Summary
Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.
Abstract
A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.
Introduction
A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos1,2.
As células endoteliais desempenham um papel fundamental na regulação da resposta inflamatória, controlando o tráfico de leucócitos. Quando a camada endotelial é exposta aos mediadores inflamatórios tais como LPS, o endotélio descanso ativa e expressa as citocinas pró-inflamatórias (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, etc) e moléculas de adesão (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) esse favor recrutamento de leucócitos para o local de infecção em circulação. Leucócitos aprontados pelas citocinas lançadas depois mediam rolando e interação com a camada endotelial através as contrapartes adesivas correspondentes: PSGL-1 e selectina α4β1 integrina a VCAM-1 e αLβ2 integrina a ICAM-1. Finalmente, os leucócitos migram da vasculatura para o foco da inflamação3.
O papel essencial do endotélio na regulação da resposta inflamatória tem sido demonstrado em ratos que foram geneticamente modificados para expressar o receptor de LPS, receptores do tipo toll 4 (TLR4), apenas sobre as células endoteliais. Estes animais endotelial-TLR4 foram capazes de responder a uma inflamação mediada por LPS e detectar a infecção gerada após a inoculação de bactérias e, consequentemente, alcançar a resolução de infecção e sobrevivência a níveis semelhantes, como o tipo selvagem ratos4 , 5.
Para o caminho de resposta inflamatória endotélio-regulado, foi postulado que a inibição em algumas fases da interação leucócito-endotélio resultaria na redução da migração trans-endotelial e um prognóstico melhor para doenças inflamatórias-relacionados. Na verdade, várias estratégias visando a interação de ativação e leucócito-endotélio endotelial foram projetadas para impedir o extravasamento de células do sistema imunológico como um tratamento para disorders inflammatory6,7.
Neste relatório, descrevemos um grupo completo de técnicas em vitro para caracterizar plenamente a atividade endotelial em resposta para os estímulo inflamatório LPS e seu papel na ativação de leucócitos e adesão à camada vascular. O modelo de célula endotelial usado neste manuscrito foi a linha de endothelial da pilha do pulmão de rato (MLEC-04), conforme descrito por Hortelano et al 8. o MLEC-04 linha de celular foi validada na literatura para ser um sistema adequado para estudar a ativação endotelial9,10. Com base em interesses de pesquisa, essas abordagens podem ser facilmente extrapoladas para qualquer endoteliais ou sistemas de leucócitos e perfil inflamatório. Uma vez que são definidos os parâmetros endoteliais nas condições selecionados, o sistema pode testar novos medicamentos sobre a experimentação proposto para avaliar a ativação vascular. Neste contexto inflamatório, as células do endotélio testadas com o composto de interesse podem ser comparadas com as condições de controle das células, e quaisquer diferenças resultantes podem informar resultado de prognóstico da droga no desenvolvimento e progressão da inflamação. Para concluir, propomos um sistema relevante para caracterizar novos alvos de drogas às células endoteliais, que podem influenciar a concepção de romance vasculares específicas terapias contra doenças inflamatórias relacionadas.
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Protocol
1. cultura de células endoteliais
- cultura de tecido Tratado placas
- placas de cultura de tecido casaco 100 mm com gelatina de 2,5 mL de solução (autoclavados, 0,1% de gelatina em água destilada) por 30 min a 37 ° C; esse pode ser extrapolada para o formato exigido bem. Aspirar a solução de gelatina e deixe placas para secar ao ar livre do bairro de cultura de tecidos.
- As condições de cultura de tecido
- cultivar as MLEC-04 células dentro de uma incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2). Crescem as células em mídia completa de Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL (P/S).
- Contar as células pelo método padrão para a câmara de Neubauer e adicionar as MLEC-04 células para as placas de gelatina-Tratado de 100mm na mídia completa 10 mL, com uma densidade baixa de 2-11 x 10 4 células/cm 2. Dividir as células 1:3 quando eles alcançam a confluência.
Nota: Normalmente, isso ocorre após dois ou três dias em cultura. - Subcultura das células lavando os pratos com 10 mL de fosfato Buffered Saline (PBS estéril) seguido pela adição de 2 mL de solução de tripsina-EDTA (tripsina 0,25%, 5 mM EDTA) e incube por 3 min a 37 ° C.
- Parar a reação do trypsin-EDTA e recuperar as células suspensas adicionando mídia completa 10 mL. Gire para baixo as células (300 x g, 5 min), desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet celular na mídia completa e subcultura adequadamente.
2. Tratamento de LPS e mediadores
- as MLEC-04 células na mídia completa sub confluência no seguinte formato bem da placa: 7 x 10 5 células/poço em placas 6 boas e 2,5 x 10 5 células/poço em placas de 96 poços.
- Incubar a cultura para 6 h em uma incubadora de célula (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2). Alterne as células para mídia incompleta (DMEM-F12, P/S) e deixar durante a noite (ON) para sincronizar e reduzir a atividade celular.
- Remover a mídia e testar novos compostos farmacológicos incubando as células endoteliais com (ou sem) a droga em questão (por exemplo, DT 10) diluído na mídia incompleta (30 min, a 37 ° C); adicionar 1,4 mL/bem para placa de 6 ou 0,14 mL/bem para placas de 96 poços).
- Desafiar as células adicionando LPS para a mídia de incubação (100 ng/mL, concentração final) para o período de tempo especificado em cada ensaio. Usar o PBS como um controle.
3. Avaliação do perfil transcricional no endotélio ativado por RT-qPCR
- células de semente o MLEC-04 sub confluência na cultura 6-poços chapas (7 x 10 5 células/poço). Incubar durante 6 h (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2) e depois proceder à fome de soro (incubar ON).
- Remover a mídia e trata (ou não tratar) a célula endotelial culturas com essa droga de interesse diluído na mídia incompleta (Incubar 30 min, a 37 ° C); adicionam 1,4 mL/bem para placa de 6 (30 min, a 37 ° C).
- Desafiar as células, adicionando 100 ng/mL LPS para a mídia incubada (conforme descrito na etapa 2.3) e incube por 6 h. parar a reacção por lavar duas vezes com PBS frio e manter as placas a-80 ° C até o processamento da amostra.
- Extração de RNA
- descongela as placas e adiciona 1 mL/poço RNA solução tampão (38% de fenol e 0,8 M guanidínio isotiocianato; ver tabela de materiais). Deixe por 30 min à temperatura ambiente (RT) sob agitação e coletar homogeneizado em tubos de 1,5 mL.
- Adicionar 200 clorofórmio µ l e agitar suavemente durante 15 s. Incubar por 3 min em RT e centrífuga (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Transferir a fase aquosa para um outro tubo de 1,5 mL. Precipitar o RNA adicionando 500 µ l isopropanol, seguido de uma incubação de 10 min a RT e, em seguida, centrifugação (11.600 x g, 4 ° C).
- Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento com 75% de etanol pelo vórtice agitação e centrifugação em seguida (7.500 x g, 4 ° C).
- Secar ao ar livre a pelota e solubilizar RNA em 25 µ l pura H 2 O, incubando durante 10 minutos a 55 ° C. Mantenha RNA a-80 ° C até o processamento da amostra.
- Quantidade e pureza do RNA
- quantificar a concentração de RNA medindo-se a absorvância da amostra em 260 nm num espectrofotómetro (ver Tabela de materiais).
- Medida em 230 nm e 280 nm para determinar a pureza de RNA.
Nota: A relação no 260/280 indica contaminação de proteína ou fenol. Uma relação de perto 2 é aceitável. A relação no 260/230 indica EDTA, hidratos de carbono ou contaminantes de fenol. Valores entre 2.0-2.2 são aceitáveis.
- RNA de verificação de integridade
- Run 2 µ g de RNA total e RNA um escada em um gel de agarose de desnaturação de 1,5%; Visualizar sobre um sistema de documentação do gel (ver Tabela de materiais).
Nota: Uma proporção de 2:1 clara e nítida bandas de rRNA 28S e 18S indica um RNA intacto. Parcialmente degradadas RNA resolve como uma aparência borrada.
- Run 2 µ g de RNA total e RNA um escada em um gel de agarose de desnaturação de 1,5%; Visualizar sobre um sistema de documentação do gel (ver Tabela de materiais).
- RT-qPCR
- sintetizar o DNA complementar (cDNA) a partir de um único RNA encalhado, seguindo o padrão do protocolo (ver Tabela de materiais) 11.
- Avaliar expressão gênica por RT-qPCR
- preparar a mistura de reação para cada amostra: Misture 2 µ l do cDNA, composto fluorescente de 7 µ l, primeira demão para a frente de 300 nM e 300 nM inversa da primeira demão (tabela 1) em um volume final de 13 µ l e adicionar à placa de 96 poços de reação (ver Tabela de materiais).
- Selar a placa com uma capa de adesivo óptica, centrífuga (300 x g, 1 min) e executar a reação em um sistema de PCR em tempo real (começo quente 95 ° C por 20 s seguido de 40 ciclos: 95 ° C por 3 s e 60 ° C por 30 s) (ver Tabela de materiais).
- Analisar os resultados por quantificação relativa usando o método comparativo 2 -ΔΔCt com o housekeeping genes gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou ácido phosphoprotein ribosomal P0 (36B4) 12 .
4. Avaliar a ativação endotelial por citometria de fluxo
- tratar as células MLEC-04 seguindo as condições descritas na seção 2 e avaliar as alterações das proteínas de superfície endoteliais por citometria de fluxo.
- Detach as células após 6 h de estimulação de LPS com o método do trypsin-EDTA descrito no passo 1.2.3 e lavagem com os meios de comunicação incompletos em 4 ° C.
- Contar as células usando o método de câmara de Neubauer e coloque 10 x 10 4 células em placas de 96 poços de fundo-u. Centrífuga (300 x g, 5 min) e descartar o sobrenadante por um 180° snap do pulso de cima para baixo e recuperação rápida para a posição original.
- Adicionar 50 μl do anticorpo selecionado diluído na mídia incompleta (10 µ g/mL, concentração final) para as células e incubar (30 min, 4 ° C).
- Lavar as células w duas vezesIth a mídia incompleta, seguindo o procedimento descrito no passo 4.3 e incuba com 50 µ l de 10 µ g/ml de anticorpo secundário correspondente acoplado ao FITC ou um conjugado semelhante (30 min, 4 ° C, em um espaço escuro).
- Lavar as células de uma vez com a mídia incompleta, seguida por uma lavagem de PBS. Recuperar as células com 300 µ l PBS usando pontas de pipetas de 1 mL e colocar em tubos de citometria.
- Avaliar as amostras no sistema de citometria de fluxo (ver Tabela de materiais). Ajuste a população celular pela frente e parâmetros de dispersão de lado. Portão da população de interesse. Ajuste o gates baseados no controle negativo de células incubadas do isotipo controle. Analisar os resultados em percentagem de células positivas ou dizer a intensidade de fluorescência 8.
5. Avaliar a ativação endotelial por Western Blot
- semente do endotélio na confluência sub em placas de cultura 6-poços (7 x 10 5 células/poço) e tratar com LPS, conforme descrito na seção 2. Analisar a expressão da proteína inflamatória pelo seguinte protocolo de borrão ocidental.
- Pare a estimulação de LPS em pontos de tempo diferente para elucidar aspectos diferentes da resposta endotelial:
- determinar o perfil de proteínas inflamatórias após 6 h de estimulação de LPS.
- Determinar a célula sinalizando a cada 15 min por um período de 60 min.
- Em ambos os casos, parar a reacção por lavar duas vezes com PBS frio e armazenar as amostras a-80 ° C até o processamento da amostra. Buffer de
- Lyse pilhas e extração da proteína
- lise de adicionar 200 µ l de cada poço (1% não iónico, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM de cloreto de sódio, pirofosfato de sódio de 30mm, fluoreto de sódio a 50 milímetros ortovanadato de sódio 2,1 mM no pH 7,6, suplementado com coquetel de inibidor de protease) (ver tabela de materiais).
- Incubar por 15 min a 4 ° C, sob agitação, poços com uma ponta de pipeta de raspar e coletar o homogeneizado em tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar os tubos a 11.600 x g a 4 ° C.
- Armazenar o sobrenadante em tubos limpos 1,5 mL a-80 ° C até o processamento.
- Medida que a concentração de proteína pelo ensaio de ácido bicinchoninic, seguindo o padrão do protocolo (ver tabela de materiais) 13.
- Resolver a 30 µ g de proteína total lisada para cada amostra, a técnica padrão de 0,1% Dodecil sulfato de sódio, 10% gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de electroforese 14. Executar amostras com 10 mM de β-mercaptoetanol (condições redutoras) ou sem (condições não-redução) dependendo o anticorpo usado para detectar a proteína de interesse.
- Transferir as proteínas separadas do polyacrylamide gel para uma membrana de transferência do polyvinylidene difluoreto (PVDF) com 0,45 µm poro tamanho usando o procedimento padrão.
- Após a transferência, lave a membrana duas vezes com PBS, polisorbato-20 de 0,1% (PBS-T) e bloquear sites de ligação inespecífica, adicionando 20 mL 2% BSA, diluído em PBS-T para fosfoproteínas detectadas ou 5% leite desnatado em PBS-T para proteínas totais, sob agitação (90 min, RT).
- Diluir o anticorpo selecionado em 10 mL de tampão de bloqueio de apropriado na concentração recomendada e incubar a membrana sob agitação (ON, 4 ° C). Alternativamente, colocar a membrana em sacos plásticos fechados e usado 5 mL de anticorpo diluído.
- No dia seguinte, lave a membrana três vezes (excesso PBS-T, 15 min, RT).
- Incubar a membrana sob agitação (30 min, RT) com 10 mL de anticorpo secundário correspondente limite a peroxidase de rábano (HRP) diluído na 1:10,000 no buffer de bloqueio apropriado.
- Lavar a membrana três vezes sob agitação (excesso PBS-T, 15 min, RT).
- Incuba a membrana por 1 min com 0,1 mL/cm 2 de quimioluminescência de carcaça reforçada a peroxidase (ECL). Coloque a membrana drenada entre duas folhas de plástico transparentes e insira-o sistema de detecção de quimioluminescência que inclui uma câmera de Charged-Coupled dispositivo (CCD).
- Usar a câmera do CCD para detectar o sinal e seu software para gravar imagens com o programa acumulativo (imagens exibir sinal acumulada em cada exposição s 30 por um período total de 15 min).
- Quantificar a intensidade da banda por densitometria usando o software ImageJ seguindo o protocolo descrito na guia usuário 15.
- Aberto a amostra no software ImageJ e selecione a banda de interesse com a ferramenta de seleção retangular.
- Selecione a primeira pista e imprensa enredo pistas para obter as perfil parcelas.
- Delimitar a área dos picos com a seleção linear.
- Medir o tamanho de cada banda clicando-se no interior de cada pico.
- Representam os resultados em relação ao carregar o controle de proteínas (β-actina, tubulina, etc.).
6. Avaliar endotelial fator liberado da ativação dos leucócitos pelos ensaios de adesão
- obter os meios condicionados endoteliais.
- Tratar as células MLEC-04, conforme indicado no ponto 2 e recolher a sobrenadante de cultura após estimulação de 24 h com LPS (100 ng/mL).
- Coletar os meios condicionados dos células tratadas MLEC-04 e centrífuga (600 x g). Manter o sobrenadante em alíquotas de 0,5 mL a-80 ° C até o uso.
- Ensaio de adesão de leucócitos
- revestir as placas de 96 poços com 50 µ l/poço de proteínas da matriz extracelular selecionado diluído em PBS (exceto para o colágeno, que é diluído em 0,1 M de ácido acético): fibronectina (1-10 µ g/mL ), (1-10 µ g/mL) de laminina e colágeno tipo I (10-40 µ g/mL). Deixe ON a 4 ° C.
- Descartar a mídia revestida e bloquear sites de ligação inespecíficas em poços com 150 µ l PBS, 1% BSA inactivados por calor (1 min, 100 ° C) por 90 min no RT.
- Lavar os poços duas vezes com PBS e adicionar 100 µ l de previamente coletados endotelial condicionado mídia (seção 6.1) aos poços.
Nota: As placas estão prontas para realizar o ensaio de adesão. - Cultura do mouse monócito-macrófago linhagem celular J774 numa incubadora biológica (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO 2) com Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Nota: As células de J774 crescem em suspensão. - Coletar as células J774 em um tubo de 15 mL e centrífuga (300 x g, 5 min). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o celular com media 10 mL de soro-free. Conte as células em uma câmara de Neubauer. Centrifugar as células (300 x g, 5 min), desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em media serum-free em 15 x 10 4 J774 células por meios de comunicação 50 social µ l.
- Adicionar 15 x 10 4 J774 células a cada bem em 50 µ l soro livre de meios de comunicação e incube por 15 min a 4 ° C, seguido de 1 h a 37 ° C, a incubadora de célula 2 CO.
- Lavar os poços duas vezes, delicadamente adicionando PBS quente; centrifugar (300 x g, 5 min) e descartar o sobrenadante por uma pressão de 180° do pulso de cima para baixo e recuperação rápida para a posição original. Corrigir a célula anexadas, adicionando-se 100 µ l/poço de paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e incubar (10 min, RT).
- Descartar a mídia suavemente e permeabilize as células com 2% de metanol em PBS por 2 min em RT. Discard a mídia suavemente e manchar as células pela adição de 50 µ l/poço de violeta de cristal de 0,5% em 20% de metanol para 90 s no RT.
- Lavar a placa com água corrente abundante, elimine o excesso de líquido e deixe-o secar ao ar livre. Relatório das células anexadas por câmera digital acoplada a um microscópio de luz.
- Diluir a célula coloração adicionando-se 100 µ l/poço de citrato de sódio 0,1 M, 50% de etanol. Medida da absorvância em 545 nm e representam os resultados como unidades arbitrárias de absorvância ou percentagem de adesão considerando 100% como adesão celular chegaram aos poços revestida com maior concentração de ligante
7. Teste de ativação endotelial por ensaio de co de adesão leucócito-endotélio
- tratar as MLEC-04 células em placas de 96 poços, conforme descrito na seção 2 e incubar com LPS (6h, 37 ° C).
- Etiqueta fluorescente J774 células com Carboxyfluorescein succinimidil éster (CSFE).
- Lavar o J774 células em PBS, seguindo o procedimento em 6.2.5. Contagem de células pelo Neubauer método de câmara e ressuspender a 1 x 10 6 células/mL em PBS, 0,1% BSA.
- Incube as celulas com CFSE (5 µM, concentração final) por 20 min a 37 ° C. adicionar 5 mL incompleta meios de comunicação e incubar (5 min, 4 ° C).
- Lave uma vez com mídia incompletas, conforme explicado em 6.2.5. Ressuspender em 15 x 10 4 células/100 µ l e prossiga para o ensaio de adesão co.
- Após o tratamento do endotélio, lavar os poços três vezes com mídia incompleta. Adicione células CFSE-J774 (15 x 10 4 células/100 µ l) a cada endotelial revestido bem. Incubar a placa por 10 min a 4 ° C, seguido por 60 min a 37 ° C.
- Lavar os poços suavemente, conforme descrito em 6.2.7., usando o PBS aquecido e relatório a adesão de J774 à camada endotelial por dois métodos a seguir:
- lisar as células em 0.1 M Tris-HCl pH 8.8, SDS 1% (100 µ l/poço) e medir a CFSE-J774 sinal por fluorometry (excitação/emissão = 492 nm nm/517). Representam os resultados como unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência ou percentagem de adesão em relação ao controle positivo (sinal de células totais adicionadas a cada poço).
- Consertar as células em 4% PFA e relatório a fixação das células CFSE-J774 para o endotélio através da visualização sob um microscópio de fluorescência (excitação/emissão = 492 nm nm/517).
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Representative Results
Avaliação da ativação de células endoteliais induzida por LPS por RT-qPCR
As soro fome MLEC-04 células foram estimuladas por 100 ng/mL de LPS para 6h, e a expressão de gene endotelial foi avaliada por meio de RT-qPCR, comparando a expressão de marcadores de ativação para a condição de repouso. Como mostrado na figura 1A, as células de LPS incubados MLEC-04 induziram a expressão de RNAm de moléculas de adesão selecionados envolvidas no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1). PECAM-1 foi usado como um controle interno, porque a expressão é sem modificações sob este tratamento experimental. Figura 1B representa a ativação endotelial por LPS medido pelo aumento da expressão do mRNA das citocinas Ccl5, Cxcl10 e Cxcl1. Estas moléculas estão envolvidas na ativação de leucócitos, incluindo o seu tráfico para a camada endotelial e extravasamento posteriormente para o local de inflamação em circulação. As citocinas, IL4, foi usada como um controle interno sob este tratamento experimental.
Figura 1: avaliação de induzida por LPS endotelial células ativação por RT-qPCR. O MLEC-04 células foram estimuladas com 100 ng/mL de LPS para 6 h (barras vermelhas) comparada com a condição de controle (barras azuis), e a expressão do gene foi analisada por RT-qPCR. Gráficos mostram a dobra da indução de mRNA com relação a condição de controle de moléculas de adesão endotelial selecionado (A) e citocinas (B) envolvidas na ativação de leucócitos e recrutamento durante a resposta inflamatória. PECAM-1 e IL4 foram usados como controles negativos sob esta condição. Os resultados são expressos como média ± SEM de um experimento, de três realizada, realizados em triplicata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Expressão da proteína de moléculas de adesão em células endoteliais tratados com LPS
Estimulação inflamatória foi realizada sobre as células MLEC-04, conforme detalhado na seção anterior e a expressão da proteína foi investigada pela técnica do borrão ocidental. O endotélio descanso apresenta níveis quase indetectáveis das moléculas de adesão VCAM-1 e ICAM-1 (marcada). Na presença de LPS (+), o fenótipo ativado endotelial manifesta-se pelo upregulation da expressão dos marcadores descritos (Figura 2). As membranas foram normalizadas pela detecção de β-actina, que foi usada como o controle de carregamento para calcular a densidade relativa da banda após análise de densitometria.
Figura 2: a expressão da proteína de moléculas de adesão em células endoteliais tratados com LPS. Borrão ocidental representante avaliar VCAM-1 e ICAM-1 expressão da proteína em repouso (-) em comparação com tratados com LPS (+) células MLEC-04. O β-actina foi usado como um controle de carregamento. O peso molecular de cada proteína é entre parênteses. Os valores representam a quantificação semi de densidades de banda relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Marcadores de superfície endoteliais na inflamação mediada por LPS
A ativação endotelial no contexto inflamatório foi avaliada por citometria de fluxo após 6 horas-estimulação por LPS (100 ng/mL). Nesta condição, a detecção de moléculas relacionadas com adesivo envolvidas na interação dos leucócitos foi avaliada. O painel esquerdo da Figura 3A representa a expressão basal dos marcadores especificados nas células MLEC-04 descanso (vermelho sólido histograma) comparado com o controle negativo isotype (histograma preta pontilhada). O painel direito de Figura 3A mostra os resultados derivados estimulada MLEC-04. O tratamento de LPS significativamente upregulated a expressão das moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na membrana plasmática (histograma vermelho sólido) quando comparadas com a condição de repouso (histograma preta pontilhada). Conforme a citometria perfis e citado antes, a expressão de PECAM-1 é inalterada nesta condição experimental. Figura 3B mostra os valores de quantificação utilizados como referências para avaliar possíveis mediadores da reação inflamatória endotelial. %: porcentagem de células positivas; IFM: significa intensidade de fluorescência.
Figura 3: marcadores de superfície endoteliais na inflamação mediada por LPS. Fluxo cytometry perfis de moléculas de adesão da célula em repouso e LPS-estimulada MLEC-04 células. O painel esquerdo mostra a expressão da proteína nas células descanso (antígeno vermelho-rotulado de histograma) em relação ao controle do isotipo correspondido (histograma de Ctrl-preto). O painel direito compara a expressão de proteínas da pilha-superfície de controle (pretas histogramas) para as células endoteliais tratados com LPS (histograma vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vias de sinalização desencadeadas pela estimulação de LPS em células endoteliais
Os mecanismos envolvidos na ativação do compartimento vascular durante a inflamação são investigados, avaliando as principais moléculas sinalizadoras. As células do MLEC-04 estimuladas com LPS em diferentes períodos foram processadas para a extração da proteína, e o grau de ativação foi analisado pela técnica do borrão ocidental. A Figura 4 mostra que o repressor i κB-α de sinalização do NF-κB é fosforilado após o 15min de LPS-incubação e retorna aos níveis basais após 1 hora. Por outro lado, os LPS ativa ERK 1/2 sinalização depois de 15 min, que estabelece uma via essencial envolvido na ativação endotelial durante a resposta inflamatória. As membranas foram normalizadas pela β-actina ou ERK deteção de 1/2, que foram usados como os controles de carregamento para calcular a densidade relativa da banda após análise de densitometria.
Figura 4: sinalização de caminhos, desencadeados por LPS em células endoteliais. As MLEC-04 células estimuladas com 100 ng/mL de LPS para os tempos indicaram na figura, e as vias de sinalização ERK 1/2 (P-1/2 de ERK) e NF-kB (através de P-IκBα) foram avaliadas pelo borrão ocidental. O ERK 1/2 total e β-actina foram usados como controles em cada condição de carga. O peso molecular de cada proteína é entre parênteses. Os valores representam a quantificação semi de densidades de banda relativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior doEsta figura.
Regulamento do comportamento dos leucócitos por endotélio estimulado com LPS
A relevância biológica do Regulamento de ativação endotelial na progressão da reação inflamatória é determinada por ensaios funcionais de desempenho de leucócitos. Conforme descrito na seção de protocolo, duas abordagens diferentes são incluídas para testar a função leucocitária, regulada por células endoteliais. Embora os ensaios interrogar os diferentes aspectos da resposta inflamatória (RT-qPCR para endoteliais citocinas libertadas pela ativação dos leucócitos e borrão ocidental para moléculas de adesão endotelial na interação leucócito), os dados obtidos são ambos avaliar detalhes microscópicos de fixação de leucócitos. A ativação de leucócitos por fatores solúveis endoteliais é essencial para o desenvolvimento de uma eficiente resposta inflamatória, como favorece a aderência de célula a vários substratos. Figura 5A mostra a aderência de célula J774 a 0,5 µ g/mL fibronectina revestido poços em resposta à mídia condicionada previamente coletadas do controle ou LPS trataram células endoteliais. As imagens de campo brilhante e medições espectrofotométricas indicam que os fatores lançados na mídia condicionada de endotélio tratados com LPS são suficientes para induzir eficientemente J774 ativação, como mostrado por indução de acessório de celular para fibronectina. Figura 5B representa um ensaio de adesão co para avaliar a capacidade da camada vascular de apoio firme adesão de leucócitos pela novela expressão de moléculas de adesão endotelial. Brevemente, as culturas de Observacao de soro fome das células MLEC-04 estimuladas com LPS para 6 h foram lavadas várias vezes e co incubadas com a linha de leucócitos que j774 anteriormente rotulada com a sonda fluorescente, CFSE. Conforme as micrografias e medições de spectrofluorometric, a estimulação de LPS-vascular favorece a interação das células CFSE-J774 para a monocamada endotelial.
Figura 5: interação de leucócitos para LPS incubados monocamada endotelial por ensaio de adesão co. Imagens de microscopia de luz (A) mostrando a coloração de cristal violeta das células J774 anexadas ao poços de fibronectina revestido 0,5 µ g/mL em resposta a mídia condicionada de controle ou tratados com LPS de células endoteliais. Barra de escala, 50 µm. A análise espectrofotométrica mostrada abaixo indica a medida de absorvância expressada em unidades arbitrárias (u.a.) ± SEM para um representante experimento executado em triplicado. (B) fluorescência micrografias mostram anexado CFSE-J774 pilhas para o controle ou tratados com LPS MLEC-04 células avaliadas pelo ensaio de adesão co. Barra de escala = 50 µm. A análise fluorométrica mostrada abaixo indica a intensidade de fluorescência, expressada em unidades arbitrárias (u.a.) ± SEM para um representante experimento executado em triplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alvo | NCBI RefSeq ID | Encaminhar a sequência (5´-3´) | Sequência inversa (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ATO GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | ANTONIO TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC GATO CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT MORDAÇA GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG TGC AAA AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG GATO CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selectina | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | A TGT CCG CCG CTA CCA TCA A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabela 1: Lista de primers utilizados neste estudo.
| A descansar | LPS | |||
| % | IFM | % | IFM | |
| CTRL | 1.79 | 3.5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37,52 | 12.09 | 37.82 | 12,24 |
| E-selectina | 17.12 | 8,06 | 88.13 | 49,84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
Tabela 2: marcadores de superfície endoteliais na inflamação mediada por LPS. Quantificação da expressão de moléculas de adesão de célula nas células MLEC-04 descanso e LPS-estimulada pela análise de citometria de fluxo. Os valores representativos para cada marcador correspondente à percentagem de células positivas (%) e intensidade de fluorescência média (IFM) nas células endoteliais descanso e LPS-estimulado. PECAM-1 foi usado como um controle negativo nestas condições experimentais.
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Discussion
Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros endoteliais são estabelecidos, o sistema pode procurar novos compostos envolvidos na regulação da função endotelial e, consequentemente, progressão inflamatória. Essas drogas reguladoras potencialmente podem ser de interesse para o mercado farmacêutico. A grande projeção do presente protocolo sequencial é estabelecer uma Fundação para estender estes estudos para diferentes tipos de endoteliais e condições estimulatórios ajustando seus parâmetros de relativa atividade vascular.
Drogas selecionadas por esta seleção constituirá candidatos interessantes para a concepção de novas estratégias terapêuticas contra desordens inflamatórias. Por um lado, os compostos que favorecem a resposta endotelial e contribuam para o recrutamento de leucócitos será promissoras para condições de imunodeficiência16,17. Por outro lado, os inibidores endoteliais constituiria excelentes terapias para doenças inflamatórias crônicas10.
Caracterização das citocinas expressadas pelo endotélio estimulado prevê a evolução da inflamação. Citocinas são pequenas proteínas lançadas pela camada endotelial no contexto inflamatório e fortemente regulam o comportamento de leucócitos. Membros pro-inflamatórios, tais como Ccl5, Cxcl10 e Cxcl1, ligam aos seus receptores específicos na superfície dos leucócitos e sinal para induzir a interação leucócito com as moléculas de adesão recém expressa na camada vascular (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1), e migração de leucócitos para a área patológica (Figura 1, Figura 2, Figura 3)8,10,18. Outros membros da mesma família de proteínas estão envolvidos na resolução de inflamação e, consequentemente, reparo do tecido. A expressão dessas citocinas anti-inflamatórias é relevante para doenças inflamatórias crônicas, porque eles impedem o recrutamento de leucócitos e favorecem a imunidade apuramento10,19,20. Para selecionar possíveis reguladores inflamatórios endoteliais, recomenda-se realizar este teste de expressão de citocinas e avaliar a expressão de moléculas de adesão endotelial na presença de compostos de interesse. Na verdade, analisar os níveis entre anti-inflamatórios versus citocinas pró-inflamatórias pode ser usado como um valor preditivo para a progressão da doença e revela a droga de interesse terapêutico21.
Os LPS vinculando a seus gatilhos de receptores de superfície celular complexas cascatas de sinalização intracelulares, lideradas por quinases mapa ERK 1/2, JNK e p38 e a signalosome de NF-kB para induzir o programa transcriptional inflamatório. Muitos destes caminhos são comuns a outros estímulos inflamatórios como o TNF-α ou IL-110,22. A ativação endotelial é determinada pela detecção de forma fosforilada dos membros quinase do mapa, como mostrado por ERK 1/2 na Figura 4. Além disso, a ativação endotelial por LPS induz a atividade enzimática do complexo, o IKKβ que fosforila e degrada o inibidor do NF-kB i κB complexo, permitindo que membros de efetor de NF-kB de translocação nuclear executar o correspondente atividade transcricional (Figura 4). Caracterizar os mecanismos pelos quais o composto de drogas afeta a resposta inflamatória endotelial é muito útil, não apenas descrevendo a droga, mas também em projetar novos tratamentos inflamatórios em combinação com terapias convencionais compatíveis 23.
Compostos selecionados dos ensaios de rastreio inflamatório endotelial, deve ser ainda mais estudado para confirmar sua relevância funcional nas etapas críticas dos ensaios de comportamento de leucócitos, como, em última análise, as células são responsáveis para as desordens inflamatórias. Estes ensaios analisam a atividade dos leucócitos em dois diferentes contextos experimentais. O primeiro é avaliar o papel das citocinas endotelial-lançado na ativação de leucócitos por ensaios de adesão integrina-mediada. As integrinas dos leucócitos são ativadas pelas citocinas lançadas endoteliais. Assim, capacidade adesiva de leucócitos de integrina ligantes é uma medida representativa para leucócitos função8,10,18. O segundo está em estudar o papel das moléculas de adesão endotelial recém expressa na interação dos leucócitos à camada vascular por ensaios de adesão co. As moléculas de adesão endotelial expressas no contexto inflamatório é essencial para o recrutamento de leucócitos para o tecido circundante. Assim, analisar os leucócitos interagindo com a monocamada endotelial-Tratado de células constitui um valor prognóstico para progressão inflamatórias (Figura 5)8,10,18. Os resultados derivados dessas abordagens gostaria de sugerir que os compostos selecionados são candidatos sérios na concepção de estratégias futuras para o tratamento de desordens inflamatórias
A proposta experimental definida aqui é uma ferramenta versátil para aplicações futuras devido à sua capacidade de extrapolar para diferentes sistemas celulares ou estimulatórios. O procedimento pode ser modificado ao endotélio de diferentes origens ou espécies e para testar sua funcionalidade em várias células do sistema imunológico, bem como diferentes agentes inflamatórios tais como LPS, TNF-α, bactérias, vírus, etc. Conforme descrito no texto, os pesquisadores primeiro devem caracterizar a ativação endotelial em seu próprio sistema para depois caracterizar o papel de um composto selecionado na resposta inflamatória. Limitações do protocolo são a seleção de um adequado controlo negativo e de definir precisamente os parâmetros de atividade endotelial que discernir o descanso do estado estimulado. No caso das condições descritas neste documento não funcionam para um sistema diferente, os pesquisadores devem solucionar os parâmetros experimentais realizando ensaios adicionais de tempo-dependente e usando um gradiente de concentração do estímulo inflamatório para definir uma janela estimulatório que permite testar novos medicamentos para a regulação da resposta inflamatória.
Para concluir, este protocolo inflamatório endotelial é recomendado para a busca de nreguladores de endoteliais EW visando a resposta inflamatória. Efectuar este procedimento irá fornecer romance, compostos interessantes que pode ser aplicado ao estudo de suas aplicações futuras e projetar terapias inovadoras de vascular específica contra as doenças inflamatórias relacionadas, e que potencialmente poderia ser de interesse para o mercado farmacêutico.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economía y competitividade (MINECO) e o Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de concessão IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); pelo MINECO através do Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subvenções números PI11.0036 e PI14.0055 para S. Hortelano). S. Herranz foi apoiado por IERPY 1149/16 de ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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