Summary
Nanopore-teknologi for sekvensering biomolecules har bred programmer i biovitenskap, inkludert identifikasjon av patogener, mat sikkerhet overvåking, genomisk analyse, metagenomic miljøovervåking og karakterisering av bakteriell antibiotikaresistens. Prosedyren for metagenomic jord DNA sekvensering for identifisering av arter bruker nanopore sekvensering teknologi er demonstrert i denne artikkelen.
Abstract
Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten for bygging av et DNA-bibliotek fra jord forberedelse og bruk av nanopore flyt cellen, og analyse av DNA-sekvenser som er identifisert ved hjelp av programvare. Nanopore DNA sekvensering er en fleksibel teknikk som tillater rask mikrobiell genomet sekvensering å identifisere bakterielle og virale arter, til å karakterisere bakteriell stammer, og oppdage genetiske mutasjoner som overdrar resistens mot antibiotika. Fordelene med nanopore sekvensering (NS) for biovitenskap inkluderer dens lav kompleksitet, reduserte kostnader og raske sanntid sekvensering av renset genomisk DNA, PCR amplicons, cDNA prøver eller RNA. NS er et eksempel på "strand sekvensering" som innebærer sekvensering DNA ved å føre en enkelt strandet DNA-molekyl gjennom en nanopore som settes inn i en syntetisk polymermembran. Membranen er en elektrisk strøm over det, slik som personlige baser passerer gjennom nanopore den elektriske strømmen blir forstyrret i varierende grad av fire nucleotide baser. Identifikasjon av hver nucleotide oppstår ved å registrere karakteristiske modulering av den elektriske strømmen av ulike baser idet de passerer gjennom nanopore. NS systemet består av en håndholdt, USB drevet transportabel apparat og en engangs flyt celle som inneholder en nanopore-matrise. Den bærbare enheten kobles til en standard bærbar datamaskin som leser og registrerer DNA sekvensen ved hjelp av programvare.
Introduction
Målet med denne prosedyren er å vise trinnene som kreves for utarbeidelse av en miljømessig DNET bibliotek for sekvensering, utnyttelse av en nanopore flyt celle sekvensering enhet, og utføre analyse av de genererte DNA-sekvensene med systemprogramvaren og National Center for bioteknologi informasjon (NCBI) Bioinformatikk verktøy å identifisere mikrobielle arter i jord. Dag, krever de fleste DNA sekvensering plattformer større investeringer i teknisk opplæring og komplekse instrumentering, som ikke er gjennomførbart i ressurs dårlig miljøer eller i feltet programmer. Nanopore (NS)-sekvensering plattformen eliminerer problemene med en kostnadseffektiv, enkel å bruke biblioteket forberedelse protokollen og en bærbar enhet sekvens og analysere en rekke ulike typer nukleinsyrer1,3. Vi har tatt NS plattformen i flere lab klasser for mastergradstudenter.
Nanopore-teknologi for sekvensering biomolecules har vist bred programmer i biovitenskap, inkludert identifikasjon av bakteriell og viral patogener1,2,6, miljømessige biologisk mangfold studier, mat sikkerhet overvåking, genomisk analyse3,5og karakterisering av bakteriell antibiotikaresistens4. NS er en rask og nøyaktig metode for sekvensen nucleic syrer som er basert på prinsippet om "tråd sekvensering" av oppdager elektrisk forstyrrelse av personlige nucleotide baser når enkelt strandet DNA passerer gjennom et nanopore settes inn i en elektrisk syntetisk polymermembran. Trinnene involvert i utarbeidelsen DNA for NS inkluderer genomet fragmentering, slutten reparasjon og 3 dA tailing genomisk fragmenter, adapter og tjore annealing til DNA, DNA biblioteket rensing og laste biblioteket i nanopore flyt celle enheten. Fragmentering av genomet i ~ 8 kb størrelser oppnås ved sentrifugering 1-2 µg genomisk DNA gjennom en g-rør fragmentering rør. Fragmentert genomisk ender deretter reparert og tailed med poly dA bruke en kommersielt tilgjengelig kit. Enkelt strandet kort sekvenser, som er kompatible med nanopore motor protein, legges til DNA ender som brukes til å lede DNA sekvensen gjennom nanopore (figur 1). Tjore sekvensene kreves for DNA rensing og lokalisere DNA molekyler til pore membranen. Hårnål genereres ligating en hårnål-adapteren til den ene enden av dA tailed biblioteket. Hårnål strukturer i DNA endene kan lese fornuft og antisense tråder DNA passerer nanopore (figur 2). Forberedt genomisk biblioteket er så renset reaksjonen ved hjelp streptavidin perler ved hjelp av et magnetfelt, etterfulgt av laste utvalget i nanopore flyt cellen for analyse.
Sekvensert DNA vurderes for kvalitet og sekvensering leser som godtas for analyse er så utsatt for flere Bioinformatikk verktøy for å identifisere mikrober. Sekvensene er "oversatt" til en FASTQ til et FAST5 format. I FASTQ format, kan sekvenser deretter brukes i VINDKAST analyse.
Protocol
Merk: Metagenomic DNA er renset fra jord (Baltimore County, Maryland) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig jord genomisk isolering kit (se Tabell for materiale). Bruke en UV spektrofotometer (se Tabell for materiale), renset genomisk DNA bør ha 260/280 (nm) forholdet > 1,8 og 260/230 forholdet mellom 2.0-2.2 å sikre at prøven er fri for forurensning. Mengden av genomisk DNA kreves for NS spenner fra 200 ng til 2 µg.
1. rask bibliotek forberedelse-metoden (kort Protocol)
Merk: Dette er en kort protokoll. Se Tabellen for materiale for rask sekvensering kit.
- I en 0,2 mL tynnvegget tube (se Tabell for materiale) legge 200 ng av høy molekylvekt DNA i en endelig av volumet av 7,5 µL destillert vann.
- Legge til 2,5 µL av fragmentering mix (FM) fra rask biblioteket forberedelse kit og bland forsiktig ved inversjon. Puls sentrifuge å spinne ned (1000 x g for 5 s).
- Plasser prøven i en thermocycler (se Tabell for materiale) for en runde på 30 ° C i 1 min etterfulgt av 75 ° C i 1 fjerne rør og puls sentrifuge å spinne ned prøven.
- Legg 1 µL rask adapter og 0,2 µL blunt/TA ligase master mix, og deretter lagre tilpasset og bundet biblioteket på is.
Merk: Hvis bruker kort protokollen fortsetter til trinn 8
2. ligation sekvensering Protocol (lang Protocol): Metagenomic DNA fragmentering
Merk: Se Tabell for materiale for hemorroider sekvensering kit.
- Fortynne 1 µg renset genomisk DNA til et endelig antall 46 µL i deionisert vann.
- Overføre prøven til en DNA fragmentering tube (se Tabell for materiale) og sentrifuge for 1 min ved romtemperatur 8000 x g ved hjelp av en microcentrifuge (se Tabell of Materials) til å produsere ~ 8 kb genomisk fragmenter. Kontroller at all væsken har gått inn i samling røret.
- Invertere fragmentering røret, tilbake til sentrifuge og sentrifuge for 1 min til samler fragmenterte genomisk DNA i nedre kammeret.
- Overføre fragmentert genomisk DNA slik 1,5 mL steril lav-DNA bindende og analysere en del på en lav prosentandel agarose gel (0,6%) å bekrefte fragmentering til > 30 kb.
3. fragmentert genomisk DNA slutten-forberedelser
- Bruke 800 ng fragmentert genomisk DNA 45 µL deionisert vann, legge til 7 µL slutten-prep reaksjon buffer (se Tabell for materiale), 3 µL enzym blanding (se Tabell for materiale), og 5 µL av nuclease gratis vann.
- Blandingen av inversjon og puls sentrifuger (1000 x g for 5 s).
- Overføre eksempel slik 0,2 mL tynne vegger og ruge utvalg for 5 min på 20 ° C, etterfulgt av inkubasjon ved 65 ° C i 5 minutter.
- Puls sentrifuge å bringe innholdet til bunnen av røret.
- Overføre eksempel slik 1,5 mL lav-DNA bindende microcentrifuge.
- Forberede magnetiske perler (se tabell av materialer). Legg 60 µL av resuspended perler til slutt prep reaksjonen fra trinn 3.5 og blanding av pipettering.
- Ruge på en rotator mikser på 100 rpm (se Tabell for materiale) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Puls sentrifuge prøve å pellets perler, og plasser prøven ved magnet.
- Når perlene følges magneten, Pipetter nedbryting og kast.
- Fjerne røret fra magnet og vask perler med 200 µL av nylagde 70% etanol ved forsiktig pipettering prøven opp.
- Puls sentrifuge pellets perler og gå tilbake til magneten.
- Fjerne nedbryting og kast. Gjenta trinnet vask igjen med 200 µL av 70% etanol.
- Puls sentrifuge røret, tilbake til magneten og fjerne alle 70% etanol vask.
- Microcentrifuge rør lokket åpent, tillate perler til luft tørr i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern røret fra magnet og avbryte pellet 31 µL steril, nuclease uten vann. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
- Tilbake røret til magneten til alle perler har pelleted og eluate er klar.
- Overføring av eluate til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Bruker 1 µL av prøven, kvantifisere slutten-prepped DNA bruker et UV spektrofotometer på 260 nm (se Tabell for materiale).
Merk: Prosent utvinning bør være ~ 70% (700 ng) fra en start konsentrasjon av 1 µg genomisk DNA.
4. kort og tjore tillegg til slutten-prepped genomisk DNA fragmenter
- Bland alle blunt/TA ligase master mix rør ved inversjon, og deretter pulsen sentrifuge å bringe innholdet til bunnen.
- Bruker 30 µL av slutt-prepped DNA, legge til 20 µL av kortet og 50 µL blunt/TA ligation master mix.
- Bland ved inversjon, puls sentrifuge, og ruge i 10 min ved romtemperatur.
5. magnetiske Bead forberedelse
- Vortex perler og deretter overføre 50 µL av suspendert perler til en 1,5 mL microfuge rør.
- Sett røret på magneten til pellets perler før eluate forsvinner.
- Fjerne nedbryting og kast.
- Legge til 100 µL perle bindende bufferen (se Tabell for materiale for perle kit) til perlene, vortex å resuspend perler, pellets perlene på magnet, fjerne nedbryting og kast. Gjenta vask med 100 µL bindende bufferen.
- Legge til 100 µL perle bindende bufferen vasket perler. Vortex å resuspend perler.
6. biblioteket rensing
- Bruker P200 brønnene, legge 40 µL av perler fra forrige trinn til tilpasset/bundet genomisk DNA. Bland prøven nøye ved pipettering.
- Inkuber prøven på en rotator mikser på 100 rpm i 5 minutter ved romtemperatur.
- Plasser prøven på magneten og la perler å bosette seg. Pipetter av nedbryting og kast.
- Resuspend perler i 140 µL av perle bindende buffer av pipettering. Plasser prøven mot magneten forkaste nedbryting og vask igjen med en annen 140 µL perle bindende bufferen.
- Puls sentrifuge røret, sett røret på magnet for 2 min. fjerner resterende perle bindende bufferen fra pellet.
7. elueringsrør bibliotek fra Magnet perler
- Resuspend magnetiske perler i 15 µL av elueringsbufferen av pipettering. Inkuber utvalget for 10 min ved romtemperatur.
- Sett røret mot magneten til pellets perler.
Merk: Prosent utvinning bør være ~ 25% (250 ng) fra en start konsentrasjon av 1 µg genomisk DNA.
8. starte en løpe/kvalitetskontroll
- Fjern flyt cellen fra emballasje og knytte flyt cellen til den bærbare, real-time sequenceren (se Tabell for materiale).
- Fest sequenceren til en datamaskin via USB-kabel og start sekvensering programvare (se Tabell for materiale).
- Klikk på "Connect" enhet gjennom sekvensering programvaren, velg "NC_Platform_QC.py" og klikk "Start".
- Kvalitetskontroll (QC) tar ca 6-7 minutter å fullføre; se etter et hav av grønt (store områder av) på QC avlesning å bekrefte at det er nok aktive porene (> 800) for DNA sekvensering.
9. startet sekvensering kjørt
- Åpne sekvensering programmet; en dialogboks vil vises. I boksen eksempel ID navn prøven.
- Klikk på boksen "Flow celle ID" og angi koden på klistremerket på flyt cellen.
- Åpne flyt celle lokket og skyv portdeksel prøven til høyre (med klokken) slik at prøven porten er synlig. Når porten er åpen, sjekk for en liten boble. Fjerne noen microliters bufferen inkludert boblen.
- Kontroller at det er buffer over sensor array. Gjøre grunning bufferen ved å blande 480 µL kjøre buffer med drivstoff blanding (RBF-1, se Tabellen for materiale) (Husk å blande grundig første) med 520 µL nuclease-fritt vann.
- Legge til 800 µL grunning bufferstørrelsen til grunning porten. Nøye løft "SpotOn" dekselet for å gjøre det tilgjengelig.
- Etter 5 min, legge en ytterligere 200 µL grunning bufferen til grunning porten.
10. lasting biblioteket
- Før du tilbereder biblioteket stedet følgende reagensene på is: RBF-1 (fra sekvensering kit), tilpasset og bundet biblioteket og bibliotekinnlasting perler (LLB, fra sekvensering kit).
- Slik 0,2 mL sentrifuge legge 25,5 µL av RBF og 12 µL av nuclease-fritt vann holdt ved romtemperatur.
- Bland i LLB ved pipettering opp. Legge til 26.5 µL av LLB 0,2 µL røret. Bland reagensene ved pipettering opp.
Merk: LLB tendens til å bosette seg ut av blandingen. - Legge til 11 µL av tilpasset og bundet biblioteket 0,2 µL røret. Bland ved inversjon og spinn av puls sentrifugering.
- Legge til 75 µL av eksempel fra trinn 9.4 "SpotOn" porten dropwise. Kontroller at hver dråpe flyter inn i porten før du legger til neste.
- Nøye erstatte portdeksel eksempel slik at spunsen inn porten og erstatte enheten lokket.
11. Start en sekvensering programvare protokollen skript
- Åpne dropdown menyen under "Velg Program" og velg "48 timers sekvensering."
- Klikk på knappen "Execute" å starte skriptet.
- Sjekk resultatene av den Mux skanne rapportert i varsling strømmen av aktive porene i MUX skanne.
Merk: Dette antallet kan variere fra antall porene i QC kjøre og en stor forskjell kan indikere et problem.- Hvis det er en betydelig reduksjon av aktive porene fra QC-kjøre Start programvaren, og hvis det er fortsatt en betydelig forskjell, gjenstarte computeren.
- Kontroller at heatsink temperaturen er 34 ° C som rapportert av skriptet sekvensering programvare.
Merk: Hvis temperaturen er ikke på 34 ° C så det vil ikke være nok aktive porene for Kjør. - Sjekke histogrammet av Les langt for å finne ut om sekvens lengder er forventet og hensiktsmessig for eksperimentell design.
- Lukk desktop agent bruker 'close x.' Avslutt sekvensering programvare ved å stenge ned Internett GUI. Koble enheten fra datamaskinen.
12. analyse av løpe og resultater
Merk: Under sekvensering kjøre, den kan overvåkes ved hjelp av "Vis rapport" programmet bruker desktop agent. Under eller etter kjøringen er fullført, er tilgjengelige i en FAST5 filformatet i data → leser → passere mappen (standard). Hvis mappen er åpen mens sekvensering er aktiv, kan datamaskinen fryse.
- Vise og manipulere sekvenser, laste ned en "HDFViewer".
- For å vise rekkefølgen filene, direkte åpne HDF seer → åpne Data mappen → Velg alle arkiv typer → Velg C: stasjon (standard) → Velg → Velg leser → Velg pass.
- Finn og velg filen FASTQ i venstre dropdown menyen. filene åpnes og kan lagres i FASTQ format.
Merk: For student-eksperiment sekvenser av 350 nukleotider eller lengre ble valgt for videre analyse. Utdata fra base kall tillater brukeren å sortere rekkefølgen leser basert på størrelse. FASTQ filer kan analyseres via BLAST (NCBI) eller andre bioinformatikk programmer.
Representative Results
Eksperimentell design og nanopore teknologien gitt en rask og rimelig metode for studenter å sekvens jord DNA. Representant kjøre gikk parameterne kvalitetskontroll med mer enn 800 porene tilgjengelig for sekvenser. Kjør resulterte i over 125 000 leser tilgjengelig for studien med en median sekvens lengde 5,38 kB. Sekvenser gis kvalitetspoeng og bare de sekvensene med akseptabel score ble deretter analysert. Avgang av sekvensering er reaksjon i FAST5 format, som ikke er akseptert av programmer som BLAST (NCBI), sekvenser ble vist i HDF betrakteren som konverterer sekvenser til FASTQ format, som er kompatibel for BLAST analyse. I fremtidige gjentakelser av programvaren, data vil være tilgjengelig som en FASTQ format, eliminerer behovet for HDF betrakteren. Se supplerende tallene 1, 2 og 3.
Femti sekvenser av over 350 nukleotider i lengde var underlagt analyse av BLASTN (nukleotider mot nukleotid database) eller BLASTX (nukleotider oversatt til aminosyresekvens) (NCBI) for å identifisere organismer i jord utvalget. Gitt tiden begrensninger av klassen og at selvfølgelig fokuserer laboratorium metoder og ikke bioinformatikk har vi studenter analysere sekvenser innen disse parameterne. Våre bioinformatikk klasser kan bruke dataene for utvikling av rørledningen Analyseverktøy. Dette nivået av bioinformatikk analysen dekkes ikke i laboratory basert klassen. Tabell 1 er en liste over organismer som ble identifisert med e verdier av mindre enn 4 e-04. Vanligvis indikerer e-verdier mindre enn 4 e-04 sterk likhet mellom inndatasekvensen (spørring) og matchet sekvensen. Organismene identifisert av BLASTN (mot ikke-redundant (nr) databasen) fra en rekke arter og er tilgjengelig for ytterligere genomisk og protein analyser. Denne prøven av jord, som kom fra en hage i Baltimore County, MD hadde aldri testet, så det var ingen tidligere data å avgjøre hva organismer kan være i jord. BLASTN analyse (mot nr databasen) analyse også indikert var sekvenser med ingen likheter i nr databasen. Videre studier er nødvendig for å avgjøre om dette er virkelig romanen sekvenser. Analyse av flere sekvenser av BLASTX avdekket flere proteiner fra organismer ikke representert i BLASTN analysen. Tabell 2 viser flere mulige proteiner som endopeptidases og ATPases-lignende proteiner. Bruke dette biblioteket sekvenser, har studentene mulighet til å bruke mer avanserte Bioinformatikk verktøy til å utføre ytterligere analyse, hvis regissert av instruktøren.
Figur 1 : Genomic biblioteket forberedelse. Trinn for utarbeidelse av genomisk DNET bibliotek for sekvensering med nanopore teknologi. Dette tallet er endret tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Skjematisk av DNA sekvensering med en nanopore. DNA passerer gjennom en nanopore membran med elektrisk signal generasjon og base identifikasjon. Dette tallet er endret tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Organisme | e verdi |
| Streptomyces sp. | 3.00E-06 |
| Nocardoides sp. | 5.00E-04 |
| Gordonia sp. | 5.00E-04 |
| Hyphomicrobium nitrativorens | 1.00E-139 |
| Starkeya novella | 1.00E-31 |
| Hyphomicrobium denitrificans | 1.00E-30 |
| Fibomicrobium sp. | 5.00E-17 |
| Pseudomonas sp. | 2.00E-15 |
| Rhodothemus marinus | 1.00E-17 |
| Turneiella leste og respekterte skriftene | 2.00E-24 |
| E. coli | 0.00E + 00 |
| Bradyrhizobium sp. | 3.00E-30 |
| Gemmatirosa kalamazoonesis | 1.00E-20 |
| Stokk sp. | 8.00E-10 |
| Sphingomonas sp. | 8.00E-10 |
| Cellumonas sp. | 6.00E-11 |
Tabell 1: Utvalgte resultater av BLASTN analyse. Jord metagenomics DNA-sekvenser som er utsatt for BLASTN likhet søk mot NCBI ikke-redundant nukleotid databasen. Data rapportert har e-verdier på 4 x e-4 eller mindre.
| Protein | Organisme |
| Hypotetisk protein | Acidobacter bakterie |
| SAM avhengige methyltransferase | H. denitrificans |
| ATPase | Jannaschia sp. |
| Endopeptidase | Shigella sonnei |
| Lysis protein | E. coli |
Tabell 2: Utvalgte resultater av BLASTX analyse. Jord metagenomics DNA-sekvenser som er utsatt for BLASTX likhet søk mot NCBI ikke-redundant protein databasen.
Ekstra figur 1: plattform QC resultater. Resultatene av plattformen QC presenteres. I øvre høyre hjørne er resultatene av QC for aktive porene. Hver kvadrant av flyt cellen er testet for aktive porene. Hovedsiden er dynamisk og endres som hver kvadrant er testet. I denne ble 1,414 enkelt porene oppdaget.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 2: konvertere FAST5 filer til FASTQ filer. Her er på høyre side, resultatet av dataene fra sekvensering kjøre. Hver linje representerer en enkelt sekvens. Venstre side av figuren viser merkede sekvensen fra høyre side i HDF visningsprogrammet som konverterer sekvensen til en FASTQ-fil som kan brukes for videre analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 3: eksempel på FASTQ rekkefølgen HDF seer. Denne sekvensen (Les 803) er en FASTQ fil som konverterer FAST5 dataene til nukleotider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Mange neste generasjons sekvensering metoder har blitt generert og hver avhenger sekvensering av vanillin men gjenkjenning plattformene for å identifisere nukleotider varierer. NS, den nyeste tillegg til markedet, bruker en annen metode helt, som ikke krever en sekvensering reaksjon eller merket nukleotider. Denne metoden tar nytte av gratis differensial allerede innarbeidet nukleotider idet de passerer gjennom en elektrifisert pore. Identifikasjon av hver nucleotide oppstår av modulering av den elektriske strømmen av ulike baser som de passerer gjennom nanopore. Multiplex systemet lar brukeren sekvens mange fragmenter samtidig. Med sekvensering både tråder av DNA, nøyaktigheten av sekvensen er betydelig økt og sekvensering programvare, som kan lastes inn i en bærbar datamaskin, behandler signalene og gir oppstartsrekkefølgen som kan analyseres.
I pyrosequencing, en sekvensering av syntese (SBS) metoden, avhenger oppdagelsen av bestemt base innlemmet i malen luciferase analysen og generering av chemiluminescent signaler8. I ion semiconductor sekvensering oppdages den utgitte hydrogenion, som reduserer pH av en ion sensor9. Ett molekyl sanntid sekvensering avhenger på null modus bølge guide (ZMW)-10, som lyser opp for gjenkjenning et fluorescerende molekyl merket med innarbeidet nukleotid. SBS bruker en unik metode for å forsterke målet DNA slik at klynger av unike sekvenser generert13. Påvisning av den ekstra nukleotid oppnås når fluorescens av merket nukleotid registreres. NS har derimot unik fordel over andre metoder i at det krever begrenset tekniske ressurser, bærbar, produserer lenge sekvensering leser, krever ingen tidligere DNA amplifikasjon og kan brukes til en redusert pris sammenlignet med andre metoder. Studentene fant nyere, rask bibliotek prep protokollen for å kunne bruke mottakelig for en tre timers lab klasse. Noen av spørsmålene vi møtte var bobler i flyt cellen som var vanskelig å fjerne, det kreves betydelig datakraft (en terabyte lagringsplass), dagens produksjon av dataene er i en FAST5-fil og sekvensering flyt cellen har begrenset holdbarhet før det forverres. I tillegg ulemper av NS Ligation sekvensering protokollen (lang protocol) er at det krever flere bibliotek forberedelsene krever kompetanse i molekylærbiologi teknikker og genererer redusert sekvensering gjengivelsen når sammenlignet med noen sekvensering metoder3. Men nylige fremskritt med nye raske biblioteket forberedelse kit krever bare 10 min for biblioteket forberedelse og har vist en redusert sekvensering feil. Den nye bibliotek forberedelse metoden var svært mottakelig for bruk i en lab klasse.
Det er flere viktige trinn i protokollen, spesielt i QC flyt cellen. Dette inkluderer utfører en innledende QC innen fem dager etter mottak av flyt cellen og bruke dem innen 8 uker. Selv om vi har brukt flyt celler som var utenfor 8 uker, redusert antall åpne/aktiv porene sterkt. Det er viktig at eksperimenter er planlagt å passe en tidslinje hvor det oppnås maksimal bruk av flyt cellene. Vi har brukt rengjøring protokollen og gjenbrukt flyt cellene med suksess.
Undersøker metagenomics av jord representere en uutnyttet genetisk reservoar av mikrobielle mangfold. For eksempel ett gram jord er anslått for å inneholde mellom 107 - 109 prokaryote celler14. Videre er jord organismer en viktig kilde til romanen naturlige produkter, enzymer og antibiotika. Dermed representerer jord metagenomics DNA sekvens analyse et verdifullt instruksjonsvideoer verktøy for studenter på alle nivå av utdanning. NS teknologien er enkel bruk og lav pris gjør systemet svært effektive læringsverktøy. Studenter kan sekvens miljøprøver og ved ferdigstillelse av sekvensen bruke tilgjengelig Bioinformatikk verktøy for å identifisere og karakterisere mikrober og metagenomics sekvenser i test prøver. Studenter bruker NS teknologien, og har ekte hands-on erfaring, som har til nå vært ute av rekkevidde for bruk i laboratoriet kurs avansert teknisk ekspertise og høye reagens, utstyr og vedlikehold kostnader i andre sekvensering plattformer. Nylig rapporterte en av våre studenter (J. Harrison, personlig kommunikasjon) bruk av denne teknologien i et overvåking miljøprosjekt av gården jord. Vi forventer at det vil være mange flere programmer for denne teknologien i utdanning plass.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Dette prosjektet var støtte delvis ved Johns Hopkins University, kontor Provost gjennom den Gateway vitenskap initiativ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R.
