Summary
Nanopore teknologi til sekvensering biomolekyler har bredt programmer inden for biovidenskab, herunder identifikation af patogener, fødevarer sikkerhed overvågning, genomisk analyse, metagenomic miljøovervågning og karakterisering af bakterielle antibiotikaresistens. I denne artikel demonstreres proceduren for metagenomic jord DNA-sekventering for identifikation af arter ved hjælp af nanopore sekventering teknologi.
Abstract
Denne artikel beskriver trin for opbygningen af et DNA bibliotek fra jord, forberedelse og brug af cellen nanopore flow, og analyse af DNA-sekvenser identificeret ved hjælp af computersoftware. Nanopore DNA-sekventering er en fleksibel teknik, der giver mulighed for hurtig mikrobielle genome sequencing til identifikation af bakterie- og virusinfektioner arter, at karakterisere bakteriestammer, og at opdage genetiske mutationer, der giver resistens mod antibiotika. Fordele ved nanopore sekventering (NS) for biovidenskab omfatter dens lav kompleksitet, reducerede omkostninger og hurtig real-time sekventering af renset genomisk DNA, PCR-amplikoner, cDNA prøver eller RNA. NS er et eksempel på "strand-sekventering", som indebærer sekventering DNA ved at vejlede en enkelt strandede DNA molekyle gennem en nanopore, der er indsat i en syntetisk polymer membran. Membranen har en elektrisk strøm anvendes på tværs af det, så når de enkelte baser passerer gennem nanopore den elektriske strøm er forstyrret i varierende grad af de fire nukleotid baser. Identifikation af hver enkelt nucleotid opstår ved at afsløre de karakteristiske graduering af den elektriske strøm af de forskellige baser, når de passerer gennem nanopore. NS system består af en håndholdt, USB drevet transportabel indretning og en engangs flow-celle, der indeholder en nanopore matrix. Den bærbare enhed sluttes til en standard bærbar computer, der læser og registrerer DNA sekvens ved hjælp af computersoftware.
Introduction
Målet med denne procedure er at påvise den fremgangsmåde for udarbejdelse af en miljømæssig DNA bibliotek for sekventering, udnyttelse af en nanopore flow celle sekventering enhed, og udføre analyse af de genererede DNA sekvenser ved hjælp af system-software og det nationale Center for bioteknologi oplysninger (NCBI) bioinformatik værktøjer til at identificere mikrobielle arter i jord. I øjeblikket, kræver de fleste DNA-sekventering platforme en større investering i teknisk uddannelse og komplekse instrumentation, hvilket ikke er muligt i ressource-fattige miljøer eller i området applikationer. Nanopore sekventering (NS) platform eliminerer disse problemer med en omkostningseffektiv, enkel at bruge biblioteket forberedelse protokol, og en bærbar enhed til sekvens og analysere en række forskellige typer af nukleinsyrer1,3. Vi har indarbejdet flere lab klasser NS platform for master's degree studerende.
Nanopore teknologi til sekvensering biomolekyler har demonstreret bred applikationer inden for biovidenskab, herunder identifikation af bakterie- og virusinfektioner patogener1,2,6, miljømæssige biodiversitet undersøgelser, fødevarer sikkerhed overvågning, genomisk analyse3,5og karakterisering af bakteriel antibiotikaresistens4. NS er en hurtig og præcis metode til sekvens nukleinsyrer, der er baseret på princippet om "strand sekventering" ved at opdage elektriske forstyrrelser af individuelle nukleotid baser når enkelt strandede DNA passerer gennem en nanopore, der er indsat i en elektrificeret syntetisk polymer membran. De forskellige trin i forberedelsen DNA til NS omfatter genom fragmentering, ende reparation og 3' dA-hale af genomisk fragmenter, adapter og tether udglødning til DNA, DNA bibliotek rensning, og indlæsning af biblioteket i nanopore flow celle enhed. Opsplitning af genomet i ~ 8 kb størrelser opnås ved centrifugering 1-2 µg genomisk DNA gennem en g-rør fragmentering rør. De fragmenterede genomisk ender derefter repareret og tailed med poly dA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit. Enkelt snoet adapter sekvenser, som er forenelige med nanopore motor protein, der føjes til DNA ender, der er brugt til at guide DNA-sekvens gennem nanopore (figur 1). Tether sekvenser er påkrævet for DNA oprensning og for lokalisering af DNA-molekyler til pore membran. Hårnålen genereres af ligating en hårnål adapter til den ene ende af det dA tailed bibliotek. Hårnål strukturer i DNA ender giver mulighed for læsning af fornuft og antisensstoffer tråde som DNA passerer gennem nanopore (figur 2). Rede genomiske biblioteket er derefter renset fra reaktionen ved hjælp af streptavidin perler ved hjælp af et magnetfelt, efterfulgt af Ilægning af prøven i cellen nanopore flow for analyse.
Sekventeret DNA er vurderet for kvalitet og sekventering læsninger, der er acceptabel for analyse udsættes derefter for flere bioinformatik værktøjer til at identificere mikrober. Sekvenserne er "oversat" til en FASTQ fra en FAST5 format. I formatet FASTQ kan sekvenser derefter bruges i BLAST analyse.
Protocol
Bemærk: Metagenomic DNA er renset fra jorden (Baltimore County, Maryland) ved hjælp af en kommercielt tilgængelig jord genomisk isolering kit (Se Tabel af materialer). Ved hjælp af en UV spektrofotometeret (Se Tabel af materialer), renset genomisk DNA bør have en 260/280 (nm) ratio > 1,8 og en 260/230-forhold mellem 2,0-2,2 at forsikre om, at prøven er fri for forurenende stoffer. Mængden af genomisk DNA, der kræves for NS varierer fra 200 ng til 2 µg.
1. hurtig bibliotek forberedelse metode (kort protokol)
Bemærk: Dette er en kort protokol. Se Tabel af materialer for hurtig sekventering kit.
- I en 0,2 mL tyndvæggede tube (Se Tabel af materialer) tilføje 200 ng af høj molekylvægt DNA i en endelig af mængden af 7,5 µL destilleret vand.
- Tilføje 2,5 µL af fragmentering mix (FM) fra hurtige bibliotek forberedelse kit og bland forsigtigt ved inversion. Puls centrifuge spin ned (1.000 x g for 5 s).
- Prøven anbringes i et thermocycler (Se Tabel af materialer) for en runde ved 30 ° C i 1 min. efterfulgt af 75 ° C i 1 min. Fjern tube og puls centrifugen spin ned prøven.
- Tilsæt 1 µL af hurtige adapter og 0,2 µL af stump/TA ligase master mix, og derefter gemme den tilpassede og tøjret bibliotek på is.
Bemærk: Hvis ved hjælp af den korte protokol Fortsæt til trin 8
2. ligatur sekventering Protocol (lang protokol): Metagenomic DNA opsplitning
Bemærk: Se Tabel af materialer for ligatur sekventering kit.
- Fortyndes 1 µg renset genomisk DNA til en endelige mængden af 46 µL i ionbyttet vand.
- Overføre prøven til et DNA fragmentering tube (Se Tabel af materialer) og centrifugeres i 1 minut ved stuetemperatur på 8.000 x g ved hjælp af en microcentrifuge (Se Tabel af materialer) til at producere ~ 8 kb genomisk fragmenter. Kontroller, at al væsken er gået ind i collection tube.
- Invertere fragmentering tube, vende tilbage til centrifuge, og der centrifugeres i 1 min til at indsamle den fragmenterede genomisk DNA ind i den nedre kammer.
- Overføre den fragmenterede genomisk DNA til en steril lav-DNA bindende 1,5 mL tube, og analysere en del på en lav procentdel agarosegel (0,6%) til at bekræfte fragmentering til > 30 kb.
3. fragmenteret genomisk DNA ende-forberedelse
- Ved hjælp af 800 ng af fragmenterede genomisk DNA i 45 µL med deioniseret vand, tilføje 7 µL ende-prep reaktion buffer (Se Tabel af materialer), 3 µL enzym mix (Se Tabel af materialer), og 5 µL af nukleasen frit vand.
- Mix af inversion og puls centrifuge (1.000 x g for 5 s).
- Overføre prøven til et 0,2 mL tyndvæggede rør, og Inkuber prøve i 5 min. ved 20 ° C, efterfulgt af inkubation ved 65 ° C i 5 min.
- Puls centrifuge at bringe indholdet til bunden af røret.
- Overføre prøven til et 1,5 mL lav-DNA bindende microcentrifuge rør.
- Forberede magnetiske perler (Se tabel over materialer). Tilføje 60 µL af resuspenderede perler til udgangen prep reaktion fra trin 3.5 og mix af pipettering.
- Ruger på en rotator mixer på 100 rpm (Se Tabel af materialer) til 5 min ved stuetemperatur.
- Puls centrifugeres prøven pellet perlerne, derefter placere prøven ved siden af magnet.
- Når perlerne er overholdt magneten, afpipetteres off supernatanten og kassér.
- Fjerne røret fra magnet og vaske perlerne med 200 µL af frisklavede 70% ethanol ved forsigtigt pipettering prøven up-and-down.
- Puls centrifuge pellet perlerne og vende tilbage til magneten.
- Fjern supernatanten og kassér. Gentag trinnet vask igen med 200 µL af 70% ethanol.
- Puls centrifugeres tube, vende tilbage til magneten og fjerne alle 70% ethanol vask.
- Med microcentrifuge tube låget åbner, tillader perler til luft tørre i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjerne røret fra magnet og suspendere pellet i 31 µL sterilt, nukleasen-gratis vand. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur.
- Retur røret til magneten, indtil alle perlerne har pelleted og eluatet er klar.
- Overføre eluatet til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Ved hjælp af 1 µL af prøven, kvantificere ende-prepped DNA ved hjælp af en UV Spektrofotometer på 260 nm (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Den procent nyttiggørelse bør være ~ 70% (700 ng) fra en start koncentration af 1 µg genomisk DNA.
4. adapter og Tether tilføjelse til slutningen-prepped genomisk DNA fragmenter
- Bland alle stump/TA ligase master mix rør ved inversion, og derefter puls centrifuge for at bringe indholdet til bunden.
- Brug 30 µL af ende-prepped DNA, tilføje 20 µL af adapter blanding og 50 µL af stump/TA ligatur master mix.
- Mix af inversion, pulse centrifuge, og der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
5. magnetiske Bead forberedelse
- Vortex perlerne og derefter overføre 50 µL af suspenderede perler til en 1,5 mL mikrofuge tube.
- Røret anbringes på magnet til pellet perlerne indtil eluatet rydder.
- Fjern supernatanten og kassér.
- Tilsæt 100 µL af perle binding buffer (Se Tabel af materialer til perle kit) til perler, vortex til resuspend perler, pellet perler på magneten, Fjern supernatanten og kassér. Gentag vask med 100 µL af binding buffer.
- Tilføje 100 µL af perle binding buffer til vasket perlerne. Vortex til resuspend perlerne.
6. bibliotek rensning
- Brug en P200 mikropipette, tilføje 40 µL af perler fra det forrige trin til tilpasset/tøjret genomisk DNA. Proeven blandes omhyggeligt ved pipettering.
- Inkuber prøve på en rotator mixer på 100 rpm i 5 min ved stuetemperatur.
- Prøven anbringes på magnet og tillade perler til at løse. Afpipetteres off supernatanten og kassér.
- Resuspend perlerne i 140 µL af perle binding buffer af pipettering. Prøven mod magneten anbringes, supernatanten fjernes, og vask igen med en anden 140 µL af perle binding buffer.
- Pulse centrifugeres røret, placere røret på magneten for 2 min. fjerne de resterende perle binding buffer fra toerstoffet.
7. eluering af bibliotek fra Magnet perler
- Resuspend de magnetiske perler i 15 µL af eluering buffer af pipettering. Inkuber prøve i 10 min ved stuetemperatur.
- Placer røret mod magnet til pellet perlerne.
Bemærk: Den procent nyttiggørelse bør være ~ 25% (250 ng) fra en start koncentration af 1 µg genomisk DNA.
8. Start en Run/kvalitetskontrol
- Fjern cellen flow fra emballage og tillægger den bærbare, real-time sequencer cellen flow (Se Tabel af materialer).
- Vedhæfte sequencer til en computer via USB-kabel og starte sekvensering software (Se Tabel af materialer).
- Klik på "Connect" enhed gennem sekvensering software, skal du vælge "NC_Platform_QC.py", og klik på "Start".
- Kvalitetskontrol (QC) tager ca 6-7 min til at fuldføre; kigge efter et hav af grønne (store områder af output) på QC udlæsning til at bekræfte, at der er nok aktive porer (> 800) for DNA-sekventering.
9. Start en sekventering køre
- Åbn programmet sekventering; en dialogboks vises. I boksen eksempel ID navn prøven.
- Klik på boksen "Flow celle-ID" og indtaste koden findes på mærkaten på toppen af cellen flow.
- Åbne flow celle låg og skub derefter prøven port dækning til ret (uret), således at prøven port er synlige. Når porten er åben, tjek for en lille boble. Fjerne et par microliters af buffer herunder boblen.
- Kontroller at være sikker på, at der er buffer på tværs sensor array. Lav priming buffer ved at blande 480 µL af kører buffer med brændstofblanding (RBF-1, se Tabel af materialer) (Sørg for at blande grundigt første) med 520 µL nukleasen-gratis vand.
- Tilføje 800 µL af priming buffer til priming port. Løft forsigtigt dækslet "SpotOn" for at gøre det tilgængeligt.
- Efter 5 min, tilføje en ekstra 200 µL af priming buffer til priming port.
10. indlæsning af biblioteket
- Før forberede bibliotek sted de følgende reagenser på is: RBF-1 (fra sekventering kit), tilpasset og bindes, og biblioteket lastning perler (LLB; fra sekventering kit).
- En 0,2 mL centrifugeglas, tilføje 25,5 µL af RBF og 12 µL nukleasen-gratis vand ved stuetemperatur.
- Bland LLB af pipettering up-and-down. Tilføje 26,5 µL af LLB til 0,2 µL tube. Bland reagenserne af pipettering up-and-down.
Bemærk: LLB tendens til at bosætte sig ud af blandingen. - Tilføje 11 µL af biblioteket tilpasset og tøjret til 0,2 µL tube. Bland ved inversion og spin-ned af pulse centrifugering.
- Tilføje 75 µL af prøven fra trin 9.4 til "SpotOn" port dråbevis. Sørg for, at hver dråbe munder ud i havnen før du tilføjer næste.
- Omhyggeligt erstatte prøven port dækning, så bung træder porten, og erstatte enhed låg.
11. Start en sekvensering Software protokol Script
- Åbn dropdown menuen under "Vælg Program" og vælg "48 timers sekventering."
- Klik på knappen "Udfør" for at starte scriptet.
- Kontrollere resultaterne af de Mux Skan indberettet i anmeldelsen stream for antallet af aktive porer i MUX Skan.
Bemærk: Dette tal kan være forskellig fra antallet af porer i QC køre og en stor forskel kan indikere et problem.- Hvis der er en betydelig reduktion af aktive porer fra QC run, genstart softwaren, og hvis der er stadig en væsentlig forskel, genstarte computeren.
- Kontroller, at heatsink temperaturen er 34 ° C som rapporteret af sekvensering software script.
Bemærk: Hvis temperaturen er ikke på 34 ° C så der vil ikke være nok aktive porer for at køre. - Tjekke histogrammet af Læs længder til at afgøre, om sekvens længder er forventet og passende for den eksperimentelle design.
- Luk den desktop agent ved hjælp af 'Luk ' Quit sekvensering software ved at lukke ned internettet GUI. Frakoble enheden fra computeren.
12. analyse af Kør og resultater
Bemærk: Under sekventering run, data kan overvåges ved hjælp af "Vis rapport" programmet ved hjælp af den desktop agent. Under eller efter kørslen er færdig, filer er tilgængelige i en FAST5 filformat i data → læser → passere mappe (standard). Hvis denne mappe er åben, mens sekventering er aktiv, kan computeren fryse.
- At se og manipulere sekvenser, downloade en "HDFViewer".
- Hvis du vil se filerne, sekventering, direkte åbne HDF viewer → åbne Data mappe → Vælg alle fil typer → Vælg C: drev (standard) → Vælg data → Vælg læser → Vælg pass.
- Find og vælg filen FASTQ i venstre dropdown-menuen; filer åbnes og kan gemmes i FASTQ format.
Bemærk: Med henblik på den studerende eksperiment, sekvenser af 350 nukleotider eller længere blev udvalgt til yderligere analyse. Output fra den base kald tillader brugeren at sortere sekvens læser baseret på størrelse. FASTQ filer kan analyseres via BLAST (NCBI) eller andre programmer, bioinformatik.
Representative Results
Den eksperimentelle design og nanopore teknologi gav en hurtig og billig metode for studerende at jord DNA-sekvens. Det repræsentative run bestået parametrene kvalitetskontrol med mere end 800 porer tilgængelige til sekvensering. Kør resulterede i over 125.000 læser tilgængelige for undersøgelse med en median sekvens længde på 5,38 kb. Sekvenser er givet et kvalitetsresultat og kun disse sekvenser med acceptabel scoringer blev derefter analyseret. Som produktionen af Sekventeringen er reaktion i FAST5 format, som ikke accepteres af programmer såsom BLAST (NCBI), sekvenser blev betragtet i HDF-fremviseren, som konverterer sekvenserne til FASTQ format, som er kompatible til BLAST analyse. Fremover gentagelser af software, data vil være tilgængelige som et FASTQ format, eliminerer behovet for HDF-fremviseren. Se supplerende tallene 1, 2 og 3.
Halvtreds sekvenser af over 350 nukleotider i længde var genstand for analyse af BLASTN (nukleotider mod nukleotid database) eller BLASTX (nukleotider oversat til aminosyresekvens) (NCBI) at identificere organismer i jordprøven. Betragtning af tid begrænsninger i klassen og at fokus for kurset er på laboratoriemetoder og ikke bioinformatik, vi få kursisterne til at analysere sekvenser inden for disse parametre. Vores Bioinformatik klasser kan bruge dataene til udvikling af rørledningen analyseværktøjer. Dette niveau af Bioinformatik analyse er ikke dækket i klassen laboratorium baseret. Tabel 1 er en liste over de organismer, der blev identificeret med e værdier i mindre end 4 e-04. E-værdier er mindre end 4 e-04 betyder normalt, stærk lighed mellem inputsekvensen (forespørgsel) og den matchede sekvens. Organismer identificeret ved BLASTN (mod de ikke-redundante (NN) database) er fra en bred vifte af arter og er tilgængelige for yderligere genomisk og protein analyser. Dette udsnit af jord, som kom fra en have i Baltimore County, MD havde aldrig blevet testet, så der var ingen tidligere data til at afgøre, hvad organismer kan være i jorden. BLASTN analyse (mod NN database) analyse angivet også der var sekvenser med ingen ligheder i databasen nr. For at afgøre, om disse er virkelig roman sekvenser, er nødvendigt med yderligere undersøgelse. Analyse af flere sekvenser af BLASTX viste flere proteiner fra organismer ikke repræsenteret i BLASTN analysen. Tabel 2 viser flere mulige proteiner, herunder endopeptidases og ATPases-lignende proteiner. Brug dette bibliotek af sekvenser, har studerende mulighed for at bruge mere avancerede bioinformatik værktøjer til at udføre yderligere analyse, hvis instrueret af instruktøren.
Figur 1 : Genomiske biblioteket forberedelse. Trin til forberedelse af genomisk DNA bibliotek til sekvensering ved hjælp af nanopore teknologi. Dette tal er blevet ændret med de nødvendige tilladelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Skematisk af DNA-sekventering ved hjælp af en nanopore. DNA passerer gennem en nanopore membran med elektrisk signal generation og base identifikation. Dette tal er blevet ændret med de nødvendige tilladelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Organisme | e værdi |
| Streptomyces sp. | 3.00E-06 |
| Nocardoides sp. | 5.00E-04 |
| Gordonia sp. | 5.00E-04 |
| Hyphomicrobium nitrativorens | 1.00E-139 |
| Starkeya novelle | 1.00E-31 |
| Hyphomicrobium denitrificans | 1.00E-30 |
| Fibomicrobium sp. | 5.00E-17 |
| Pseudomonas sp. | 2.00E-15 |
| Rhodothemus marinus | 1.00E-17 |
| Turneiella parva | 2.00E-24 |
| E. coli | 0.00E + 00 |
| Bradyrhizobium sp. | 3.00E-30 |
| Gemmatirosa kalamazoonesis | 1.00E-20 |
| Burkholderia sp. | 8.00E-10 |
| Sphingomonas sp. | 8.00E-10 |
| Cellumonas sp. | 6.00E-11 |
Tabel 1: udvalgte BLASTN analyseresultater. Jord metagenomics DNA sekvenser underkastes BLASTN lighed søgning mod NCBI ikke-redundante nukleotid database. De data, der indberettes har e-værdier af 4 x e-4 eller mindre.
| Protein | Organisme |
| Hypotetiske protein | Acidobacter bakterie |
| SAM afhængige methyltransferase | H. denitrificans |
| ATPase | Jannaschia sp. |
| Endopeptidase | Shigella sonnei |
| Lysis protein | E. coli |
Tabel 2: valgt BLASTX analyseresultater. Jord metagenomics DNA sekvenser underkastes BLASTX lighed søgning mod NCBI ikke-redundante protein database.
Supplerende figur 1: Platform QC resultater. Resultaterne af platform QC præsenteres. I øverste højre hjørne er resultaterne af QC for aktive porer. Hver kvadrant af cellen flow er testet for aktive porer. Forsiden er dynamisk og ændres, når hver kvadrant er testet. I dette løb, blev 1,414 enkelt porer opdaget.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: konvertere FAST5 filer til FASTQ filer. Her er i højre side, output af data fra sekventering run. Hver linje repræsenterer en enkelte sekvens. I venstre side af figuren viser den markerede sekvens fra højre side, i HDF-fremviser, der konverterer sekvensen til en FASTQ fil, som kan bruges til yderligere analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: eksempel på FASTQ sekvens i HDF viewer. Denne sekvens (Læs 803) er i en FASTQ-fil, der konverterer FAST5 data til nukleotider. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Mange næste generation sekventering metoder er blevet genereret og hver afhænger sekventering af syntese men påvisning platforme til at identificere nukleotider afviger. NS, den seneste tilføjelse til marketplace, bruger en anden metode helt, som ikke kræver en sekventering reaktion eller mærket nukleotider. Denne metode tager fordel af afgift differentialet for allerede indarbejdet nukleotider, som de passerer gennem en elektrificeret pore. Identifikation af hver enkelt nucleotid opstår ved graduering af den elektriske strøm af de forskellige baser som de passerer gennem nanopore. Denne multipleksede system tillader brugeren at sekvens mange fragmenter ad gangen. Ved sekventering begge dele af DNA, nøjagtigheden af sekvensen er steget betydeligt og sekvensering software, der kan indlæses på en bærbar computer, behandler signalerne og indeholder oplysninger om rækkefølgen kan analyseres.
I pyrosequencing, en sekventering af syntese (SBS) metode, afhænger påvisning af specifikke basen indarbejdet i skabelonen luciferase analysen og generation af kemiluminescerende signaler8. I ion semiconductor sekventering registreres de frigivne brintion, som falder pH-værdien af en ion sensor9. Enkelt molekyle real-time sekventering afhænger nul mode bølge guide (ZMW)-10, som lyser for registrering af en fluorescerende molekyle markeret til den indbyggede nukleotid. SBS bruger en unik metode til at forstærke target-DNA, sådan klynger af unikke sekvenser er genereret13. Påvisning af den tilføjede nukleotid opnås når fluorescens af mærket nukleotid registreres. NS har derimod unikke fordel frem for andre metoder, idet det kræver begrænset teknisk ressourcer, er transportabel, producerer længe sekventering læser, kræver ingen forudgående DNA-forstærkning og kan betjenes på en reduceret pris i forhold til andre metoder. Vores studerende fundet nyere, hurtige bibliotek prep protokollen at være ligetil og imødekommenhed over for en tre timers lab klasse. Nogle af de problemer, vi stødte på var bobler i cellen flow, som var vanskelige at fjerne, det krævede betydelige computerkraft (en terabyte lagerplads), den nuværende produktion af data er i en FAST5 fil og sekventering flow celle har en begrænset holdbarhed inden det forringes. Andre ulemper ved NS ligatur sekventering protocol (lang protokol) er derudover at det kræver flere bibliotek forberedelsestrin, kræver ekspertise i molekylærbiologiske teknikker og genererer reduceret sekventering troskab i forhold til nogle sekventering metoder3. Men de seneste fremskridt med den nye hurtige bibliotek forberedelse kit kræver kun 10 min til biblioteket forberedelse og har påvist en reduceret sekventering fejlprocent. Den nye bibliotek forberedelse metode var meget modtagelig for brug i en lab klasse.
Der er flere kritiske trin i protokollen, navnlig i QC af cellen flow. Dette omfatter udfører en indledende QC senest fem dage efter modtagelsen af cellen flow og bruger dem inden for 8 uger. Selv om vi har brugt flow celler, der var ud over 8 uger, er antallet af åbne/aktiv porer stærkt reduceret. Det er vigtigt, at eksperimenter er planlagt til at passe en tidslinje, hvor maksimal udnyttelse af flow celler er opnået. Vi har brugt rengøring protokollen og genbruges flow celler med succes.
Undersøge metagenomics jord udgør en uudnyttet genetiske reservoir af mikrobiel diversitet. For eksempel, ét gram jord anslås for at indeholde mellem 107 - 109 Prokaryote celler14. Derudover er jordorganismer hovedkilden til romanen naturprodukter, enzymer og antibiotika. Således repræsenterer metagenomics DNA sekvens jordanalyse en værdifuld instruktions værktøj for studerende på alle niveauer af uddannelse. NS-teknologi lethed af brug og lave omkostninger gør dette system en meget effektiv undervisningsredskab. Studerende kan sekvens miljøprøver, og efter afslutningen af sekvensen bruge tilgængelige bioinformatik værktøjer til at identificere og karakterisere mikrober og metagenomics sekvenser i analyseprøverne. Ved hjælp af NS teknologi, har studerende ægte hands-on oplevelse, som har indtil nu været ud af nå til brug i laboratoriet kurser på grund af den avancerede tekniske ekspertise og høje reagens, udstyr og vedligeholdelse omkostninger i andre sekventering platforme. For nylig, en af vores studerende (J. Harrison, personlig meddelelse) rapporterede anvendelsen af denne teknologi i en miljømæssig overvågning projekt af farm jord. Vi forventer, at der vil være mange flere ansøgninger om denne teknologi i uddannelse plads.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Dette projekt blev støtte delvis ved Johns Hopkins University, Office af Provst gennem den Gateway Science initiativ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R.
