Summary
Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen heeft brede toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van ziekteverwekkers, voedsel veiligheid controle genomic analyse, metagenomic milieumonitoring en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica. In dit artikel wordt de procedure voor het rangschikken van het DNA van de bodem van het metagenomic voor soorten identificatie met behulp van de technologie van het rangschikken nanopore aangetoond.
Abstract
Dit artikel beschrijft de stappen voor de bouw van een DNA-bibliotheek van de bodem, voorbereiding en het gebruik van de cel van de stroom nanopore, en analyse van de DNA-sequenties geïdentificeerd met behulp van computersoftware. Nanopore DNA sequencing is een flexibele techniek die voor snelle microbiële genoom sequencing te identificeren van bacteriële en virale soorten, zorgt te karakteriseren bacteriestammen, en om op te sporen van genetische mutaties die verlenen van resistentie tegen antibiotica. De voordelen van de nanopore rangschikking (NS) voor life sciences zijn haar lage complexiteit, lagere kosten en snelle real-time sequentiebepaling van gezuiverde genomic DNA, PCR waarbij, cDNA monsters of RNA. NS is een voorbeeld van "strand sequencing" waarbij DNA sequencing door het begeleiden van een enkele gestrande DNA-molecule door middel van een nanopore dat is ingevoegd in een synthetisch polymeer-membraan. Het membraan is een elektrische stroom overheen, dus als de individuele honken passeren van de nanopore de elektrostroom zijhetelkinverschillende mate wordt verstoord door de vier basen nucleotide toegepast. De identificatie van elk nucleotide treedt op door het detecteren van de karakteristieke modulatie van de elektrische stroom door de verschillende basen als ze de nanopore passeren. Het NS-systeem bestaat uit een handheld, USB aangedreven draagbaar apparaat en een wegwerp stroom cel een matrix van nanopore bevat. Het draagbare apparaat aangesloten op een standaard laptopcomputer die leest en registreert de opeenvolging van DNA met behulp van computersoftware.
Introduction
Het doel van deze procedure is om aan te tonen de stappen die nodig zijn voor de voorbereiding van een milieu bibliotheek van DNA sequencing, gebruik van een nanopore stroom cel sequencing apparaat, en voor het uitvoeren van de analyse van de gegenereerde DNA-sequenties met behulp van system-software en het National Center for biotechnologie informatie (NCBI) bioinformatica tools te identificeren van microbiële soorten in de bodem. Momenteel vereisen de meeste DNA sequencing platformen een grote investering in technische opleiding en complexe instrumentatie, die niet haalbaar in resource slechte omgevingen of in veld toepassingen is. De nanopore sequencing (NS) platform elimineert deze problemen met een kosten-effectieve, eenvoudig te gebruiken protocol van de voorbereiding van de bibliotheek en een draagbaar apparaat om de volgorde en analyseren van een verscheidenheid van verschillende types van nucleïnezuren1,3. We hebben de NS platform verwerkt in verschillende klassen van de lab voor studenten van de master's degree.
Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen gebleken breed toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van bacteriële en virale ziekteverwekkers1,2,6, milieu biodiversiteit studies, voedsel veiligheid controle, genomic analyse3,5, en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica4. NS is een snelle en nauwkeurige methode om reeks nucleic zuren die is gebaseerd op het beginsel van "sequencing strand" door het detecteren van elektrische verstoring door individuele nucleotide basen wanneer één gestrande DNA een nanopore ingevoegd in een geëlektrificeerde passeert synthetische polymeren membraan. De stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van DNA voor NS omvatten genoom fragmentatie, einde reparatie en 3' dA-tailing van genomic fragmenten, adapter en ketting gloeien tot het DNA, DNA bibliotheek zuivering en het laden van de bibliotheek in het nanopore apparaat voor de cel van de stroom. Fragmentatie van het genoom in ~ 8 kb grootte wordt bereikt door centrifugeren van 1-2 µg genomic DNA door middel van een g-buis fragmentatie buis. De gefragmenteerde genomic uiteinden zijn vervolgens gerepareerd en tailed met poly dA met behulp van een commercieel beschikbare kit. Één gestrande adapter sequenties, die verenigbaar met de nanopore motor proteïne zijn, worden toegevoegd aan DNA-uiteinden die worden gebruikt voor het begeleiden van de opeenvolging van DNA door de nanopore (Figuur 1). De tether-sequenties zijn vereist voor de zuivering van het DNA en voor het lokaliseren van de DNA moleculen naar de porie-membraan. De haarspeld wordt gegenereerd door een haarspeld-adapter op één uiteinde van de staart bibliotheek van dA ligating. De haarspeld structuren aan de uiteinden van DNA kunnen lezen van de betekenis en antisense strengen als het DNA passeert de nanopore (Figuur 2). De bereid genomic bibliotheek wordt dan gezuiverd van de reactie met behulp van daar kralen met behulp van een magnetisch veld, gevolgd door het laden van het monster naar de nanopore stroom cel voor analyse.
De gesequenceerd DNA is beoordeeld op kwaliteit en sequencing leest die acceptabel voor analyse zijn zijn vervolgens onderworpen aan verschillende bioinformatica tools te identificeren van microben. De sequenties worden "vertaald" in een FASTQ van een FAST5 indeling. Het formaat van de FASTQ, kunnen de sequenties vervolgens worden gebruikt in BLAST analyse.
Protocol
Opmerking: Metagenomic DNA wordt gezuiverd van de bodem (Baltimore County, Maryland) met behulp van een commercieel beschikbare bodem genomic isolatie kit (Zie Tabel van materialen). Met behulp van een UV spectrofotometer (Zie Tabel of Materials), het gezuiverde genomic DNA moet een 260/280 (nm) verhouding > 1.8 en een 260/230 verhouding tussen 2.0-2.2 te verzekeren dat het monster vrij is van contaminanten. Het bedrag van de genomic DNA dat vereist is voor NS varieert van 200 ng 2 µg.
1. Stroomversnelling Library voorbereiding methode (korte Protocol)
Opmerking: Dit is een korte protocol. Zie Tabel van materialen voor de snelle sequencing kit.
- In een 0,2 mL (Zie Tabel van materialen) dunwandige buis 200 toevoegen ng van ultrahoog moleculair gewicht DNA in een finale van volume van 7,5 µL van gedistilleerd water.
- Voeg 2.5 µL van fragmentatie mix (FM) van de snelle bibliotheek voorbereiding kit en meng zachtjes door inversie. Pulse centrifuge te draaien naar beneden (1.000 x g voor 5 s).
- Leg het monster in een thermocycler (Zie Tabel of Materials) voor een ronde bij 30 ° C gedurende 1 min gevolgd door 75 ° C gedurende 1 min. verwijderen de centrifuge buis en pols te draaien naar beneden van het monster.
- Voeg 1 µL van snelle adapter en 0.2 µL van bot/TA ligase master mix, en vervolgens het opslaan van de bibliotheek aangepast en vastgebonden op ijs.
Opmerking: Als u via het korte protocol verder met stap 8
2. afbinding Sequencing Protocol (lange Protocol): Metagenomic DNA fragmentatie
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de afbinding sequencing kit.
- Verdunnen 1 µg gezuiverde genomic DNA tot een eindvolume van 46 µL in gedeïoniseerd water.
- Overdracht aan de fragmentatie van een DNA Monster buis (Zie Tabel van materialen) en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur op 8.000 x g met behulp van een microcentrifuge (Zie Tabel of Materials) voor de productie van ~ 8 kb genomic fragmenten. Zorg ervoor dat alle van de vloeistof in de buis van de collectie is verstreken.
- Omkeren van de buis van de versnippering, teruggaan naar de centrifuge en centrifuge voor 1 min om te verzamelen van de gefragmenteerde genomic DNA in de tweede kamer.
- De gefragmenteerde genomic DNA overbrengen naar een steriel laag-DNA-bindende 1,5 mL-buis, en een gedeelte van een laag percentage agarose gel (0,6%) om te bevestigen van versnippering te analyseren > 30 kb.
3. gefragmenteerd Genomic DNA einde-voorbereiding
- Met behulp van 800 ng van gefragmenteerde genomic DNA in 45 µL van gedeïoniseerd water, voeg 7 µL einde-prep reactie (Zie Tabel van materialen), 3 µL enzym mix buffer (Zie Tabel of Materials), en 5 µL van nuclease gratis water.
- Meng door inversie en pulsstand centrifuge (1.000 x g voor 5 s).
- Monster overbrengen in een 0,2 mL dunwandige buis en monster gedurende 5 minuten bij 20 ° C, gevolgd door incubatie bij 65 ° C gedurende 5 minuten uit te broeden.
- Pulse centrifuge om inhoud aan de onderkant van de buis.
- Monster overbrengen in een tube van 1,5 mL laag-DNA-bindende microcentrifuge.
- Magnetische kralen (Zie tabel van materialen) voor te bereiden. 60 µL van de geresuspendeerde kralen aan de einde prep reactie toevoegen uit stap 3.5 en meng door pipetteren.
- Incubeer op een rotator mixer op 100 rpm (Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Pulse Centrifugeer het monster naar de kralen pellet en leg het monster naast magneet.
- Zodra de magneet de kralen zijn nageleefd, Pipetteer af supernatant en negeren.
- De buis uit de kralen van de magneet en wassen met 200 µL van vers bereide 70% ethanol verwijderen door zachtjes pipetteren het monster en neergaande.
- Pulse centrifuge pellet de kralen en terugkeren naar de magneet.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien. Herhaal de stap van de wassen opnieuw met behulp van 200 µL van 70% ethanol.
- Pulse centrifugeren van de buis, terug te keren naar de magneet en verwijder alle de 70% ethanol wassen.
- Met de microcentrifuge buis deksel open, toestaan de kralen in de lucht droog gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de buis uit magneet en Suspendeer de pellet in 31 µL van steriele, nuclease-gratis water. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Terug de buis naar de magneet totdat alle kralen hebben Ingehuld en het eluaat duidelijk is.
- Het eluaat overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Met behulp van 1 µL van het monster, het kwantificeren van de einde-klaargestoomd DNA met behulp van een UV spectrofotometer op 260 nm (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Het percentage herstel moet ~ 70% (700 ng) van een beginconcentratie van 1 µg genomic DNA.
4. adapter en Tether toevoeging aan einde-klaargestoomd Genomic DNA-fragmenten
- Meng alle de bot/TA ligase master mix buizen door inversie en vervolgens pulse centrifuge om inhoud aan de onderkant.
- Met behulp van 30 µL van eind-klaargestoomd DNA, Voeg 20 µL van adapter mix en 50 µL van bot/TA afbinding master mix.
- Meng door inversie, pulse centrifuge, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. magnetische Bead voorbereiding
- Vortex de kralen en vervolgens overdracht 50 µL van zwevende parels aan een 1,5 mL microfuge buis.
- Plaats de buis op de magneet aan de kralen pellet, totdat het eluaat geleegd.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien.
- Voeg 100 µL van de kraal bindende buffer (Zie Tabel van materialen voor parelkit) pellet aan de kralen, vortex aan resuspendeer de parels, de kralen aan de magneet, verwijder het supernatant en negeren. Herhaal het wassen met 100 µL van bindende buffer.
- Voeg 100 µL van de kraal bindende buffer aan de gewassen kralen. Vortex aan resuspendeer de kralen.
6. bibliotheek zuivering
- Met behulp van een P200-micropipet, voeg 40 µL van parels uit de vorige stap tot het aangepast/aangebonden genomic DNA. Meng het monster zorgvuldig door pipetteren.
- Incubeer het monster op een rotator mixer bij 100 t/min gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats van het monster aan de magneet en laat de kralen te regelen. Pipetteer af het supernatant en gooi deze weg.
- Resuspendeer de kralen in 140 µL van kraal bindende buffer door pipetteren. Leg het monster tegen de magneet, verwijder het supernatant en wassen opnieuw met een andere 140 µL van kraal bindende buffer.
- Pulse centrifugeren van de buis, de buis op de magneet voor 2 min. de resterende kraal bindende buffer verwijderen uit de pellet.
7. de elutie van bibliotheek van magneet kralen
- Resuspendeer de magnetische kralen in 15 µL van elutie buffer door pipetteren. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis tegen de magneet aan de pellet van de kralen.
Opmerking: Het percentage herstel moet ~ 25% (250 ng) van een beginconcentratie van 1 µg genomic DNA.
8. het starten van een Run/kwaliteitscontrole
- Verwijder de stroom cel uit verpakking en hechten van de stroom-cel met de draagbare, real-time sequencer (Zie Tabel van materialen).
- De sequencer aansluit op een computer via USB-kabel en start de sequencing software (Zie Tabel van materialen).
- Klik op "Connect" apparaat via de sequencing software, selecteer "NC_Platform_QC.py" en klik op "Start".
- De kwaliteitscontrole (QC) duurt ongeveer 6-7 min te voltooien; zoekt u een 'zee van groen' (grote gebieden van uitvoer) op de QC-uitlezing te bevestigen zijn er genoeg actieve poriën (> 800) voor het rangschikken van DNA.
9. Start een Sequencing Run
- Open het programma sequencing; Er verschijnt een dialoogvenster. In het vak Voorbeeld ID naam het monster.
- Klik op het vak "Flow Cell ID" en voer de code gevonden op de sticker op de bovenkant van de cel van de stroom.
- Open het deksel van de cel stroom en schuif de cover monster poort rechts (rechtsom) zodat de poort monster zichtbaar is. Zodra de poort open, controleren voor een kleine luchtbel is. Verwijder een paar microliters van buffer met inbegrip van de zeepbel.
- Controleren om er zeker van te zijn dat er buffer over de sensor-array. De priming buffer te maken door het mengen van 480 µL van het runnen van de buffer met brandstofmix (RBF-1, zie de Tabel van materialen) (zorg ervoor dat u meng grondig eerste) met 520 µL nuclease-gratis water.
- 800 µL van de priming buffer aan de priming-poort toevoegen. Trek voorzichtig de cover "SpotOn" om deze toegankelijk te maken.
- Na 5 min, voeg toe een extra 200 µL van priming buffer aan de priming-poort.
10. veilig laden van de bibliotheek
- Voor de voorbereiding van de plaats van de bibliotheek de volgende reagentia op ijs: RBF-1 (vanaf de sequencing-kit), aangepast en aangebonden bibliotheek en bibliotheek laden kralen (LLB; uit de sequencing-kit).
- Een centrifugebuis 0,2 mL toevoegen 25,5 µL van RBF en 12 µL van nuclease-gratis water bewaard bij kamertemperatuur.
- Meng de LLB door pipetteren en neergaande. 26.5 µL van de LLB aan de buis 0.2 µL toevoegen. Meng de reagentia door pipetteren en neergaande.
Opmerking: De LLB heeft de neiging om uit het mengsel te regelen. - 11 µL van de bibliotheek aangepast en vastgebonden aan de buis 0.2 µL toevoegen. Meng door inversie en spin down door puls centrifugeren.
- Toevoegen van 75 µL van monster uit stap 9.4 aan de poort van de "SpotOn" ontkleuring. Zorg ervoor dat elke daling mondt uit in de poort voor het toevoegen van de volgende.
- Zorgvuldig de monster poort cover vervangen zodat de bung de poort treedt, en vervang het apparaat deksel.
11. starten een Sequencing Software Protocol Script
- Open de dropdown-menu onder 'Selecteer programma' en selecteer "48 uur sequencing."
- Klik op de knop "Uitvoeren" om te beginnen het script.
- Bekijk de resultaten van de Mux scan gemeld in de stroom van de kennisgeving voor het aantal actieve poriën in de MUX scannen.
Opmerking: Dit nummer kan afwijken van het aantal poriën in de QC uitvoeren en een groot verschil kan wijzen op een probleem.- Als er een aanzienlijke vermindering van de actieve poriën van de QC-run, opnieuw opstarten van de software, en als er nog een significant verschil, herstart de computer.
- Controleer of de temperatuur koelplaat 34 ° C, is zoals gerapporteerd door het script van sequencing software.
Opmerking: Als de temperatuur niet bij 34 ° C dan zal niet er genoeg actieve poriën voor de run. - Controleer het histogram van Lees lengtes om te bepalen of de lengte van de reeks verwacht en geschikt is voor de proefopzet.
- Sluit de desktop agent die met behulp van 'close x.' Quit de sequencing software door het sluiten van de web GUI. Koppel het apparaat los van de computer.
12. analyse van Run en resultaten
Opmerking: Tijdens de sequencing, de gegevens kan worden gecontroleerd met behulp van het "Rapport weergeven"-programma met behulp van de desktop agent. Tijdens of na de run voltooid is, de bestanden zijn beschikbaar in een bestandsindeling in het gegevens → leest → pass map (standaard) FAST5. Als deze map geopend is terwijl sequencing actief is, is de computer vastlopen.
- Kunnen bekijken en manipuleren van reeksen downloaden van een "HDFViewer".
- De volgorde om bestanden te bekijken, direct open HDF viewer → open Data map → Selecteer die alle bestand typen → Selecteer C: schijf (standaard) → gegevens selecteren → Selecteer leest → select pass.
- Zoek en selecteer het bestand FASTQ in het linker keuzemenu; bestanden wordt geopend en in FASTQ-indeling kunnen worden opgeslagen.
Opmerking: Met het oog op de student experiment, sequenties van 350 nucleotiden of langer werden geselecteerd voor verdere analyse. Uitvoer van de base roeping kan de gebruiker om te sorteren op volgorde leest op basis van grootte. FASTQ bestanden kunnen worden geanalyseerd via BLAST (NCBI) of andere bioinformatics programma's.
Representative Results
Het experimentele ontwerp en nanopore technologie verstrekt een snelle en goedkope methode voor studenten om te bodem DNA-sequentie. De representatieve run doorgegeven de afstellingsparameters van kwaliteit met meer dan 800 poriën beschikbaar voor het rangschikken. De run resulteerde in meer dan 125.000 leest beschikbaar voor studie met een lengte van de mediane opeenvolging van 5.38 kb. Sequenties zijn gegeven een kwaliteitsscore en alleen deze sequenties met aanvaardbare scores werden vervolgens geanalyseerd. Als de uitvoer van de sequencing is reactie in FAST5-indeling, die wordt niet geaccepteerd door programma's zoals BLAST (NCBI), de sequenties werden bekeken in de HDF-viewer die de sequenties die zijn omgezet in FASTQ formaat, dat compatibel voor BLAST analyse is. In de toekomst iteraties van de software, zullen de gegevens beschikbaar als een FASTQ formaat, eliminerend de behoefte aan de HDF-viewer. Zie aanvullende cijfers 1, 2 en 3.
Vijftig sequenties van meer dan 350 nucleotiden in lengte waren onderworpen aan analyse per BLASTN (nucleotiden tegen nucleotide-database) of BLASTX (nucleotiden aminozuur reeks vertaald) (NCBI) te identificeren van de organismen in het bodemmonster. Gezien de tijd beperkingen van de klasse en dat de focus van de cursus op laboratoriummethoden en niet bioinformatics is, we hebben de studenten analyseren sequenties binnen deze parameters. Onze klassen bioinformatica kunnen gebruiken de gegevens voor ontwikkeling van pijpleiding analyse-instrumenten. Dit niveau van bioinformatica analyse wordt niet gedekt in het laboratorium gebaseerd klasse. Tabel 1 is een lijst van de organismen die werden aangeduid met e waarden van minder dan 4 e-04. In het algemeen, e-waarden kleiner dan 4 e-04 geven sterke gelijkenis tussen de input sequentie (query) en de gevonden reeks. De organismen aangeduid met BLASTN (tegen de niet-redundante (nr) database) zijn uit een grote verscheidenheid van soorten en zijn beschikbaar voor verdere genomic en eiwit analyses. In dit voorbeeld van de bodem, die afkomstig uit een tuin in Baltimore County, MD waren had nooit getest, dus geen vorige gegevens waaruit om te bepalen wat organismen in de bodem zou kunnen zijn. BLASTN-analyse (tegen de nr database)-analyse wordt tevens aangegeven er waren sequenties met geen overeenkomsten in de database van nr. Om te bepalen of deze echt roman sequenties, is verder onderzoek nodig. Analyse van verschillende reeksen van BLASTX bleek verschillende eiwitten uit organismen niet vertegenwoordigd in de analyse van de BLASTN. Tabel 2 de lijsten verschillende mogelijke eiwitten, met inbegrip van Endopeptidasen, en ATPasen-achtige eiwitten. Met behulp van deze bibliotheek van sequenties, hebben studenten de mogelijkheid geavanceerdere bioinformatica tools gebruiken voor het uitvoeren van verdere analyse, als geregisseerd door de instructeur.
Figuur 1 : Genomic bibliotheek voorbereiding. Stappen voor de voorbereiding van genomic bibliotheek van DNA sequencing met behulp van nanopore technologie. Dit cijfer is gewijzigd met de vereiste machtigingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Schematische van DNA sequencing met behulp van een nanopore. DNA passeren een nanopore membraan met elektrisch signaal generatie en base identificatie. Dit cijfer is gewijzigd met de vereiste machtigingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Organisme | e waarde |
| Streptomyces sp. | 3.00E-06 |
| Nocardoides sp. | 5.00E-04 |
| Gordonia sp. | 5.00E-04 |
| Hyphomicrobium nitrativorens | 1.00E-139 |
| Starkeya novelle | 1.00E-31 |
| Hyphomicrobium denitrificans | 1.00E-30 |
| Fibomicrobium sp. | 5.00E-17 |
| Pseudomonas sp. | 2.00E-15 |
| Rhodothemus marinus | 1.00E-17 |
| Turneiella parva | 2.00E-24 |
| E. coli | 0.00E + 00 |
| Bradyrhizobium sp. | 3.00E-30 |
| Gemmatirosa kalamazoonesis | 1.00E-20 |
| Burkholderia sp. | 8.00E-10 |
| Sphingomonas sp. | 8.00E-10 |
| Cellumonas sp. | 6.00E-11 |
Tabel 1: resultaten van BLASTN analyse geselecteerd. De bodem van metagenomics DNA-sequenties onderworpen aan BLASTN gelijkaardigheidsonderzoek tegen de NCBI niet-redundante nucleotide database. De ingediende gegevens hebben e-waarden van 4 x e-4 of minder.
| Eiwit | Organisme |
| Hypothetische eiwit | Acidobacter bacterie |
| SAM afhankelijk methyltransferase | H. denitrificans |
| ATPase | Jannaschia sp. |
| Endopeptidase | Shigella sonnei |
| Lysis van de eiwitten | E. coli |
Tabel 2: geselecteerd van de resultaten van de analyse BLASTX. De bodem van metagenomics DNA-sequenties onderworpen aan BLASTX gelijkaardigheidsonderzoek tegen de NCBI niet-redundante eiwit database.
Aanvullende figuur 1: Platform QC resultaten. De resultaten van het platform QC worden gepresenteerd. Zijn de resultaten van de QC voor actieve poriën in de hogere juiste hoek. Elk kwadrant van de stroom-cel wordt getest voor actieve poriën. De belangrijkste pagina is dynamisch en verandert nadat elk kwadrant is getest. Op deze termijn werden 1.414 één poriën ontdekt.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2: FAST5 converteren van bestanden tot FASTQ bestanden. Hier is aan de rechterkant, de output van de gegevens uit de volgorde uitvoeren. Elke regel vertegenwoordigt een afzonderlijke reeks. De linkerkant van de figuur toont de gemarkeerde volgorde vanaf de rechterkant, in de HDF-viewer die de volgorde wordt omgezet in een FASTQ-bestand dat kan worden gebruikt voor verdere analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 3: voorbeeld van FASTQ volgorde in HDF viewer. Deze volgorde (Lees 803) is in een FASTQ-bestand dat de FAST5 gegevens naar nucleotiden converteert. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Vele volgende generatie sequencing methoden zijn gegenereerd en elk hangt af van het rangschikken door synthese, maar de detectie-platforms voor het identificeren van nucleotiden verschillen. NS, de meest recente toevoeging aan de markt, gebruikt een andere methode volledig, die hoeft niet de reactie van een sequentie of label nucleotiden. Deze methode maakt gebruik van de gratis differentieel van reeds opgenomen nucleotiden als ze een geëlektrificeerde porie passeren. De identificatie van elk nucleotide treedt op door de modulatie van de elektrische stroom door de verschillende basen als ze de nanopore passeren. Dit multiplexed systeem kan de gebruiker naar de volgnummer van vele fragmenten tegelijk. Door beide strengen van DNA sequencing, de nauwkeurigheid van de sequentie wordt aanzienlijk verhoogd en de sequencing software, die kan worden geladen op een laptopcomputer, verwerkt de signalen en biedt de sequentie-informatie die kan worden geanalyseerd.
In pyrosequencing, een rangschikken door synthese (SBS) methode en hangt opsporing van de specifieke base in de sjabloon opgenomen af van de luciferase assay en de generatie van chemiluminescentie signalen8. In ion halfgeleider sequencing, wordt het vrijgegeven waterstof ion, dat de pH vermindert gedetecteerd door een ion sensor9. Enkel molecuul real-time sequencing, hangt af van de nul modus Golf gids (ZMW)10, die verlicht voor de detectie van een TL molecuul aan de opgenomen nucleotide gelabeld. SBS een unieke methode gebruikt voor het versterken van doelDNA zodanig dat clusters van unieke reeksen gegenereerde13. Detectie van de toegevoegde nucleotide wordt bereikt wanneer de fluorescentie van de tagged nucleotide is opgenomen. NS heeft aan de andere kant uniek voordeel ten opzichte van andere methoden in dat het beperkte technische middelen vereist, draagbaar is, lang sequencing leest produceert, geen voorafgaande versterking van DNA vereist, en tegen een verminderde prijs, vergeleken met andere methoden kan worden bediend. Onze studenten de nieuwere, snelle bibliotheek prep protocol eenvoudig en vatbaar voor een drie uur durende lab klasse aangetroffen. Enkele van de kwesties die we tegenkwamen waren bubbels in de cel van de stroom die moeilijk waren te verwijderen, het vereist aanzienlijke computer macht (één terabyte aan opslagruimte), de huidige output van gegevens is in een FAST5-bestand en de sequencing stroom cel heeft een beperkte houdbaarheid voordat het verslechtert. Daarnaast andere nadelen van het NS afbinding sequencing protocol (lange) is dat het vereist verschillende bibliotheek voorbereiding stappen vereist expertise in moleculaire biologietechnieken en genereert verminderde sequencing trouw in vergelijking met sommige sequencing methodologieën3. Echter, recente vooruitgang met de nieuwe snelle library voorbereiding kit vereist slechts 10 min voor de voorbereiding van de bibliotheek en een verminderde sequencing foutenpercentage heeft aangetoond. De nieuwe bibliotheek-voorbereiding methode was zeer vatbaar voor gebruik in een lab-klasse.
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol, met name in de QC van de stroom-cel. Dit omvat het uitvoeren van een eerste QC binnen vijf dagen na de ontvangst van de cel van de stroom en met behulp van hen binnen acht weken. Hoewel we hebben stroom cellen die buiten 8 weken werden gebruikt, is het aantal open/actieve poriën sterk verminderd. Het is belangrijk dat experimenten zijn gepland om te passen een tijdlijn waar maximaal gebruik van de cellen van de stroom is bereikt. Wij hebben de schoonmaak protocol gebruikt en hergebruikt de cellen van de stroom met succes.
Onderzoekt de metagenomics bodem vertegenwoordigen een onaangesproken genetische reservoir van microbiële diversiteit. Bijvoorbeeld, een gram van de bodem wordt geschat op tussen de 10 bevatten7 - 109 prokaryotische cellen14. Bovendien zijn de organismen in de bodem een hoofdbron van roman natuurproducten, enzymen en antibiotica. Bodem metagenomics DNA sequentieanalyse vormt aldus, een waardevol educatief hulpmiddel voor studenten op alle niveaus van het onderwijs. Van de technologie van de NS gebruiksgemak en lage kosten maken dit systeem een zeer effectieve leermiddel. Studenten kunnen volgnummer milieu monsters, en na voltooiing van de reeks gebruiken beschikbaar bioinformatica tools te identificeren en te karakteriseren van microben en metagenomics sequenties van analysemonsters. Met de technologie van de NS hebben studenten echte hands-on ervaring, die heeft tot nu toe uit bereiken voor gebruik in laboratorium cursussen vanwege de geavanceerde technische deskundigheid en hoge reagens, apparatuur en het onderhoud kosten in andere sequencing-platforms. Een van onze studenten (J. Harrison, persoonlijke mededeling) rapporteerde onlangs, het gebruik van deze technologie in een controle milieuproject van boerderij bodems. Wij verwachten dat er veel meer toepassingen voor deze technologie in het onderwijs ruimte zullen.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatieverschaffing.
Acknowledgments
Dit project was steun ten dele door de Johns Hopkins University, Office van de Provost via de Gateway wetenschap initiatief.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R.
