klare og skarpe 28S og 18S rRNA bands angiver en intakt RNA. Delvist nedbrudt RNA løser som en smurt udseende.
- kører 2 µg total RNA og en RNA stige på en 1,5% denatureringen agarosegel; visualisere på en gel dokumentationssystem (Se Tabel of Materials).
- RT-qPCR
- syntetisere den supplerende DNA (cDNA) fra en enkelt strandede RNA efter standarden protokol (Se Tabel af materialer) 11.
- Evaluer genekspression af RT-qPCR
- forberede reaktionsblandingen til hver prøve: Bland 2 µL cDNA, 7 µL fluorescerende stof, 300 nM fremad primer og 300 nM omvendt primer (tabel 1) i en endelige volumen af 13 µL, og tilføje til 96-brønd reaktion plade (Se Tabel of Materials).
- Forsegle pladen med en optisk klæbende cover, centrifuge (300 x g, 1 min) og køre reaktionen på en Real-Time PCR System (hot start 95 ° C til 20 s efterfulgt af 40 cyklusser: 95 ° C til 3 s og 60 ° C i 30 s) (Se Tabel of Materials).
- Analysere resultaterne af relative kvantificering ved hjælp af komparativ metode 2 -ΔΔCt med husholdning gener glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) eller sure ribosomale phosphoprotein P0 (36B4) 12 .
4. Vurdere endotel aktivering ved flowcytometri
- behandling af MLEC-04 celler efter de betingelser, der er beskrevet i afsnit 2 og vurdere ændringer i endothelial overflade proteiner ved flowcytometri.
- Frigør celler efter 6 h af LP'ER stimulation med trypsin-EDTA metode beskrevet i trin 1.2.3, og vask med ufuldstændige medierne på 4 ° C.
- Tælle celler ved hjælp af metoden Neubauer kammer og læg 10 x 10 4 celler i u-bundplade 96-brønd. Centrifuge (300 x g, 5 min) og Fjern supernatanten ved en 180° snap af håndled fra top til bund og hurtig genopretning til den oprindelige position.
- Tilsæt 50 µL af den valgte antistof fortyndet i ufuldstændig medierne (10 µg/mL, endelige koncentration) til cellerne og inkuberes (30 min, 4 ° C).
- Vaske cellerne dobbelt wITH ufuldstændige medierne efter fremgangsmåden i trin 4.3, og inkuberes med 50 µL på 10 µg/mL af den tilsvarende sekundær antistof koblet til FITC eller en lignende konjugat (30 min, 4 ° C i et mørkt rum).
- Vaske cellerne en gang med ufuldstændige medierne efterfulgt af en PBS vask. Genoprette cellerne med 300 µL PBS ved hjælp af 1 mL pipette tips og placere i flowcytometri rør.
- Evaluere prøverne i flow flowcytometri system (Se Tabel af materialer). Justere cellen befolkningen frem og side spredning parametre. Gate befolkningens interesse. Justere gates baseret på den negative kontrol fra cellerne inkuberes med isotype kontrol. Analysere resultaterne som procentdelen af positive celler eller betyde fluorescens intensitet 8.
5. Evaluere endotel aktivering af Western Blot
- frø endotelet på sub confluence i 6-og kultur plader (7 x 10 5 celler/brønd) og behandler med LP'ER, som beskrevet i afsnit 2. Analysere det inflammatoriske proteiner udtryk ved følgende vestlige skamplet protokol.
- Stoppe LP'ER stimulation på forskellige tidspunkter at belyse forskellige aspekter af i endothelial svar:
- konstatere det inflammatoriske proteiner profil efter 6 h af LP'ER stimulation.
- Bestemmer den celle signalering hver 15 min gennem en 60 min periode.
- i begge tilfælde, stoppe reaktionen ved at vaske to gange med koldt PBS og gemme prøver på-80 ° C indtil prøven forarbejdning.
- Lyse celler og protein udvinding
- tilføje 200 µL lysis buffer til hver brønd (1% nonioniske overfladeaktive, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM natriumchlorid, 30 mM natrium pyrofosfat, 50 mM natriumfluorid, 2,1 mM natrium orthovanadate på pH 7,6, suppleret med protease hæmmer cocktail) (se tabel over materialer).
- Inkuber 15 min. ved 4 ° C under agitation, skrabe brønde med en pipette spids og indsamle homogenatet i 1,5 mL rør.
- Centrifugeres rør på 11.600 x g ved 4 ° C.
- Gemme supernatanten i ren 1,5 mL rør ved-80 ° C indtil forarbejdning.
- Foranstaltning proteinkoncentration af bicinchoninic syre analysen efter standarden protokol (se tabel over materialer) 13.
- Løse de 30 µg af total protein lysate for hver prøve af en standard teknik, 0,1% dodecyl natriumsulfat, 10% polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) 14. Køre prøver med 10 mM β-mercaptoethanol (reducerende forhold) eller uden (ikke-reducerende forhold) afhængigt af antistof anvendes til påvisning af protein interesse.
- Overføre de adskilt proteiner fra polyacrylamid gel til en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) overførsel membran med 0,45 µm porestørrelse ved hjælp af standardproceduren.
- Efter overførslen, vaske membran to gange med PBS, 0,1% Polysorbat-20 (PBS-T) og blokere uspecifik bindingssteder ved at tilføje 20 mL 2% BSA fortyndes i PBS-T for detekterede fosfoproteiner eller 5% fedtfrit tørt mælk i PBS-T for samlede proteiner, under omrøring (90 min, RT).
- Fortyndes den valgte antistof i 10 mL af den passende blokerende buffer på den anbefalede koncentration og inkuberes membranen under agitation (ON, 4 ° C). Alternativt kan du placere membranen i forseglede plasticposer og anvendes 5 mL af det fortyndede antistof.
- Næste dag, vaske membranen, tre gange (overskydende PBS-Thomsen, 15 min, RT).
- Incubate membranen under agitation (30 min, RT) med 10 mL af den korrespondent sekundær antistof bundet til peberrodsperoxidase (HRP) fortyndes på 1:10,000 i den relevante blokerende buffer.
- Vaske membran tre gange under agitation (overskydende PBS-Thomsen, 15 min, RT).
- Inkuberes membran for 1 min med 0,1 mL/cm 2 af peroxidase substrat forbedret kemiluminescens (ECL). Placere den drænede membran mellem to gennemsigtige plast plader, og Indsæt det i kemiluminescens detection system, som omfatter en Charged-Coupled enhed kamera (CCD).
- Bruger CCD kamera til at registrere et signal og dets software til at optage billeder med programmet akkumulerende (billeder vises akkumulerede signal på hver 30 s eksponering for en total 15 min periode).
- Kvantificere band intensiteten af densitometri bruger ImageJ software efter protokollen beskrevet i user guide 15.
- Åbne prøven i ImageJ software og vælg band af interesse med rektangulære markeringsværktøj.
- Vælg som den første lane og tryk plot baner for at få profil plots.
- Afgrænser området i toppe med lineær udvælgelse.
- Måler størrelsen af hver band ved at klikke på indersiden af hver top.
- Repræsenterer resultater for så vidt angår lastning protein kontrol (β-actin, tubulin, etc.).
6. Evaluere endotel faktor frigivet fra leukocyt aktivering af adhæsion Assays
- få i endothelial konditioneret medierne.
- Behandle MLEC-04 celler som anført i afsnit 2 og indsamle kultur supernatanten efter 24 h stimulation med LP'ER (100 ng/mL).
- Indsamle konditioneret medier behandlet MLEC-04 celler og centrifuge (600 x g). Holde supernatanten i 0,5 mL alikvoter ved-80 ° C indtil brug.
- Leukocyt adhæsion assay
- frakke 96-brønd plader med 50 µL/brønd af valgte ekstracellulære matrix proteiner fortyndes i PBS (med undtagelse af kollagen, som er fortyndet i 0,1 M eddikesyre): fibronektin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL) og kollagen type jeg (10-40 µg/mL). Orlov på ved 4 ° C.
- Slette coated medierne og blokere uspecifik bindingssteder på brønde med 150 µL PBS, 1% BSA varme-inaktiverede (1 min, 100 ° C) i 90 min. på RT.
- Brøndene vaskes to gange med PBS og tilsæt 100 µL af tidligere indsamlede endotel aircondition medier (afsnit 6.1) brønde.
Bemærk: Plader er klar til at udføre vedhæftning assay. - Kultur mus monocyt-makrofager cellelinje J774 i en biologisk inkubator (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO 2) med Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Bemærk: J774 cellerne vokse i suspension. - Indsamle J774 cellerne i en 15 mL rør og centrifuge (300 x g, 5 min). Supernatanten og cellulære resuspenderes med 10 mL serum-frie medier. Tælle celler i et Neubauer kammer. Centrifugeres celler (300 x g, 5 min), supernatanten og resuspend celler i serumfrit medier på 15 x 10 4 J774 celler pr. 50 µL media.
- Tilføj 15 x 10 4 J774 celler til hver godt i 50 µL serum-frie medier og Inkuber i 15 min. ved 4 ° C efterfulgt af 1 h ved 37 ° C i CO 2 celle inkubator.
- Brøndene vaskes to gange, forsigtigt ved at tilføje varm PBS; centrifugeres (300 x g, 5 min) og kassér supernatanten ved en 180° snap af håndled fra top til bund og hurtig genopretning til den oprindelige position. Lave den tilknyttede celles ved at tilføje 100 µL/brønd af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS og inkuberes (10 min, RT).
- Kassere medierne forsigtigt og permeabilize celler med 2% methanol i PBS for 2 min på RT. udsmid medierne forsigtigt og plette cellerne ved at tilføje 50 µL/brønd af 0,5% krystalviolet i 20% methanol til 90 s på RT.
- Vaske pladen med rigelige rindende vand, skille sig af med den overskydende væske og lad det lufttørre. Rapport de tilknyttede celler af digital kamera, koblet til et lysmikroskop.
- Fortyndes cellen farvning ved at tilføje 100 µL/brønd af 0,1 M natriumcitrat, 50% ethanol. Foranstaltning absorbans på 545 nm og repræsenterer resultaterne som arbitrære enheder af absorbans eller procentdel af vedhæftning af overvejer 100% som celle vedhæftning nåede brønde belagt med højere ligand koncentration
7. Teste endotel aktivering af leukocyt-endotelet Co vedhæftning Assay
- behandle MLEC-04 celler på 96-brønd plader som beskrevet i afsnit 2 og inkuberes med LP'ER (6 h, 37 ° C).
- Fluorescently mærke J774 celler med Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
- Vask J774 celler i PBS efter proceduren i punkt 6.2.5. Tæller cellerne af Neubauer kammer metode og resuspend på 1 x 10 6 celler/mL i PBS, 0,1% BSA.
- Ruger celler med CFSE (5 µM, endelige koncentration) i 20 min. på 37 ° C. tilføje 5 mL ufuldstændige medier og inkuberes (5 min, 4 ° C).
- Vaskes en gang med ufuldstændige medier som forklaret i punkt 6.2.5. resuspend på 15 x 10 4 celler/100 µL og fortsætte med at co vedhæftning assay.
- Efterbehandling endotelet brøndene vaskes tre gange med ufuldstændige medier. Tilføje CFSE-J774 celler (15 x 10 4 celler/100 µL) til hver endotel-belagt godt. Inkuber plade i 10 min. ved 4 ° C efterfulgt af 60 min. ved 37 ° C.
- Brøndene vaskes forsigtigt, som beskrevet i 6.2.7., ved hjælp af varmede PBS og rapportere J774 vedhæftning i endothelial laget af følgende to metoder:
- Lyse celler i 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µL/brønd) og måle den CFSE-J774 signal ved fluorometry (excitation/emission = 492 nm/517 nm). Repræsenterer resultaterne som arbitrære enheder af fluorescens intensitet eller procentdel af vedhæftning med hensyn til positiv kontrol (signal fra samlede celler føjes til hver brønd).
- Fix celler i 4% PFA og betænkningen fastgørelse af CFSE-J774 celler til endotelet ved at visualisere under et fluorescens mikroskop (excitation/emission = 492 nm/517 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluering af LPS-induceret endotel celle aktivering af RT-qPCR
Serum hungrende MLEC-04 celler blev stimuleret af 100 ng/mL af LP'ER til 6 h, og i endothelial genekspression blev vurderet ved hjælp af RT-qPCR ved at sammenligne udtryk for aktivering markører til den hvilende tilstand. Som vist i figur 1A, inducerede LPS-rugede MLEC-04 celler mRNA udtryk for valgte adhæsionsmolekyler involveret i leukocyt ansættelse under den inflammatorisk respons (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1). PECAM-1 blev brugt som en intern kontrol, fordi udtrykket er uændret under denne eksperimentelle behandling. Figur 1B repræsenterer i endothelial aktivering af LP'ER målt ved den øget mRNA ekspression af cytokiner Ccl5, Cxcl10 og Cxcl1. Disse molekyler er involveret i aktivering af cirkulerende leukocytter, herunder deres handel endotel lag og senere ekstravasation til webstedet betændelse. Cytokin, IL4, blev brugt som en intern kontrol under denne eksperimentelle behandling.
Figur 1: evaluering af LPS-induceret endothelial celler aktivering af RT-qPCR. Den MLEC-04 celler blev stimuleret med 100 ng/mL af LP'ER til 6 h (røde søjler) i forhold til kontrol tilstand (blå søjler), og Gen-ekspression blev analyseret af RT-qPCR. Grafer viser fold induktion af mRNA med hensyn til kontrol tilstand af valgte endotelial adhæsionsmolekyler (A), og cytokiner (B) involveret i leukocyt aktivering og rekruttering under den inflammatorisk respons. PECAM-1 og IL4 blev brugt som negative kontroller under denne betingelse. Resultaterne udtrykkes som betyder ± SEM fra et eksperiment, ud af tre udføres, udført i tre eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Protein udtryk af adhæsionsmolekyler på LPS-behandlede endotelceller
Inflammatorisk stimulation blev udført på MLEC-04 celler som beskrevet i det forrige afsnit og protein udtryk blev undersøgt af vestlige skamplet teknik. Hvilende endotelet præsenterer næsten målbart niveauer af adhæsionsmolekyler VCAM-1 og ICAM-1 (mærket som-). I nærværelse af LP'ER (+) fremgår i endothelial aktiveret fænotype af opregulering af udtryk for de beskrevne markører (figur 2). Membraner var normaliseret af β-actin opdagelse, som blev brugt som lastning kontrol til at beregne relative band tætheder efter densitometri analyse.
Figur 2: Protein udtryk af adhæsionsmolekyler på LPS-behandlede endotelceller. Repræsentative vestlige skamplet vurderende VCAM-1 og ICAM-1 protein udtryk i hvile (-) i forhold til LP'ER-behandlede (+) MLEC-04 celler. Β-actin blev brugt som en loading kontrol. Molekylevægt af hvert protein er i parentes. Værdierne repræsenterer semi-kvantificeringen af relative band tætheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Endotel overflade markører i LPS-medieret betændelse
I endothelial aktivering i forbindelse med inflammatoriske blev evalueret ved flowcytometri efter 6 timers-stimulation af LP'ER (100 ng/mL). I denne tilstand, blev påvisning af lim-relaterede molekyler involveret i leukocyt interaktion evalueret. Panelet til venstre på figur 3A repræsenterer basal udtryk for de angivne markører i de hvilende MLEC-04 celler (rød-solid histogram) i forhold til isotype negativ kontrol (black-punkteret histogram). Det højre panel i figur 3A viser resultaterne stammer fra stimuleret MLEC-04. LP'ER behandling betydeligt upregulated udtryk af adhæsionsmolekyler E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1 i plasma membran (rød-solid histogram) i forhold til den hvilende tilstand (black-punkteret histogram). Som vist i flowcytometri profiler og nævnt før udtryk af PECAM-1 er uændret i denne eksperimentelle tilstand. Figur 3B viser kvantificering værdier bruges som referencer til at vurdere mulige mediatorer af i endothelial inflammatorisk reaktion. %: procentdelen af positive celler; MFI: betyde fluorescens intensitet.
Figur 3: endotel overflade markører i LPS-medieret betændelse. Flow flowcytometri profiler af celle adhæsionsmolekyler på hvile og LP'ER-stimuleret MLEC-04 celler. Panelet til venstre viser protein udtryk på resting celler (Antigen mærket røde histogram) med hensyn til isotype matchede kontrol (Ctrl-sort histogram). Højre panel sammenligner kontrol celle-overflade proteiner udtrykket (sort histogrammer) til LP'ER-behandlede endotelceller (rød histogram). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Signalering veje udløst af LP'ER stimulation i endothelial celler
De mekanismer involveret i aktiveringen af vaskulære rum under betændelse er undersøgt ved at evaluere vigtig signalfunktion molekyler. MLEC-04 celler stimuleret med LPS i forskellige perioder blev behandlet for protein udvinding, og graden af aktivering blev analyseret af vestlige skamplet teknik. Figur 4 viser, at IκB-α repressor af NF-κB signalering er fosforyleret efter 15 min LPS-inkubation, og vender tilbage til basal niveauer efter 1 time. På den anden side LP'ER aktiveres ERK 1/2 signalering efter 15 min, som fastlægger en afgørende pathway involveret i endothelial aktivering under den inflammatorisk respons. Membraner var normaliseret af β-actin eller ERK påvisning af 1/2, som blev brugt som lastning kontrolelementer til at beregne relative band tætheder efter densitometri analyse.
Figur 4: signalering veje udløst af LP'ER på endotelceller. MLEC-04 celler stimuleret med 100 ng/mL af LPS for tiden angivet i figur og signalering veje ERK 1/2 (P-ERK 1/2) og NF-kB (gennem P-IκBα) blev evalueret af vestlige skamplet. ERK 1/2 total og β-actin blev brugt som indlæse objekter i hver tilstand. Molekylvægt for hvert protein er i parentes. Værdierne repræsenterer semi-kvantificeringen af relative band tætheder. Venligst klik her for at se en større version afdenne figur.
Regulering af leukocyt opførsel af endotel stimuleret med LP'ER
Biologisk relevans i forordningen i endothelial aktivering på progression af den inflammatoriske reaktion bestemmes af funktionelle assays af leukocyt ydeevne. Som beskrevet i afsnittet protokol, er to forskellige tilgange inkluderet for at teste leukocyt funktion reguleret i endothelial celler. Selv om assays afhøre forskellige aspekter af det inflammatoriske respons (RT-qPCR i endothelial cytokiner udgivet af leukocyt aktivering og vestlige skamplet for endotelial adhæsionsmolekyler i leukocyt interaktion), er de data, der begge evaluere mikroskopiske detaljer af leukocyt vedhæftet fil. Leukocyt aktivering af endotelial opløselige faktorer er afgørende for at udvikle en effektiv inflammatorisk reaktion, så det favoriserer celle vedhæftning til flere substrater. Fig. 5A viser J774 celle vedhæftning til 0,5 µg/mL fibronektin coatede brønde som svar på tidligere indsamlede konditioneret medier fra kontrolelementet eller LPS behandlede endotelceller. Lysfelt billeder og spektrofotometriske målinger viser, at de faktorer, der er udgivet i konditioneret medierne fra LP'ER-behandlede endotelet er tilstrækkelige til effektivt fremkalde J774 aktivering, som det fremgår af induktion af celle tilknytning til fibronektin. Figur 5B repræsenterer en co vedhæftning assay at evaluere det vaskulære lag evne til at støtte leukocyt fast vedhæftning af den roman udtryk i endothelial adhæsionsmolekyler. Kort, serum hungrende subconfluent kulturer af MLEC-04 celler stimuleret med LP'ER til 6 h blev skyllet flere gange og co inkuberes med linjen leukocyt J774 tidligere mærket med fluorescerende sonden, CFSE. Som vist i micrographs og spectrofluorometric målinger, favoriserer LPS-kar stimulering samspillet mellem CFSE-J774 celler til i endothelial éncellelag.
Figur 5: leukocyt interaktion til LP'ER-rugede endotel éncellelag af co vedhæftning assay. (A) lysmikroskopi billeder viser krystalviolet farvning af de J774 celler knyttet til 0,5 µg/mL fibronektin coatede brønde i svar til konditioneret medier fra kontrol eller LPS-behandlede endotelceller. Skalalinjen, 50 µm. De spektrofotometriske analyse vist nedenfor angiver absorbans måling udtrykt som arbitrære enheder (a.u.) ± SEM til en repræsentativ eksperiment kører i tre eksemplarer. (B) Fluorescens micrographs Vis knyttet CFSE-J774 celler til kontrol eller LPS-behandlede MLEC-04 celler evalueret af co vedhæftning assay. Skalalinjen = 50 µm. Den fluorometriske analyse vist nedenfor viser fluorescens-intensiteten udtrykt som arbitrære enheder (a.u.) ± SEM til en repræsentativ eksperiment kører i tre eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Target | NCBI RefSeq ID | Videresende sekvens (5´-3´) | Omvendt rækkefølge (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ACT GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA FTT TGC CCA CAG FTT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC KAT CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG KAT CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selectin | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT FTT C |
Tabel 1: Liste over primere, der anvendes i denne undersøgelse.
| Hvile | LP'ER | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| CTRL | 1,79 | 3.5 | 0,55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12,24 |
| E-selectin | 17,12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
Tabel 2: endotel overflade markører i LPS-medieret betændelse. Kvantificering af celle vedhæftning molekyler udtryk på de hvilende og LP'ER-stimuleret MLEC-04 celler ved flow flowcytometri analyse. De repræsentative værdier for hver markør, svarende til procentdelen af positive celler (%) og de gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) i hvile og LP'ER-stimuleret endotelceller. PECAM-1 blev brugt som en negativ kontrol disse eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne endotel protokol beskriver en trinvis teknologi, der fastlægger grundlaget for at udforske nye mekanismer involveret i reguleringen af det inflammatoriske respons. Disse tilgange er baseret på undersøgelse af i endothelial aktivitet stimuleres af LP'ER og vurdere de kritiske trin involveret i leukocyt ansættelse under den inflammatorisk respons, specifikt: endotel cytokiner frigivelse, endotel vedhæftning molekyler udtryk og leukocyt adhæsion til det vaskulære lag. Når der i endothelial parametre er oprettet, systemet kan søge efter nye forbindelser involveret i reguleringen af endotelfunktion og derfor inflammatoriske progression. Disse regulerende stoffer kan potentielt være af interesse for den farmaceutiske marked. Den store projektion af denne sekventiel protokol er at etablere et fundament for at udvide disse undersøgelser til forskellige endotel typer og stimulerende betingelser ved at justere deres relative vaskulære aktivitet parametre.
Stoffer udvalgt af denne screening vil udgør interessante kandidater til at designe nye terapeutiske strategier mod inflammatoriske lidelser. På den ene side vil de forbindelser, der går ind i endothelial svar og bidrage til leukocyt ansættelse være lovende for immundefekt betingelser16,17. På den anden side ville i endothelial hæmmere udgør fremragende behandlingsformer for kroniske inflammatoriske sygdomme10.
Karakterisering af cytokiner udtrykt ved stimuleret endotelet forudsiger udviklingen af betændelse. Cytokiner er små proteiner udgivet af i endothelial lag i forbindelse med inflammatoriske og regulere stærkt leukocyt adfærd. Pro-inflammatoriske medlemmer, såsom Ccl5, Cxcl10 og Cxcl1, binde sig til deres specifikke receptorer på leukocyt overflade og signalere at fremkalde leukocyt interaktion med de nyligt udtrykte adhæsionsmolekyler på det vaskulære lag (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1), og leukocyt migration til patologiske område (figur 1, figur 2, figur 3)8,10,18. Andre medlemmer af samme familie af proteiner er involveret i løsningen af betændelse og dermed væv reparation. Udtryk for disse anti-inflammatoriske cytokiner er relevante for kroniske inflammatoriske sygdomme, fordi de hindrer leukocyt rekruttering og favorisere immunitet clearance10,19,20. For at vælge mulige endotel inflammatoriske regulatorer, anbefales det at udføre denne cytokin udtryk assay og evaluere udtrykket endotel vedhæftning molekyler i overværelse af forbindelser af interesse. I virkeligheden, analysere niveauer mellem anti-inflammatorisk versus pro-inflammatoriske cytokiner kan bruges som en prædiktiv værdi for progression af sygdommen og afslører stof af terapeutisk interesse21.
LP'ER bindende til sin celle overflade receptor udløser komplekse intracellulær signalering cascades ledet af kort kinaser ERK 1/2, LUCY, og p38 og NF-kB signalosome til at fremkalde den inflammatoriske transcriptional program. Mange af disse veje er fælles for andre inflammatoriske stimuli som TNF-α eller IL-110,22. I endothelial aktivering bestemmes ved at afsløre fosforyleres form af kort kinase medlemmer som vist for ERK 1/2 i figur 4. Derudover i endothelial aktivering af LP'ER inducerer enzymatisk aktivitet af IKKβ komplekse, som phosphorylates og nedbryder NF-kB inhibitoren komplekse IκB, således at NF-kB effektor medlemmer af nukleare translokation til at udføre korrespondent transkriptionel aktivitet (figur 4). Kendetegner de mekanismer, som påvirker stof sammensat i endothelial inflammatorisk respons er meget nyttig, ikke kun i beskriver stoffet, men også i designe roman inflammatoriske behandlinger i kombination med kompatible konventionelle behandlingsformer 23.
Forbindelser vælges i endothelial inflammatoriske screening-assays, skal undersøges yderligere for at bekræfte deres funktionelle relevans i de kritiske faser af leukocyt adfærd assays, som i sidste ende, cellerne er ansvarlige for de inflammatoriske lidelser. Disse assays analysere leukocyt aktivitet i to forskellige eksperimentelle indstillinger. Først er evaluere rolle i endothelial-udgivet cytokiner på leukocyt aktivering af integrin-medieret vedhæftning assays. Leukocyt integriner er aktiveret i endothelial frigivne cytokiner. Leukocyt selvklæbende evne til integrin ligander er således en repræsentativ måling for leukocyt funktion8,10,18. Andet er at studere rollen, som de nyligt udtrykte endotelial adhæsionsmolekyler på leukocyt samspillet til det vaskulære lag af co vedhæftning assays. I endothelial adhæsionsmolekyler udtrykt i den inflammatoriske forbindelse er afgørende for leukocyt rekruttering til det omgivende væv. Således udgør analysere leukocytter interagere med i endothelial-behandlede éncellelag af celler en prognostiske værdi for inflammatoriske progression (figur 5)8,10,18. Resultaterne stammer fra disse tilgange vil foreslå, at de valgte stoffer er seriøse kandidater i udformningen af fremtidige strategier til behandling af inflammatoriske lidelser
Forslagets eksperimentelle defineret her er et alsidigt værktøj til fremtidige ansøgninger på grund af dens evne til at ekstrapolere til forskellige cellulære eller stimulerende systemer. Proceduren kan ændres til endotelet fra forskellige oprindelser eller arter, og at afprøve sin funktionalitet på flere immunceller samt forskellige inflammatoriske stoffer såsom LP'ER, TNF-α, bakterier, virus, osv. Som beskrevet i teksten, skal forskerne først karakteriserer i endothelial aktivering i deres eget system til senere karakterisere rollen af en valgte sammensatte på det inflammatoriske respons. Begrænsninger i protokollen er udvælgelsen af en passende negativ kontrol og definere præcist endotel aktivitet parametre, at skelne hvile fra stimuleret tilstand. I tilfælde af at betingelserne beskrevet i denne hvidbog ikke arbejder for et andet system, skal forskere fejlfinding de eksperimentelle parametre ved at udføre yderligere tidsafhængig assays og ved hjælp af en koncentration gradient af den inflammatoriske stimulus til at definere en stimulerende vindue, der giver mulighed for at teste nye medikamenter for reguleringen af det inflammatoriske respons.
Afslutningsvis anbefales denne endotel inflammatoriske protokol til søgning af nEW endotel regulatorer rettet mod det inflammatoriske respons. Udføre denne procedure vil give roman, interessante forbindelser, der kan anvendes til at studere dens fremtidige anvendelser og designe innovative kar-specifikke behandlinger mod inflammatoriske-relaterede sygdomme, og som potentielt kunne være af interesse for det farmaceutiske marked.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) og Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (grant nummer IERPY 1149/16 til A.L.; MPY 1410/09 til S. Hortelano); af MINECO gennem Fondo de Investigación da Salud (FIS) (tilskud numre PI11.0036 og PI14.0055 til S. Hortelano). S. Herranz blev støttet af IERPY 1149/16 fra ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z.
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
