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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

स्क्रीनिंग परख के लिए उपंयास Endothelial भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल नियामकों विशेषताएं

Published: September 15, 2017 doi: 10.3791/55824
Automatic Translation
1, 1, 1, *1, *1
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III
* These authors contributed equally

Summary

संवहनी endothelium कस नियंत्रण ल्युकोसैट भरती. अपर्याप्त ल्युकोसैट extravasation मानव भड़काऊ रोगों के लिए योगदान देता है । इसलिए, endothelial सक्रियण के उपंयास विनियामक तत्वों के लिए खोज भड़काऊ विकारों के लिए बेहतर चिकित्सा डिजाइन करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक व्यापक पद्धति का वर्णन उपंयास endothelial नियामकों कि सूजन के दौरान ल्युकोसैट ्े संशोधित कर सकते है विशेषताएं ।

Abstract

endothelial परत कई विभिंन कार्यों को नियंत्रित करने से शरीर में homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक है । endothelial परत द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रिया का विनियमन कुशलतापूर्वक क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की वसूली में हानिकारक आदानों और सहायता के खिलाफ लड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । जब endothelial कोशिकाओं को एक भड़काऊ वातावरण के लिए उजागर कर रहे हैं, जैसे कि ग्राम के बाहरी घटक-नकारात्मक बैक्टीरिया झिल्ली, lipopolysaccharide (एलपीएस), वे घुलनशील समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, जैसे Ccl5, Cxcl1 और Cxcl10 एक्सप्रेस, और ट्रिगर परिचालित ल्यूकोसाइट्स का सक्रियकरण । इसके अलावा, आसंजन के अणुओं की अभिव्यक्ति ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1 endothelial सतह पर ल्यूकोसाइट्स परत करने के लिए सक्रिय endothelial के संपर्क और आसंजन सक्षम बनाता है, और अंततः सूजन ऊतक की ओर extravasation । इस परिदृश्य में, endothelial फ़ंक्शन कसकर विनियमित किया जाना चाहिए क्योंकि ल्युकोसैट भर्ती में अत्यधिक या दोषपूर्ण सक्रियण भड़काऊ-संबंधी विकारों के लिए नेतृत्व कर सका । के बाद से इन विकारों के कई एक प्रभावी उपचार नहीं है, संवहनी परत पर ध्यान केंद्रित के साथ उपंयास रणनीतियों की जांच की जानी चाहिए । हम व्यापक परख कि उपंयास endothelial नियामकों की खोज के लिए उपयोगी है कि ल्युकोसैट समारोह को संशोधित करने का प्रस्ताव है । हम विशिष्ट अभिव्यक्ति ल्युकोसैट भर्ती में शामिल लक्ष्यों (जैसे, साइटोकिंस, chemokines, और आसंजन अणुओं) सहित कई तकनीकों के साथ, का उपयोग करके endothelial सक्रियण का विश्लेषण: वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया ( RT-qPCR), पश्चिमी दाग, प्रवाह cytometry और आसंजन परख । इन तरीकों भड़काऊ संदर्भ में endothelial समारोह का निर्धारण और बहुत स्क्रीनिंग परख प्रदर्शन करने के लिए उपंयास endothelial भड़काऊ नियामकों कि संभावित नए चिकित्सीय रणनीतियों के डिजाइन के लिए मूल्यवान है विशेषताएं उपयोगी होते हैं ।

Introduction

सूजन संक्रामक एजेंटों के खिलाफ एक लाभकारी जैविक प्रतिक्रिया, रोगज़नक़ को खत्म करने और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत करने के लिए प्रमुख उद्देश्य के साथ है । कुछ शर्तों के तहत, जैसे जीर्ण संक्रमण या स्व-प्रतिरक्षित रोग, सूजन का समाधान नहीं है । इसके बजाय, वहां ल्यूकोसाइट्स के निरंतर घुसपैठ के साथ एक ंयायपालिका प्रतिक्रिया है, एक लंबे समय तक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि ऊतक नुकसान, फाइब्रोसिस, समारोह की हानि, और समग्र, विकलांगता और कुछ मामलों में रोगी की मौत की ओर जाता है में जिसके परिणामस्वरूप । इन मानव विकारों, भड़काऊ रोगों के रूप में सूचीबद्ध, सभी ल्युकोसैट extravasation1,2के नियंत्रण के लिए रक्त वाहिकाओं को शामिल ।

endothelial कोशिकाओं ल्युकोसैट तस्करी को नियंत्रित करके भड़काऊ प्रतिक्रिया के विनियमन में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं । जब endothelial परत एलपीएस जैसे भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में है, आराम endothelium सक्रिय करता है और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, आदि) और आसंजन अणुओं (ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1) कि एहसान व्यक्त संक्रमण स्थल पर परिचालित ल्यूकोसाइट्स की भर्ती । ल्यूकोसाइट्स जारी साइटोकिंस तो मध्यस्थता रोलिंग और endothelial परत के साथ बातचीत के माध्यम से प्रधानमंत्री चिपकने वाला समकक्षों: PSGL-1 से selectin, α4β1 integrin को VCAM-1, और αLβ2 integrin को िकैम-1 । अंत में, ल्यूकोसाइट्स सूजन के ध्यान की ओर vasculature भर में माइग्रेट3.

भड़काऊ प्रतिक्रिया को विनियमित करने में endothelium की अनिवार्य भूमिका है कि आनुवंशिक रूप से एलपीएस रिसेप्टर, टोल रिसेप्टर 4 (TLR4) की तरह, केवल endothelial कोशिकाओं पर व्यक्त करने के लिए संशोधित किए गए चूहों पर प्रदर्शन किया गया है. इन endothelial-TLR4 जानवरों के लिए एक एलपीएस मध्यस्थता सूजन का जवाब और बैक्टीरिया टीका के बाद उत्पन्न संक्रमण का पता लगाने के लिए सक्षम थे, और नतीजतन जंगली प्रकार के रूप में समान स्तर पर संक्रमण के समाधान और अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए4 चूहों , 5.

endothelium-विनियमित भड़काऊ प्रतिक्रिया मार्ग के लिए, यह माने किया गया है कि ल्युकोसैट-endothelium बातचीत के कुछ चरणों में अवरोध ट्रांस endothelial प्रवास और एक बेहतर पूर्वानुमान के लिए की कमी में परिणाम होगा भड़काऊ रोगों से संबंधित । वास्तव में, कई endothelial सक्रियण और ल्युकोसैट-endothelium बातचीत लक्ष्यीकरण रणनीतियों भड़काऊ विकारों के लिए एक इलाज के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के extravasation में बाधा6,7डिजाइन किया गया है ।

इस रिपोर्ट में, हम पूरी तरह से इन विट्रो तकनीकों के एक संपूर्ण समूह का वर्णन करने के लिए भड़काऊ उत्तेजना एलपीएस और संवहनी परत को ल्युकोसैट सक्रियण और आसंजन में अपनी भूमिका के जवाब में endothelial गतिविधि की विशेषता । इस पांडुलिपि में इस्तेमाल endothelial सेल मॉडल का माउस लंग endothelial सेल लाइन (आशोधित-04) था, जैसा कि Hortelano एट अल ने बताया है । 8. आशोधित-04 सेल लाइन को साहित्य में मान्य किया गया है endothelial सक्रियण9,10का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त प्रणाली है । अनुसंधान के हितों के आधार पर, इन तरीकों को आसानी से किसी भी endothelial या ल्युकोसैट प्रणालियों और भड़काऊ प्रोफ़ाइल extrapolated जा सकता है । एक बार चयनित स्थितियों में endothelial मापदंडों परिभाषित कर रहे हैं, प्रणाली प्रस्तावित प्रयोग पर उपंयास दवाओं का परीक्षण करने के लिए संवहनी सक्रियण का मूल्यांकन कर सकते हैं । इस भड़काऊ संदर्भ में, endothelium कोशिकाओं की यौगिक के साथ परीक्षण किया जा सकता है की तुलना में ब्याज की कोशिकाओं के नियंत्रण की स्थिति है, और किसी भी परिणामस्वरूप मतभेद के विकास और सूजन की प्रगति पर दवा के शकुन परिणाम को सूचित कर सकते हैं । समाप्त करने के लिए, हम एक प्रासंगिक प्रणाली endothelial कोशिकाओं है, जो उपंयास संवहनी भड़काऊ-संबंधित रोगों के खिलाफ विशिष्ट चिकित्सा के डिजाइन को प्रभावित कर सकते है के लिए नई दवा लक्ष्यों को चिह्नित करने का प्रस्ताव ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Endothelial सेल कल्चर

  1. ऊतक संस्कृति इलाज प्लेटें
    1. कोट १०० मिमी ऊतक संस्कृति प्लेटें २.५ मिलीलीटर जिलेटिन समाधान के साथ (autoclaved, ०.१ आसुत जल में% जिलेटिन) 30 मिनट के लिए ३७ & #176; C; इस आवश्यक अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए extrapolated जा सकता है । महाप्राण जिलेटिन समाधान और प्लेटें एयर सूखी ऊतक संस्कृति हूड में छोड़ दें ।
  2. टिशू कल्चर की स्थितियां
    1. एक जैविक मशीन के अंदर आशोधित-04 कोशिकाओं की खेती (३७ & #176; C, ९५% आर्द्रता, 5% कं 2 ). Dulbecco & #39 के पूर्ण मीडिया में कोशिकाएं उगाना; s संशोधित ईगल मध्यम: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/एफ 12) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और १०० इकाइयों के साथ पूरक/एमएल पेनिसिलिन और १०० & #181; g/ml streptomycin (P/s).
    2. मानक Neubauer चैंबर विधि द्वारा कोशिकाओं की गणना, और १०० मिमी जिलेटिन-इलाज प्लेटों में 10 मिलीलीटर पूरा मीडिया में आशोधित-04 कोशिकाओं को जोड़ने, 2-11 x 10 4 कोशिकाओं/मुख्यमंत्री 2 के एक कम घनत्व पर । जब वे संगम तक पहुंचने 1:3 कोशिकाओं भाजित ।
      नोट: आमतौर पर यह संस्कृति में दो से तीन दिनों के बाद होता है.
    3. उपसंस्कृति 10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट के साथ प्लेटें धोने के द्वारा कोशिकाओं को बफर खारा (पंजाब) 2 मिलीलीटर trypsin-EDTA समाधान (०.२५% trypsin, 5 मिमी EDTA) और 3 मिनट के लिए मशीन जोड़ने के बाद ३७ & #176; C.
    4. trypsin-EDTA प्रतिक्रिया बंद करो और 10 मिलीलीटर पूरा मीडिया जोड़कर निलंबित कोशिकाओं को ठीक । कोशिकाओं नीचे स्पिन (३०० एक्स जी, 5 मिनट), supernatant त्यागें, पूरा मीडिया और उपसंस्कृति में सेलुलर गोली उचित रूप से स्थगित ।
< p class = "jove_title" > 2. एलपीएस उपचार और मध्यस्थों

  1. प्लेट उप-संगम पर पूरा मीडिया में आशोधित-04 कोशिकाओं को निंनलिखित अच्छी तरह से प्रारूप में: 7 x 10 5 कोशिकाओं पर/अच्छी तरह से 6 पर प्लेटें और २.५ x 10 5 कोशिकाओं/अच्छी तरह से ९६ पर प्लेटें ।
  2. एक सेल मशीन में 6 ज के लिए संस्कृति की मशीन (३७ & #176; सी, ९५% आर्द्रता, 5% कं 2 ) । अपूर्ण मीडिया (DMEM-F12, P/S) में कक्ष स्विच करें और सिंक्रनाइज़ करने के लिए और कक्ष गतिविधि को कम करने के लिए रातोंरात (चालू) छोड़ें ।
  3. (या बिना) प्रश्न में दवा ( उदा) के साथ endothelial कोशिकाओं की मशीन द्वारा मीडिया और परीक्षण उपंयास औषधीय यौगिकों को दूर । DT 10 ) पतला में अधूरा मीडिया (30 min, ३७ & #176; C); जोड़ १.४ एमएल/अच्छी तरह से 6-खैर प्लेट या ०.१४ के लिए एमएल/९६-अच्छी तरह से प्लेटें) के लिए ।
  4. एक परख में निर्दिष्ट समय की अवधि के लिए मशीन मीडिया (१०० एनजी/एमएल, अंतिम एकाग्रता) को एलपीएस जोड़कर कोशिकाओं को चुनौती । एक नियंत्रण के रूप में पंजाब का उपयोग करें ।
< p class = "jove_title" > 3. Transcriptional प्रोफाइल का मूल्यांकन आरटी द्वारा आपन Endothelium पर-qPCR

  1. बीज आशोधित-04 कोशिकाओं में उप संगम पर 6 में अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट्स (7 x 10 5 कोशिकाओं/ 6 घंटे के लिए मशीन (३७ & #176; सी, ९५% आर्द्रता, 5% कं 2 ) और बाद में सीरम भुखमरी (पर गर्मी) के लिए आगे बढ़ना ।
  2. मीडिया को हटाने और इलाज (या इलाज नहीं) अधूरा मीडिया में पतला ब्याज की दवा के साथ endothelial सेल संस्कृतियों (30 मिनट की मशीन, ३७ & #176; ग); इसमें 6-वेल प्लेट के लिए १.४ mL/खैर (30 min, ३७ & #176; c).
  3. (के रूप में २.३ कदम में वर्णित) १०० एनजी/एमएल एलपीएस जोड़ने के द्वारा कोशिकाओं को चुनौती है और 6 घंटे के लिए मशीन के लिए ठंडा पंजाबियों के साथ दो बार धुलाई द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो और पर प्लेट रखने-८० & #176; C जब तक नमूना प्रसंस्करण.
  4. आरएनए निष्कर्षण
    1. गल प्लेटें और 1 मिलीलीटर जोड़ें/अच्छी तरह से आरएनए निष्कर्षण बफर (३८% phenol और ०.८ एम guanidinium isothiocyanate; सामग्री की तालिका देखें) । आंदोलन के तहत कमरे के तापमान (आरटी) में 30 मिनट के लिए छोड़ दो और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में homogenate इकट्ठा ।
    2. Add २०० & #181; एल क्लोरोफॉर्म और आंदोलन के लिए धीरे से 15 एस. आरटी पर 3 मिनट के लिए मशीन और केंद्रापसारक (११,६०० x g, 15 मिनट, 4 & #176; C).
    3. एक और १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए जलीय चरण हस्तांतरण । हाला आरएनए जोड़कर ५०० & #181; L isopropanol आरटी में एक 10 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया और फिर केंद्रापसारक (११,६०० x g, 4 & #176; C).
    4. त्याग supernatant और भंवर आंदोलन द्वारा ७५% इथेनॉल के साथ गोली धोने और फिर केंद्रापसारक (७,५०० x g, 4 & #176; C).
    5. एयर ड्राय द गोली और solubilize आरएनए इन 25 & #181; L शुद्ध H 2 O के लिए मशीनिंग द्वारा 10 min at ५५ & #176; c. आरएनए पर-८० & #176; c नमूना संसाधन तक रखें ।
  5. मात्रा और आरएनए की पवित्रता
    1. एक spectrophotometer में २६० एनएम पर नमूना के अवशोषण को मापने के द्वारा आरएनए एकाग्रता को बढ़ाता है ( सामग्री की तालिका देखें).
      2. आरएनए शुद्धता निर्धारित करने के लिए २३० एनएम और २८० एनएम पर
    2. उपाय ।
      नोट: 260/280 पर अनुपात प्रोटीन या phenol संदूषण को इंगित करता है । 2 के करीब एक अनुपात स्वीकार्य है । 260/230 पर अनुपात EDTA, कार्बोहाइड्रेट या phenol संदूषणों को इंगित करता है । २.०-२.२ के बीच मान स्वीकार्य हैं ।
  6. जाँच आरएनए वफ़ादार
    1. Run 2 & #181; कुल आरएनए के जी और एक १.५% denaturing agarose जेल पर एक आरएनए सीढ़ी; एक जेल प्रलेखन प्रणाली पर कल्पना ( सामग्री की तालिका देखें) ।
      नोट: स्पष्ट और तेज 28S और 18S rRNA बैंड का 2:1 अनुपात एक अक्षुण्ण आरएनए को इंगित करता है । आंशिक रूप से नीचा आरएनए एक धब्बा उपस्थिति के रूप में हल करता है ।
  7. भ-qPCR
    1. । एक एकल कतरा आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) मानक प्रोटोकॉल निम्नलिखित (देखें सामग्री की तालिका ) < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
  8. मूल्याकंन जीन अभिव्यक्ति by RT-qPCR
    1. प्रत्येक नमूने के लिए रिएक्शन मिश्रण तैयार करें: Mix 2 & #181; l सीडीएनए, 7 & #181; एल फ्लोरोसेंट यौगिक, ३०० एनएम आगे प्राइमर, और ३०० एनएम रिवर्स प्राइमर ( टेबल 1 ) में एक अंतिम volume of 13 & #181; L, और ९६-Well reaction थाली में जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें).
    2. एक ऑप्टिकल चिपकने वाला कवर के साथ प्लेट सील, केंद्रापसारक (३०० x g, 1 min) और एक रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम पर रिएक्शन (हॉट स्टार्ट ९५ & #176; c के लिए 20 s के बाद ४० चक्र: ९५ & #176; c for 3 s और ६० & #176; c for 30 s) (देखें Table of सामग्री ).
    3. तुलनात्मक विधि का उपयोग कर सापेक्ष quantitation द्वारा परिणामों का विश्लेषण 2 -& #916; & #916; सीटी के साथ साफसफाई जीन glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) या अम्लीय राइबोसोमल phosphoprotein P0 (36B4) < सुप वर्ग = "xref" > 12 .
< p class = "jove_title" > 4. प्रवाह द्वारा Endothelial सक्रियण का आकलन करें Cytometry

  1. खंड 2 में वर्णित शर्तों के बाद आशोधित-04 कोशिकाओं का इलाज और प्रवाह Endothelial द्वारा Cytometry सतह प्रोटीन में परिवर्तन का मूल्यांकन ।
  2. चरण 1.2.3 में वर्णित trypsin-EDTA विधि के साथ एलपीएस उत्तेजना के 6 ज के बाद कोशिकाओं को अलग करें, और अधूरा मीडिया से धोकर 4 & #176; ग.
  3. Neubauer चैंबर विधि का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और जगह 10 x 10 4 कोशिकाओं में u-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटें. केंद्रापसारक (३०० x जी, 5 मिनट) और एक १८० & #176 द्वारा supernatant त्यागें; ऊपर से नीचे और मूल स्थिति के लिए त्वरित वसूली के लिए कलाई की तस्वीर ।
  4. (10 & #181; जी/एमएल, अंतिम एकाग्रता) कोशिकाओं और मशीन के लिए (30 मिनट, 4 & #176; C).
    5. का चयन करें (एंटीबॉडी) अपूर्ण मीडिया में पतला चुने हुए #181 के लिए जोड़ें ५०
  5. धोने कोशिकाओं दो बार डब्ल्यूइथ चरण ४.३ में वर्णित प्रक्रिया के बाद अपूर्ण मीडिया, और ५० & #181 के साथ मशीन; L at 10 & #181; जी/इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए युग्मित FITC या एक समान संयुग्म (30 मिनट, 4 & #176; C एक अंधेरी जगह में).
  6. एक बार एक पंजाबियों धोने के बाद अधूरा मीडिया के साथ कोशिकाओं को धो लें । पुनर्प्राप्त कोशिकाओं के साथ ३०० & #181; L पंजाबियों का उपयोग कर 1 मिलीलीटर पिपेट युक्तियाँ और जगह में cytometry ट्यूबों.
  7. प्रवाह cytometry प्रणाली में नमूनों का मूल्यांकन (सामग्री के तालिका देखें) । आगे और साइड कैटरिंग पैरामीटर द्वारा सेल जनसंख्या समायोजित करें । ब्याज की आबादी गेट । isotype नियंत्रण के साथ मशीन कोशिकाओं से नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर गेट्स समायोजित करें । धनात्मक कक्षों के प्रतिशत के रूप में परिणामों का विश्लेषण करें या प्रतिदीप्ति तीव्रता का अर्थ है < सुप वर्ग = "xref" > ८ .
< p class = "jove_title" > 5. पश्चिमी ब्लाटर द्वारा Endothelial सक्रियण का मूल्यांकन करें

  1. बीज में endothelium उप संगम पर 6-वेल कल्चरल प्लेट्स (7 x 10 5 cells/well) और एलपीएस के साथ इलाज के रूप में खंड 2 में वर्णित है । निंनलिखित पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल द्वारा भड़काऊ प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण ।
  2. विभिन्न समय अंक पर एलपीएस उत्तेजना बंद endothelial प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं स्पष्ट करने के लिए:
    1. भड़काऊ प्रोटीन प्रोफ़ाइल का पता लगाने के बाद 6 एलपीएस उत्तेजना के ज.
    2. एक ६० ंयूनतम अवधि के माध्यम से हर 15 मिनट संकेतन सेल निर्धारित करते हैं ।
  3. दोनों ही मामलों में ठंडे पंजाबियों के साथ दो बार धुलाई करके रिएक्शन बंद करें और नमूनों की दुकान पर-८० & #176; C तक नमूना संसाधन ।
  4. लाइसे कोशिकाओं और प्रोटीन निष्कर्षण
    1. Add २०० & #181; L lysis प्रत्येक को अच्छी तरह से बफर (1% गैर ईओण surfactant, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 1mM EDTA, १५० मिमी सोडियम क्लोराइड, 30 मिमी सोडियम pyrophosphate, ५० मिमी सोडियम फ्लोराइड, २.१ मिमी सोडियम orthovanadate पर पीएच ७.६, छेड़ने अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक) (सामग्री की तालिका देखें).
    2. में 15 मिनट के लिए मशीन 4 & #176; C आंदोलन के तहत, एक पिपेट टिप के साथ कुओं परिमार्जन और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में homogenate इकट्ठा ।
    3. केंद्रापसारक ट्यूब पर ११,६०० x g पर 4 & #176; C.
    4. Store में supernatant को साफ १.५ एमएल ट्यूबों पर-८० & #176; C तक प्रॉसेस.
  5. मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित bicinchoninic एसिड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय (सामग्री की तालिका देखें) < सुप वर्ग = "xref" > १३ .
  6. का निराकरण 30 & #181; जी के मानक तकनीक द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए कुल प्रोटीन lysate का ०.१% सोडियम dodecyl सल्फेट, 10% polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) < सुप क्लास = "xref" > 14 . 10 मिमी & #946 के साथ नमूने भागो;-mercaptoethanol (शर्तों को कम करने) या बिना (कम शर्तों) ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के आधार पर.
  7. polyacrylamide जेल से अलग प्रोटीन स्थानांतरण ०.४५ & #181 के साथ एक polyvinylidene difluoride (PVDF) स्थानांतरण झिल्ली के साथ; मीटर ताकना मानक प्रक्रिया का उपयोग आकार.
  8. के बाद स्थानांतरण, दो बार पंजाबियों के साथ झिल्ली धो, ०.१% polysorbate-20 (पंजाबियों-टी) और 20 मिलीलीटर 2% जोड़कर विशिष्ट बाइंडिंग साइटों ब्लॉक BSA पंजाबियों में पतला पता चला phosphoproteins या 5% गैर-वसा सूखे दूध के लिए पंजाब में कुल प्रोटीन के लिए टी, आंदोलन के तहत (९० मिनट, RT).
  9. की सिफारिश की एकाग्रता में उपयुक्त अवरुद्ध बफर के 10 मिलीलीटर में चयनित एंटीबॉडी पतला और आंदोलन के तहत झिल्ली की मशीन (पर, 4 & #176; C) । वैकल्पिक रूप से, सील प्लास्टिक की थैलियों में झिल्ली जगह और पतला एंटीबॉडी के 5 मिलीलीटर इस्तेमाल किया ।
  10. अगले दिन, झिल्ली धो तीन बार (अतिरिक्त पंजाब-टी, 15 मिनट, आरटी) ।
  11. आंदोलन के तहत झिल्ली गर्मी (30 मिनट, आरटी) संवाददाता माध्यमिक एंटीबॉडी के 10 मिलीलीटर सहिजन peroxidase (एचआरपी) से बंधे के साथ 1 पर पतला: 10000 उपयुक्त अवरुद्ध बफर में ।
  12. (अतिरिक्त पंजाबियों-टी, 15 मिनट, आरटी) आंदोलन के तहत तीन बार झिल्ली धो लो ।
  13. ०.१ मिलीलीटर/सेमी 2 के साथ 1 मिनट के लिए झिल्ली की मशीन peroxidase सब्सट्रेट बढ़ाया chemiluminescence (ECL) । दो पारदर्शी प्लास्टिक शीट के बीच सूखा झिल्ली प्लेस, और यह chemiluminescence का पता लगाने प्रणाली है जो एक चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा (सीसीडी) भी शामिल है में डालें ।
    1. सीसीडी कैमरे का उपयोग करने के लिए संकेत और उसके सॉफ्टवेयर का पता लगाने के लिए संचय कार्यक्रम के साथ छवियों को रिकॉर्ड (छवियां एक कुल 15 मिनट की अवधि के लिए हर 30 एस जोखिम में संचित संकेत प्रदर्शन) ।
  14. उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद densitometry सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके बैंड तीव्रता को बढ़ाता है < सुप वर्ग = "ImageJ" > १५ xref.
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर में नमूना खुला और आयताकार चयन उपकरण के साथ ब्याज की बैंड का चयन करें ।
    2. प्रोफाइल भूखंड प्राप्त करने के लिए पहले लेन और प्रेस साजिश गलियों के रूप में चयन करें ।
    3. सीधी-रेखा चयन के साथ चोटियों के क्षेत्र का सीमांकन करते हैं ।
    4. प्रत्येक चोटी के अंदर क्लिक करके प्रत्येक बैंड के आकार को मापने ।
    5. प्रोटीन नियंत्रण लोड करने के संबंध में परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं (& #946;-actin, tubulin, आदि ).
< p class = "jove_title" > 6. आसंजन परख द्वारा ल्युकोसैट सक्रियण से जारी Endothelial फैक्टर का मूल्यांकन करें

  1. Endothelial कंडीशन्ड मीडिया प्राप्त करें ।
    1. 2 खंड में संकेत के रूप में आशोधित-04 कोशिकाओं का इलाज और एलपीएस के साथ 24 ज उत्तेजना के बाद संस्कृति supernatant इकट्ठा (१०० एनजी/
    2. इलाज आशोधित-04 कोशिकाओं और केंद्रापसारक (६०० एक्स जी) से कंडीशन्ड मीडिया इकट्ठा । supernatant में ०.५ मिलीलीटर aliquots में रखें-८० & #176; C तक उपयोग.
  2. ल्युकोसैट आसंजन परख
    1. कोट ९६-५० के साथ अच्छी तरह से प्लेटें & #181; L/चयनित extracellular मैट्रिक्स के साथ अच्छी तरह से प्रोटीन (कोलेजन, जो ०.१ एम एसिटिक एसिड में पतला है के लिए छोड़कर) में पतला: fibronectin (1-10 & #181; g/mL ), laminin (1-10 & #181; g/मब) और कोलेजन प्रकार I (10-40 & #181; g/मब) । पर छोड़ो 4 & #176; ग.
    2. लेपित मीडिया छोड़ें और १५० & #181 के साथ कुओं पर विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करें; L पंजाबियों, 1% BSA हीट-निष्क्रिय (1 min, १०० & #176; C) के लिए ९० मिनट पर RT.
    3. दो बार पंजाबियों के साथ कुओं को धोने और जोड़ें १०० & #181; पहले से एकत्र endothelial कंडीशन्ड मीडिया (धारा ६.१) के कुओं के लिए एल.
      नोट: प्लेटें आसंजन परख प्रदर्शन के लिए तैयार हैं ।
    4. कल्चर एक जैविक मशीन में माउस monocyte-macrophage सेल लाइन J774 (३७ & #176; सी, ९५% आर्द्रता, 5% कं 2 ) के साथ रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट मीडियम (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      नोट: J774 कोशिकाओं में वृद्धि सस्पेंशन.
    5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में J774 कोशिकाओं को इकट्ठा करने और केंद्रापसारक (३०० एक्स जी, 5 मिनट) । supernatant त्यागें और 10 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया के साथ सेलुलर गोली reसस्पेंड । कक्षों को किसी Neubauer कक्ष में गिनना । (३०० एक्स जी, 5 मिनट), supernatant त्यागें और सीरम मुक्त मीडिया में 15 x 10 4 J774 कोशिकाओं प्रति ५० & #181; L मीडिया में कोशिकाओं को निरस्त.
    6. Add 15 x 10 4 J774 कोशिकाओं को प्रत्येक कुआं में ५० & #181; L सीरम-मुक्त मीडिया और 15 मिनट के लिए मशीन पर 4 & #176; ग के बाद 1 ज पर ३७ & #176; ग में सह 2 सेल मशीनर.
    7. कुओं को दो बार धोने, धीरे गर्म पंजाबियों जोड़कर; केंद्रापसारक (३०० एक्स जी, 5 मिनट) और एक १८० & #176 द्वारा supernatant त्यागें; ऊपर से नीचे और मूल स्थिति के लिए त्वरित वसूली के लिए कलाई की तस्वीर । अनुलग्न कक्ष ठीक करेंs जोड़कर १०० & #181; पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के एल/अच्छी तरह से (10 मिनट, आरटी) ।
    8. धीरे से मीडिया को त्यागें और permeabilize 2% मेथनॉल में 2 मिनट के लिए आर टी के साथ कोशिकाओं को छोड़ मीडिया धीरे और दाग जोड़कर कोशिकाओं को ५० & #181; L/०.५% क्रिस्टल वायलेट के 20% मेथनॉल में ९० s के लिए rt.
    9. प्रचुर मात्रा में चल रहे पानी के साथ थाली धो, अतिरिक्त तरल त्यागें और इसे हवा सूखी छोड़ दें । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए युग्मित डिजिटल कैमरा द्वारा संलग्न कोशिकाओं की रिपोर्ट.
    10. को जोड़कर सेल धुंधलान पतला १०० & #181; ०.१ मीटर सोडियम साइट्रेट, ५०% इथेनॉल के एल/ ५४५ एनएम पर अवशोषण को मापने और १००% के रूप में सेल आसंजन उच्च ligand एकाग्रता के साथ लेपित कुओं तक पहुंच के रूप में अवशोषित या आसंजन के प्रतिशत की मनमानी इकाइयों के रूप में परिणाम का प्रतिनिधित्व
< p class = "jove_title" > 7. परीक्षण Endothelial सक्रियकरण द्वारा ल्युकोसैट-Endothelium सह-आसंजन परख

  1. ९६ पर आशोधित-04 कोशिकाओं का इलाज-अच्छी तरह से प्लेटें के रूप में खंड 2 में वर्णित है और एलपीएस के साथ मशीन (6 ज, ३७ & #176; C) ।
  2. फ्लोरोसेंट Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर (CSFE) के साथ J774 कोशिकाओं लेबल ।
    1. 6.2.5 में प्रक्रिया के बाद पंजाब में J774 कोशिकाओं को धो लें । Neubauer चैंबर विधि द्वारा कोशिकाओं को गिनने और 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में पंजाबियों, ०.१% BSA.
    2. CFSE (5 & #181; मी, अंतिम एकाग्रता) के साथ कोशिकाओं को ३७ पर 20 मिनट के लिए तैयार & #176; c. 5 मिलीलीटर अपूर्ण मीडिया और मशीन जोड़ें (5 min, 4 & #176; C).
    3. 6.2.5 में समझाया के रूप में अधूरा मीडिया के साथ एक बार धो लें., 15 x 10 4 कोशिकाओं/100 & #181; एल और सह आसंजन परख करने के लिए आगे बढ़ना ।
  3. endothelium उपचार के बाद कुएँ को तीन बार अधूरे मीडिया से धोएं. Add CFSE-J774 cells (15 x 10 4 cells/100 & #181; L) प्रत्येक endothelial-लेपित well. 4 & #176 पर 10 मिनट के लिए थाली मशीन; सी ३७ पर ६० मिनट के बाद & #176; c.
  4. ने कुएँ को धीरे से धो डाला, जैसा कि 6.2.7 में वर्णित है., गर्म पंजाबियों का उपयोग और endothelial परत करने के लिए निम्न दो विधियों द्वारा J774 आसंजन की रिपोर्ट:
    1. लाइसे कोशिकाओं में ०.१ M Tris-HCl pH ८.८, 1% एसडीएस (१०० & #181; L/अच्छी तरह से) और उपाय fluorometry (उत्तेजना/उत्सर्जन = ४९२ एनएम/517 एनएम) द्वारा CFSE-J774 संकेत । सकारात्मक नियंत्रण के संबंध में प्रतिदीप्ति तीव्रता या आसंजन के प्रतिशत की मनमानी इकाइयों के रूप में परिणाम का प्रतिनिधित्व (कुल कोशिकाओं से संकेत एक अच्छी तरह से जोड़ा) ।
    2. 4% पीएफए में कोशिकाओं को ठीक करें और एक endothelium माइक्रोस्कोप (प्रतिदीप्ति/उत्सर्जन = ४९२ एनएम/517 एनएम) के तहत visualizing द्वारा उत्तेजना करने के लिए CFSE-J774 कक्षों के अनुलग्नक की रिपोर्ट ।

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Representative Results

RT-qPCR द्वारा एलपीएस-प्रेरित endothelial सेल सक्रियण का मूल्यांकन

सीरम भूखे आशोधित-04 कोशिकाओं द्वारा उत्तेजित थे १०० एनजी/एलपीएस के 6 एच के लिए, और endothelial जीन अभिव्यक्ति RT-qPCR का उपयोग कर आराम की स्थिति के लिए सक्रियण मार्कर की अभिव्यक्ति की तुलना करके का आकलन किया गया था । जैसा कि चित्र 1aमें दिखाया गया है, एलपीएस-मशीन्ड आशोधित-04 कोशिकाओं भड़काऊ प्रतिक्रिया (ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1) के दौरान ल्युकोसैट भर्ती में शामिल चयनित आसंजन अणुओं की mRNA अभिव्यक्ति प्रेरित किया । PECAM-1 एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था क्योंकि अभिव्यक्ति इस प्रायोगिक उपचार के तहत संशोधित है । चित्रा 1b साइटोकिंस Ccl5, Cxcl10, और Cxcl1 की वृद्धि हुई mRNA अभिव्यक्ति द्वारा मापा एलपीएस द्वारा endothelial सक्रियण का प्रतिनिधित्व करता है । इन अणुओं को परिचालित ल्यूकोसाइट्स के सक्रियकरण में शामिल हैं, endothelial परत करने के लिए उनकी तस्करी और बाद में सूजन साइट के लिए extravasation सहित । cytokine, IL4, इस प्रायोगिक उपचार के तहत एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: RT-qPCR द्वारा एलपीएस-प्रेरित endothelial कोशिकाओं सक्रियण का मूल्यांकन. आशोधित-04 कोशिकाओं के साथ उत्तेजित थे १०० एनजी/एलपीएस के 6 घंटे के लिए (लाल सलाखों) नियंत्रण हालत (नीली सलाखों) की तुलना में, और जीन अभिव्यक्ति RT-qPCR द्वारा विश्लेषण किया गया था । रेखांकन चयनित endothelial आसंजन अणुओं (ए) और साइटोकिंस (ख) ल्युकोसैट सक्रियण और भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान भर्ती में शामिल की नियंत्रण शर्त के संबंध में mRNA के गुना प्रेरण दिखाओ । इस शर्त के तहत नकारात्मक नियंत्रणों के रूप में PECAM-1 और IL4 का उपयोग किया गया । परिणाम एक प्रयोग से अर्थ ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, बाहर की तीन प्रदर्शन, तपसिल में किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रोटीन एलपीएस-इलाज endothelial कोशिकाओं पर आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति

भड़काऊ उत्तेजना पिछले अनुभाग में विस्तृत रूप में आशोधित-04 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया और प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी दाग तकनीक द्वारा जांच की थी । आराम endothelium VCAM-1 और िकैम-1 (के रूप में लेबल) आसंजन अणुओं के लगभग undetectable स्तर प्रस्तुत करता है । एलपीएस (+) की उपस्थिति में, endothelial सक्रिय phenotype वर्णित मार्करों की अभिव्यक्ति के ऊपर के ऊपर से स्पष्ट है (चित्रा 2) । झिल्ली β-actin डिटेक्शन, जो लोड हो रहा है नियंत्रण densitometry विश्लेषण के बाद संबंधित बैंड घनत्व की गणना करने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया गया था द्वारा सामान्यीकृत थे ।

Figure 2
चित्रा 2: एलपीएस-इलाज endothelial कोशिकाओं पर आसंजन अणुओं की प्रोटीन अभिव्यक्ति । प्रतिनिधि पश्चिमी दाग VCAM-1 और िकैम-1 में प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन एलपीएस-इलाज (+) आशोधित-04 कोशिकाओं की तुलना में आराम (-) । β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक प्रोटीन का आणविक भार कोष्ठकों में होता है. मान के सापेक्ष बैंड घनत्व के अर्द्ध ठहराव प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एलपीएस-मध्यस्थता सूजन में Endothelial सतह मार्करों

भड़काऊ संदर्भ में endothelial सक्रियण द्वारा मूल्यांकन किया गया था प्रवाह cytometry के बाद 6 घंटे-उत्तेजना द्वारा एलपीएस (१०० एनजी/ इस हालत में, चिपकने वाला का पता लगाने से संबंधित ल्युकोसैट बातचीत में शामिल अणुओं का मूल्यांकन किया गया था । चित्रा 3 ए के बाएं पैनल आराम आशोधित-04 कोशिकाओं (लाल-ठोस हिस्टोग्राम) isotype नकारात्मक नियंत्रण (काले बिंदीदार हिस्टोग्राम) की तुलना में निर्दिष्ट मार्करों के बेसल अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है । चित्रा 3 ए के सही पैनल प्रेरित आशोधित-04 से व्युत्पंन परिणाम से पता चलता है । एलपीएस उपचार काफी आसंजन ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1 प्लाज्मा झिल्ली (लाल-ठोस हिस्टोग्राम) में जब आराम की स्थिति की तुलना में (काले बिंदीदार हिस्टोग्राम) की अभिव्यक्ति को विनियमित । के रूप में cytometry प्रोफाइल में दिखाया गया है और पहले उद्धृत, PECAM की अभिव्यक्ति-1 इस प्रायोगिक हालत में अपरिवर्तित है । चित्र बी endothelial भड़काऊ प्रतिक्रिया के संभावित मध्यस्थों का मूल्यांकन करने के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया ठहराव मूल्यों से पता चलता है. %: धनात्मक कक्षों का प्रतिशत; MFI: मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता ।

Figure 3
चित्र 3: एलपीएस-मध्यस्थता सूजन में Endothelial सतह मार्करों. आराम और एलपीएस-उत्तेजित आशोधित-04 कोशिकाओं पर सेल आसंजन अणुओं की cytometry प्रोफाइल प्रवाह । बाएं पैनल शेष कोशिकाओं पर प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाता है (प्रतिजन लेबल-लाल हिस्टोग्राम) isotype मिलान नियंत्रण (Ctrl-काले हिस्टोग्राम) के संबंध में । दाएँ फलक नियंत्रण कोशिका-सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति (काले हिस्टोग्राम) एलपीएस-इलाज endothelial कोशिकाओं (लाल हिस्टोग्राम) के लिए तुलना करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

endothelial कोशिकाओं में एलपीएस उत्तेजना से ट्रिगर मार्ग सिग्नलिंग

संवहनी डिब्बे सक्रियण में सूजन के दौरान शामिल तंत्र कुंजी संकेतन अणुओं का मूल्यांकन करके जांच कर रहे हैं । आशोधित-04 विभिंन समय पर एलपीएस के साथ उत्तेजित कोशिकाओं प्रोटीन निष्कर्षण के लिए संसाधित किया गया, और सक्रियण की डिग्री पश्चिमी दाग तकनीक द्वारा विश्लेषण किया गया था । चित्रा 4 से पता चलता है कि NF-κB संकेतन के IκB-α दमन 15 मिनट एलपीएस-मशीन के बाद phosphorylated है, और 1 घंटे के बाद बेसल स्तर के लिए रिटर्न । दूसरी ओर, एलपीएस ERK 1/2 संकेतन के बाद 15 मिनट है, जो एक जरूरी भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान endothelial सक्रियण में शामिल मार्ग स्थापित करता है सक्रिय करता है । झिल्ली β-actin या ERK 1/2 डिटेक्शन, जो densitometry विश्लेषण के बाद रिश्तेदार बैंड घनत्व की गणना करने के लिए लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया द्वारा सामान्यीकृत थे ।

Figure 4
चित्रा 4: endothelial कोशिकाओं पर एलपीएस द्वारा ट्रिगर संकेत रास्ते. आशोधित-04 कोशिकाओं १०० एनजी/एलपीएस के समय चित्रा और संकेतन रास्ते ERK 1/2 (पी-ERK 1/2) और NF-kB (पी के माध्यम से IκBα) में संकेत के लिए के साथ उत्तेजित पश्चिमी ब्लाट द्वारा मूल्यांकन किया गया । ERK 1/2 कुल और β-actin प्रत्येक शर्त में नियंत्रण लोड करने के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रत्येक प्रोटीन के लिए आणविक वजन कोष्ठक में है । मान के सापेक्ष बैंड घनत्व के अर्द्ध ठहराव प्रतिनिधित्व करते हैं । का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा है ।

एलपीएस के साथ उत्तेजित endothelium द्वारा ल्युकोसैट व्यवहार का विनियमन

भड़काऊ प्रतिक्रिया की प्रगति पर endothelial सक्रियण के विनियमन की जैविक प्रासंगिकता ल्युकोसैट प्रदर्शन के कार्यात्मक परख द्वारा निर्धारित होता है । के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है, दो विभिंन तरीकों endothelial कोशिकाओं द्वारा विनियमित ल्युकोसैट समारोह के परीक्षण के लिए शामिल किए गए हैं । हालांकि परख भड़काऊ प्रतिक्रिया के विभिंन पहलुओं (RT-qPCR endothelial ल्युकोसैट सक्रियण द्वारा जारी साइटोकिंस के लिए, और endothelial बातचीत में ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के लिए पश्चिमी दाग) पूछताछ, डेटा प्राप्त कर रहे है दोनों ल्युकोसैट लगाव के सूक्ष्म विवरण का मूल्यांकन । endothelial घुलनशील कारकों द्वारा ल्युकोसैट सक्रियण एक कुशल भड़काऊ प्रतिक्रिया के विकास के लिए आवश्यक है, के रूप में यह कई सब्सट्रेट करने के लिए सेल आसंजन एहसान । चित्रा 5 ए नियंत्रण या एलपीएस इलाज endothelial कोशिकाओं से पहले से एकत्र वातानुकूलित मीडिया के जवाब में ०.५ µ g/एमएल fibronectin लेपित कुओं के लिए J774 सेल आसंजन से पता चलता है । उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप संकेत मिलता है कि एलपीएस-इलाज endothelium से वातानुकूलित मीडिया में जारी कारकों को कुशलतापूर्वक J774 सक्रियण प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं, के रूप में सेल लगाव के प्रेरण द्वारा दिखाया गया है fibronectin । चित्रा 5B एक सह आसंजन परख का प्रतिनिधित्व करता है संवहनी परत की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए endothelial आसंजन अणुओं के उपंयास अभिव्यक्ति द्वारा ल्युकोसैट फर्म आसंजन का समर्थन । संक्षेप में, सीरम आशोधित-04 6 घंटे के लिए एलपीएस के साथ उत्तेजित कोशिकाओं के भूखे subconfluent संस्कृतियों कई बार धोया और सह ल्युकोसैट लाइन J774 पहले फ्लोरोसेंट जांच, CFSE के साथ लेबल के साथ मशीन थे । के रूप में माइक्रोग्राफ और spectrofluorometric माप में दिखाया गया है, एलपीएस संवहनी उत्तेजना J774 endothelial को CFSE-monolayer कोशिकाओं की बातचीत एहसान ।

Figure 5
चित्रा 5: एलपीएस के लिए ल्युकोसैट बातचीत-सह-आसंजन परख द्वारा endothelial monolayer की मशीन । (A) प्रकाश माइक्रोस्कोपी J774 कोशिकाओं के क्रिस्टल वायलेट धुंधला दिखा रहा है ०.५ µ g/एमएल fibronectin लेपित कुओं के जवाब में नियंत्रण या एलपीएस-इलाज endothelial कोशिकाओं से कंडीशन्ड मीडिया के लिए । स्केल बार, ५० µm । स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण नीचे दिखाए गए अवशोषित माप एक प्रतिनिधि प्रयोग तपसिल में चलाने के लिए मनमानी इकाइयों (a.u.) ± SEM के रूप में व्यक्त की इंगित करता है । (ख) प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ नियंत्रण या एलपीएस-इलाज आशोधित-04 कोशिकाओं को सह-आसंजन परख द्वारा मूल्यांकन करने के लिए संलग्न CFSE-J774 कोशिकाओं शो । स्केल बार = ५० µm । fluorometric विश्लेषण नीचे दिखाया प्रतिदीप्ति तीव्रता एक प्रतिनिधि तपसिल में चलाने के प्रयोग के लिए मनमानी इकाइयों (a.u.) ± SEM के रूप में व्यक्त की इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लक्ष्य NCBI RefSeq आयडी आगे अनुक्रम (5 ´-3 ´) रिवर्स अनुक्रम (5 ´-3 ´)
gapdh nm_ 001289726.1 कृत्य GTG गात GGC सीसीसी TCT GG3 TGA CCT TGC सीसीएल सीएजी CCT टीजी
36B4 nm_ 007475.5 आगा TGC AGC आगा टीसीसी जीसीए टी GTT CTT जीसीसी कैट सीएजी CAC सी
Cxcl10 nm_ 021274.2 CAA AGC एटीसी CCG TTT CAC टी सीसीसी CTT CTT GGT ढकोसला गाा टा
Ccl5 nm_ 013653.3 TCT CTG सीएजी CTG सीसीसी टीसीए सीसी TCT TGA एसीसी CAC टीटीसी टीटीसी टीसी
Cxcl1 nm_ 008176.3 GGG AAG एएए TGC AAG CTG एए CTG टीएसी AGC AGG गोरखा प्रशिक्षण CTT GAC
IL1R2 nm_ 010555.4 AGT जीसीए जीसीए आगा सीटीसी TGG टीएसी CTA AGT टीसीसी ऐका GAC ATT TGC टीसीए सीए
IL10 nm_ 010548.2 CTG GAC AAC ATA CTG CTA एसीसी जी GGG कैट CAC टीटीसी टीएसी को सीएजी जीटीए ए
PECAM-1 nm_ 008816.3 CGA TGC गात GGT जीटीए ताा तटरक्षक टीजीटी CAC सीटीसी CTT TTT गोरखा सीएजी
ई-selectin nm_ 011345.2 जीसीए TGT GGA ATG ACG आगा गा गोरखा AGG GTG टीटीसी CTG TGG TT
VCAM-1 nm_ 011693.3 GGC TGA ऐका CTT टीटीसी सीसीए गा CCG ATT TGA जीसीए एटीसी GTT टीटी
िकैम-1 nm_ 010493.3 CCG CTA सीसीएल टीसीए CCG टीजीटी ए GGC GGC टीसीए GTA TCT CCT C

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमरों की सूची ।

आराम एलपीएस
% mfi % mfi
ctrl १.७९ ३.५ ०.५५ ३.४८
PECAM-1 ३७.५२ १२.०९ ३७.८२ १२.२४
ई-selectin १७.१२ ८.०६ ८८.१३ ४९.८४
VCAM-1 ५३.०८ २०.५१ ९९.३० २०४.०५
िकैम-1 ९९.७६ ११४.८१ ९९.८२ ३६३.८९

तालिका 2: एलपीएस-मध्यस्थ सूजन में Endothelial सतह मार्करों । सेल आसंजन के ठहराव आराम और एलपीएस-उत्तेजित आशोधित-04 कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण पर अभिव्यक्ति अणुओं । प्रत्येक सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत करने के लिए इसी मार्कर के लिए प्रतिनिधि मान (%) और मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) आराम और एलपीएस-उत्तेजित endothelial कोशिकाओं में । PECAM-1 इन प्रायोगिक शर्तों के तहत एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

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Discussion

इस endothelial प्रोटोकॉल एक stepwise प्रौद्योगिकी कि उपंयास भड़काऊ प्रतिक्रिया के विनियमन में शामिल तंत्र की खोज के लिए आधार स्थापित करता है का वर्णन । इन तरीकों एलपीएस द्वारा उत्तेजित endothelial गतिविधि के अध्ययन पर आधारित है और भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान ल्युकोसैट भर्ती में शामिल महत्वपूर्ण कदम का मूल्यांकन, विशेष रूप से: endothelial साइटोकिंस रिलीज, endothelial आसंजन अणु अभिव्यक्ति और संवहनी परत करने के लिए आसंजन ल्युकोसैट । एक बार endothelial मानकों की स्थापना कर रहे हैं, प्रणाली उपंयास endothelial समारोह के विनियमन और फलस्वरूप में शामिल यौगिकों के लिए खोज कर सकते हैं, भड़काऊ प्रगति । उन नियामक दवाओं संभावित ब्याज की दवा बाजार के लिए हो सकता है । इस अनुक्रमिक प्रोटोकॉल के प्रमुख प्रक्षेपण के लिए अपने रिश्तेदार संवहनी गतिविधि मापदंडों को समायोजित करके विभिंन endothelial प्रकार और stimulatory शर्तों को इन अध्ययनों का विस्तार करने के लिए एक नींव की स्थापना है ।

इस स्क्रीनिंग के द्वारा चयनित दवाओं भड़काऊ विकारों के खिलाफ उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए दिलचस्प उंमीदवारों का गठन होगा । एक तरफ, यौगिकों कि endothelial प्रतिक्रिया एहसान और ल्युकोसैट भर्ती के लिए योगदान इम्यूनो शर्तों16,17के लिए वादा किया जाएगा । दूसरी ओर, endothelial अवरोधकों जीर्ण भड़काऊ रोगों के लिए उत्कृष्ट चिकित्सा10का गठन होगा ।

उत्तेजित endothelium द्वारा व्यक्त साइटोकिंस के लक्षण वर्णन सूजन के विकास की भविष्यवाणी की । साइटोकिंस भड़काऊ संदर्भ में endothelial परत द्वारा जारी छोटे प्रोटीन और दृढ़ता से ल्युकोसैट व्यवहार को विनियमित कर रहे हैं । इस तरह के Ccl5 के रूप में समर्थक भड़काऊ सदस्यों, Cxcl10 और Cxcl1, ल्युकोसैट सतह और संकेत पर अपने विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए बाइंड के साथ ल्युकोसैट बातचीत के लिए प्रेरित नव संवहनी परत पर आसंजन अणुओं (ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1), और ल्युकोसैट रोग क्षेत्र के लिए प्रवासन (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3)8,10,18. प्रोटीन के एक ही परिवार के अंय सदस्यों सूजन और फलस्वरूप ऊतक की मरंमत के संकल्प में शामिल हैं । इन विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस की अभिव्यक्ति पुरानी भड़काऊ रोगों के लिए प्रासंगिक है क्योंकि वे ल्युकोसैट भर्ती में बाधा और प्रतिरक्षा मंजूरी एहसान10,19,20। संभव endothelial भड़काऊ नियामकों का चयन करने के लिए, यह इस cytokine अभिव्यक्ति परख प्रदर्शन और ब्याज की यौगिकों की उपस्थिति में endothelial आसंजन अणुओं अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है । वास्तव में, विरोधी भड़काऊ बनाम समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के बीच के स्तर का विश्लेषण रोग की प्रगति के लिए एक पूर्वानुमान मूल्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और चिकित्सकीय ब्याज की दवा21से पता चलता है ।

एलपीएस अपने सेल सतह रिसेप्टर के लिए बाध्य जटिल intracellular संकेत कैस्केडिंग मानचित्र kinases ERK 1/2, JNK, और p38 और NF-kB signalosome भड़काऊ transcriptional प्रोग्राम प्रेरित करने के लिए नेतृत्व करने के लिए ट्रिगर । इन रास्ते से कई TNF-α या IL-110,22के रूप में अंय भड़काऊ उत्तेजनाओं के लिए आम हैं । endothelial सक्रियण का phosphorylated प्रपत्र का पता लगाने के द्वारा निर्धारित किया जाता है कळेनासे सदस्य के रूप में ERK 1/2 में चित्रा 4के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, एलपीएस द्वारा endothelial सक्रियकरण IKKβ परिसर, जो phosphorylates के एंजाइमी गतिविधि लाती है और nf-केबी अवरोधक परिसर IκB नीचा, इस प्रकार nf-kb प्रभाव परमाणु translocation के सदस्यों को संवाददाता प्रदर्शन करने की अनुमति transcriptional गतिविधि (चित्र 4) । निस्र्पक तंत्र है जिसके द्वारा दवा यौगिक endothelial भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है बहुत उपयोगी है, न केवल दवा का वर्णन करने में, लेकिन यह भी संगत पारंपरिक उपचारों के साथ संयोजन में उपंयास भड़काऊ उपचार डिजाइनिंग में 23.

endothelial भड़काऊ स्क्रीनिंग परख से चयनित यौगिकों, आगे ल्युकोसैट व्यवहार परख के महत्वपूर्ण चरणों में उनके कार्यात्मक प्रासंगिकता की पुष्टि करने के लिए अध्ययन किया जाना चाहिए, के रूप में अंततः, कोशिकाओं भड़काऊ विकारों के लिए जिंमेदार हैं । इन परख दो अलग प्रयोगात्मक सेटिंग्स में ल्युकोसैट गतिविधि का विश्लेषण । पहली endothelial की भूमिका का मूल्यांकन में है-integrin द्वारा ल्युकोसैट सक्रियण पर साइटोकिंस जारी-आसंजन परख मध्यस्थता । ल्युकोसैट integrins endothelial जारी साइटोकिंस द्वारा सक्रिय हैं । इस प्रकार, integrin लाइगैंडों करने के लिए ल्युकोसैट चिपकने की क्षमता ल्युकोसैट समारोह8,10,18के लिए एक प्रतिनिधि माप है । दूसरा, सह आसंजन परख द्वारा संवहनी परत को ल्युकोसैट बातचीत पर नव व्यक्त endothelial आसंजन अणुओं की भूमिका का अध्ययन करने में है । भड़काऊ संदर्भ में व्यक्त endothelial आसंजन अणुओं आसपास के ऊतकों को ल्युकोसैट भर्ती के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, endothelial-इलाज monolayer कोशिकाओं के साथ बातचीत ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण भड़काऊ प्रगति के लिए एक शकुन मूल्य का गठन (चित्रा 5)8,10,18. इन तरीकों से व्युत्पंन परिणाम सुझाव है कि चयनित यौगिकों भड़काऊ विकारों के इलाज के लिए भविष्य की रणनीतियों को डिजाइन करने में गंभीर उंमीदवारों रहे है

प्रायोगिक प्रस्ताव यहां परिभाषित है क्योंकि विभिंन सेलुलर या stimulatory प्रणालियों के लिए एक्सट्रपलेशन करने की क्षमता के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए एक बहुमुखी उपकरण है । प्रक्रिया अलग मूल या प्रजातियों से endothelium करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अपनी कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अलग भड़काऊ एजेंटों जैसे एलपीएस, TNF-α, बैक्टीरिया, वायरस, आदि के रूप में पाठ में वर्णित है, शोधकर्ताओं ने पहले अपने स्वयं के सिस्टम में endothelial सक्रियण विशेषताएं बाद में भड़काऊ प्रतिक्रिया पर एक चयनित यौगिक की भूमिका विशेषताएं चाहिए । प्रोटोकॉल की सीमाएं एक उचित नकारात्मक नियंत्रण के चयन और ठीक परिभाषित endothelial गतिविधि मापदंडों कि विचार उत्तेजित राज्य से आराम कर रहे हैं । मामले में है कि इस पत्र में वर्णित शर्तों एक अलग प्रणाली के लिए काम नहीं करते, शोधकर्ताओं ने प्रयोगात्मक मापदंडों का निवारण करना होगा अतिरिक्त समय पर निर्भर परख प्रदर्शन और भड़काऊ उत्तेजना के एक एकाग्रता ढाल का उपयोग एक stimulatory खिड़की है कि भड़काऊ प्रतिक्रिया के विनियमन के लिए नई दवाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देता है परिभाषित करने के लिए ।

समाप्त करने के लिए, इस endothelial भड़काऊ प्रोटोकॉल n की खोज के लिए सिफारिश की हैew endothelial भड़काऊ प्रतिक्रिया लक्ष्यीकरण नियामकों । इस प्रक्रिया के प्रदर्शन उपंयास, दिलचस्प यौगिकों कि अपने भविष्य के अनुप्रयोगों के अध्ययन और भड़काऊ से संबंधित रोगों के खिलाफ अभिनव संवहनी विशिष्ट चिकित्सा डिजाइनिंग के लिए लागू किया जा सकता प्रदान करेगा, और जो संभवतः के हो सकता है दवा बाजार के लिए ब्याज ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) और Instituto de सैलड कार्लोस III (ISCIII) (अनुदान संख्या IERPY 1149/16 से अल के द्वारा समर्थित किया गया था; MPY 1410/09 to S. Hortelano); द्वारा MINECO के माध्यम से Fondo de Investigación en सैलड (वित्तीय संस्थाओं) (अनुदान संख्या pi 11.0036 और pi 14.0055 करने के लिए एस Hortelano). एस Herranz ISCIII से IERPY 1149/16 द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391
DMEM-F12 Lonza BE12-719F
Fetal Bovine Serum Sigma A4503
Penicillin streptomycin Lonza DE17-602E
Trypsine Lonza BE17-160E
EDTA Sigma ED2SS
LPS Sigma L2880
Trizol Sigma T9424 RNA extraction buffer
Isopropanol Sigma 33539
Ethanol absoluto Panreac 1,310,861,612
Pure H2O Qiagen 1017979 RNAse free
Agarose Pronadisa 8020
Stain for agarose gels Invitrogen s33102
SuperScript III First-Strand Synth Invitrogen 18080051 Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385610 Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-Well Applied Biosystems 4346906 Plates for qPCR
U-bottom 96 well plates Falcon 353072
Cytometry tubes Falcon 352054
TX100 Panreac 212314 Non-ionic surfactant
Tris-HCl Panreac 1,319,401,211
Sodium chloride Merck 1,064,041,000
Sodium pyrophosphate Sigma 221368
Sodium fluoride Sigma S7920
Sodium orthovanadate sigma 13721-39-6
Protease inhibitor cocktail sigma P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit Pierce 23225 Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanol merck 805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm Thermo Scientific 88518
Tween-20 Panreac 1,623,121,611 Polysorbate 20
PBS Lonza BE17-515Q
ECL Millipore WBKLS0500
Fibronectin Sigma F1141
Laminin Sigma L2020
Collagen type I Sigma c8919
Acetic acid Panreac 1,310,081,611
Trypan blue Sigma T8154
Paraformaldehyde Sigma P6148
Methanol Panreac 1,310,911,612
Crystal violet Sigma HT90132
Sodium citrate Sigma C7254
Ethanol 96% Panreac 1,410,851,212
CFSE Sigma 21888
RPMI Lonza BE12-115F
SDS Bio-Rad 161-0418
Infinite M200 Tecan M200 Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000 Bio-Rad 2000 Gel documentation system
StepOnePlus Applied Biosystems StepOnePlus qPCR system
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec Analyzer 10 Cytometry equipment
ChemiDoc MP Bio-Rad MP Chemiluminescence detection system
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
PECAM-1 BD Biosciences 553370 Use at 10 µg/mL
ICAM-2 Biolegend 1054602 Use at 10 µg/mL
E-selectin BD Biosciences 553749 Use at 10 µg/mL
VCAM-1 BD Biosciences 553330 Use at 10 µg/mL
ICAM-1 Becton Dickinson 553250 Use at 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITC Jackson Immuno Research 112-095-006 Use at 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITC Jackson Immuno Research 127-095-160 Use at 10 µg/mL
Rat IgG isotyope control Invitrogen 10700 Use at 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype control Invitrogen PA5-33220 Use at 10 µg/mL
P-IκΒ-α Cell Signaling 2859 Use at 10 µg/mL
β-Actin Sigma A5441 Use at 10 µg/mL
P-ERK Cell Signaling 9101 Use at 10 µg/mL
anti-mouse HRP GE Healthcare LNXA931/AE Use at 1:10,000
anti-rabbit HRP GE Healthcare LNA934V/AG Use at 1:10,000
anti-rat HRP Santa Cruz Sc-3823 Use at 1:10,000

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२७ Endothelial कोशिकाओं भड़काऊ प्रतिक्रिया एलपीएस (lipopolysaccharide) आसंजन अणुओं साइटोकिंस chemokines स्क्रीनिंग परख ल्यूकोसाइट्स आसंजन ।
स्क्रीनिंग परख के लिए उपंयास Endothelial भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल नियामकों विशेषताएं
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Higueras, M. Á.,… More

Higueras, M. Á., Jiménez-García, L., Herranz, S., Hortelano, S., Luque, A. Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response. J. Vis. Exp. (127), e55824, doi:10.3791/55824 (2017).

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