Summary
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.
Abstract
ניוון של נוירונים מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית בתגובה על פגיעה, מתח, מחלה. סימפטומים הסלולר של התנוונות העצבית דומים להפליא אצל בני אדם וחסרי חוליות כמו המנגנונים המולקולריים המניעים תהליכים אלה. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster , מספק אורגניזם מודל גנטי פשוט אך פשוט כדי לחקור את המורכבות הסלולרית של מחלות נוירודגנרטיבי. למעשה, כ 70% מכלל גנים אנושיים הקשורים למחלה יש homolog דרוזופילה וכן שפע של כלי מבחנים תוארו באמצעות זבובים כדי לחקור מחלות ניווניות אנושיות. באופן ספציפי יותר הצומת neuromuscular (NMJ) ב תסיסנית הוכיחה להיות מערכת יעילה ללמוד מחלות neuromuscular בגלל היכולת לנתח את הקשרים המבניים בין הנוירון לשריר. הנה, אנו מדווחים על vivo המנוע assay פגיעה נוירון תסיסנית , אשרReproducibly גורם neurodegeneration ב NMJ על ידי 24 שעות. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו רצף זמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך ניוון נוירונים מוטוריים. שיטת הפציעה יש יישומים מגוונים יש גם נוצלו כדי לזהות גנים ספציפיים הדרושים neurodegeneration ו לנתח תגובות תמליל לפציעה העצבית.
Introduction
ניוון עצבי מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית יכול להיגרם על ידי תהליך ההזדקנות הטבעי, פציעה, מתח, או מצבי מחלה. תסיסנית melanogaster , זבוב הפירות המשותף, מספק אורגניזם מודל פשוט וחזק ללמוד neurodegeneration בשל הדמיון המדהים של המנגנונים המולקולריים המניעים את התנוונות של נוירונים. קווי דמיון אלה מודגשים על ידי העובדה כי כ -70% של גנים אנושיים הקשורים המחלה יש הומולוג תסיסנית . 1 בנוסף, מבחני רבים וכלים טכנולוגיים ללמוד מחלות נוירודגנרטיביות אנושית פותחו וניצל תסיסנית . 2 , 3 בתוך תסיסנית , צומת neuromuscular (NMJ) מאפשר ניתוח של תכונות הסלולר והן אלקטרופיזיולוגיים הוכיח להיות מערכת חשובה ללמוד מחלות neuromuscular בשל n גלויחיבורי שריר יורון. 2 במחקר זה, אנו מתארים את assay פגיעה vivo נוירון בזחלים תסיסנית המאפשר הפציעה לשחזור של עצבים סגמנטליים. זו פגיעה motoneuron התוצאות ברצף הזמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך neurodegeneration ב NMJ 24 שעות לאחר הפציעה. היכולת לשכפל מוטורונורונים פגמים וכתוצאה מכך neurodegeneration יש יישומים מגוונים כגון זיהוי גנים ספציפיים הנדרשים לתהליך ניוונית, דיסקציה של תגובות תעתיק פציעה עצבית, וניתוח של מפלים איתות מגן. 4 , 5 , 6 שיטה זו שימשה גם בשילוב עם microfluidics ללמוד ניוון העצב התחדשות בבעלי חיים. 7
אנו מנצלים assay כמותי הוקמה לבחון degenerat נוירון המנועיון ב NMJ תסיסנית לאחר פגיעה מכנית. Assay זה מבוסס על העובדה כי אובדן של קרום presynaptic וחלבונים קודמת פירוק של reticulum subsynaptic (SSR) המאופיינת על ידי foldynaptic קרום שרירי הקפלים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 assay זה מאפשר כימות של "טביעות רגליים סינפטי" שבו נוירון מראש סינפטי איבד את הקשר השריר postsynaptic הסמוך. תהליך ניוונית הוכח להיות פרוגרסיבי לאורך התפתחות הזחל 12 ולא ניתן להסביר על ידי שינוי סינפסה שינוי או נבטים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 המודעההתצפית של שימוש פגיעה מכנית על מוטציות preexisting היא שזה מאפשר לנתיחה של רצף הזמני של אירועים סלולריים המוביל עד neurodegeneration ב NMJ. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של ריאגנטים וציוד
- הכן 1x הצפת Dissection (70 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.02 מ"מ CaCl 2 , 20 מ"מ MgCl 2 , 10 מ"מ NaHCO 3 , סוכרוז 115 מ"מ, 5 מ"מ טרילהוז, 5 מ"מ HEPES, pH 7.2).
- הכן 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
- הכן 1x PBT באמצעות 1x PBS עם 0.01% Triton X-100.
- הכן מיץ פירות אגר צלחות. 14 בקצרה, לערבב אגר 30 גרם 700 מ"ל של H 2 O ו החיטוי. ממיסים 0.5 גרם של Paraben מתיל 10 מ"ל של אתנול ולהוסיף פתרון 300 מ"ל של מיץ פירות להתרכז (ענבים או תפוח). מערבבים להתרכז פתרון אגר autoclaved ויוצקים לתוך המכסים של 10 מ"מ x 35 מ"מ צלחות פטרי.
הערה: פריקקס אגר ענבים כוח ניתן גם לרכוש מחברות שונות (ראה Tabls של חומרים ). - השג גודל 5 מלקחיים המאפשרים אחד מכני לפגוע בזחלים.
- השתמש תקן תסיסנית CO 2
2. בחירת זחלים תסיסנית
- קח בקבוקון או בקבוק תסיסנית המכיל זחלים instar השלישי נודדים כי כבר מתורבת ב 25 ° C.
- בחר 10 בודדים 2 nd או 3 rd insta הזחלים מבוסס על המראה. הזחלים instar השלישי יכול להיות מזוהה על ידי המראה של spiracles מסועף הקדמי, בעוד הזחלים instar השני הם קטנים יותר יש יותר כמו מועדון spiracles הקדמי.
הערה: ניתן לזהות את שלבי הזחל גם על ידי תזמון. ב 25 ° C, הזחלים instar השני מופיעים כ 48 שעות לאחר הבקיעה, ואת השלישי זחלי instar זחילה כ 24 שעות מאוחר יותר. אם מעוניינים לבחון neurodegeneration ב NMJ, הזחלים instar השני צריך להיפגע.
הכנת זחלים תסיסנית עבור פגיעה מכנית
- בזהירות לבחור זחלים בודדים על ידי מלקחיים או מכחול, להיות זהיריםלא לדחוס אותו בכל מקרה.
- מקום ישר עשר זחלים לתוך צלחת זכוכית המכיל קר 1X PBS או חיץ לנתיחה להסיר כל פסולת מזון כדי להאט את תנועת הזחל.
4. מכני פגיעה וטיפול של זחלים תסיסנית
- מניחים כל זחל בודדים על מנגנון הרדמה CO 2 .
- תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות לגלגל כל זחל על הצד הגבי שלהם כדי לדמיין את עצבי הסגמנטלי דרך לציפורן.
- מיקום בגודל 5 מלקחיים כ 1/2 ל 2/3 דרך לאורך הזחל החל בפה ווים. לאחר מיקומו, קמצוץ כ 1/3 של לציפורן הגחון המכיל את העצבים הסגמנטליים עם גודל 5 מלקחיים.
- כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפצעו, להחיל כוח מספיק כדי למחוץ את עצבי הסגמנטלי אבל לעזוב את לציפורן ללא פגע. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של כוח, לרסק 10 זחלים ולהבטיחשיעור התמותה לאחר 5 שעות מתחת ל -50%.
- לאחר פגיעה, בזהירות להעביר זחלים לצלחת אגר מיץ פירות המכיל כ 0.5 גרם של שמרים להדביק. מניחים כל זחל כך הקצה הקדמי שלה על הדבק שמרים, להמשך האכלה למרות תנועתיות משובשת.
הערה: כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפגעו, תנועתיות הזחל שיבשו ניתן לראות לאחר העברת צלחת אגר. הזחל נפגע משותק למעשה האחורי לאתר הפציעה, אבל עדיין יכול להזיז את הפה ווים שלהם להאכיל. שיעור תמותה גבוה של בעלי חיים לאחר פגיעה הוא נפוץ ולכן עדיף לפגוע 20-50% יותר בעלי חיים ממה שנחוץ לניסוי. - מקום צלחות אגר המכיל להדביק שמרים 10 זחלים פצע לתוך תחתית של צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ ריקה. מכסים את צלחת פטרי, המכיל עכשיו את הזחלים הפגועים על צלחת אגר עם מגבת נייר לחה, להבטיח כי מגבת נייר לא לגעת הזחלים או צלחות אגר. מקום זהצלחת פטרי לתוך מיכל חזק יותר אוויר, ב RT.
- אחזר זחלים לנתיחה לאחר תקופות שנקבעו (6, 12, או 24 שעות) שלאחר הפציעה.
הערה: כדי לבחון את ההשפעות המיידיות של פגיעה על השלד של axonal, הזחלים ניתן לגזור ישירות לאחר הפציעה. כדי לבחון פגמים הובלה אקסונל, הזחלים ניתן לגזור כ 6 שעות לאחר הפציעה. בערך 12 שעות לאחר הפציעה הצטברות של חלבונים אוביקטיניטד ניתן לראות, ו 24 שעות לאחר הפציעה, ניוון של נוירונים המנוע ב NMJ ניתן לצפות.
5. ניתוח של Neurodegeneration ב NMJ
- לנתח תסיסנית הזחל NMJ כפי שתואר לעיל. 15 , 16 בקצרה, הזחלים פין על צלחת Sylgard, לחתוך לאורך פני הגבי, ואת פילה עם סיכות בטיפה של חיץ לנתיחה לחשוף את שרירי הגוף בגוף. תקן הזחלים או paraformaldehyde 4% (PFA) או פתרון של בויין בהתאם אנטיגופים המשמשים לדמיין נוירונים ושרירים.
הערה: קיבוע PFA יש להשתמש אם תגי חלבון ניאון, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא להיות דמיינו כמו מקבע של בווין יכול להיות קשה מדי. - ביצוע immunofluorescence, אשר תוארה בעבר 11 , 13 , 16 , כדי לסמן בו זמנית נוירונים המנוע presynaptic ו סמינרי (SSR) סף שרירים. דמיינו קרום presynaptic ו אקסונים עם peroxidase חזרת פלואורסצנטי מצומדות (HRP) (1: 300) 17 אזורי פעיל יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים נגד ברוכפילוט (Brp) (nc82, 1: 100, מחקרים התפתחותיים היברידומה בנק). במקביל, תווית שרירים פוסט-סינפטיים עם נוגדנים נוגדי-דיכאון גדולים (D: 1) (1: 10,000). 18
- בצע assay הוקמה לכימות neurodegeneration ב NMJ כפי שתואר לעיל. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 בקצרה, במקביל לדמיין NMJs בודדים הן לפני ואחרי תאים סינפטיים. כל boutons שכותרתו עם סמנים postsynaptic אבל לא סמנים presynaptic מצביעים על אתרים של neurodegeneration ( איור 1 ). המספר הממוצע של boutons לכל NMJ כמו גם את המספר הממוצע של NMJs לכל חיה ניתן לכמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הנוהל המוצג כאן, יש לנו הוכיח כי פגיעה מכנית העצבית מאפשרת לנתיחה הזמני של אירועים נוירודגנרטיביים. 14 , 18 רצף האירועים כבר מאופיין בעבר ומתחיל עם הפרעה מיידית של השלד, ואחריו פגמים הסחר אקסונל, הצטברות של חלבונים הנמצאים ubiquitinated, ו neurodegeneration הבאים 24 שעות לאחר הפציעה. לפני הפציעה, WT NMJs להראות את האזור presynaptic פעיל סמן ברפ ב אפוזיציה סמן postsynaptic Dlg בכל NMJ כולו ( איור 1 א ). פגיעה מכנית של עצבים סגמנטליים יכולה לגרום להתפתחות נוירו-דגנרטיון בינונית עד קשה, שבה boutons מוכתמים עם Dlg עכשיו חוסר presynaptic פעיל אזור חלבון Brp ( איור 1B ). כל bouton כי הוא מוכתם Dlg אבל חסר מכתים Brp נחשב "synטביעת aptic" ואפשר לסמוך לכמת כאירוע ניווניות. שניהם תדירות וחומרת פנוטיפ ניווניות ניתן לכמת כפי שתואר לעיל. 11
איור 1: פגיעה מכנית נוירונלית גורם neurodegeneration ב NMJ של שריר 6/7. ( א ) NMJs Uninjured להראות מראש סינפטי סמן אזור פעיל, Brp (ירוק) ב אפוזיציה עם סמן postsynaptic, Dlg (אדום) בכל NMJ. ( ב ) פגיעה מכנית נוירונלית גורם neurodegeneration המצוין על ידי Dlg מוכתמת boutons (אדום) עם אובדן של Brp. ראשי חץ מצביעים על אתרים בודדים של ניוון מוחי. סולם בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלהדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פגיעה מכנית העצבית שתוארה קודם לכן הפגינו כאן יכול לשמש כדי לגרום לפציעה / מתח העצבים הסגמנטליים של הזחלים תסיסנית . 4 , 5 , 6 , 14 טכניקה זו ניסיוני כבר מועסקים בעבר לנתח את הרצף הזמני של אירועים המוביל neurodegeneration, כמו גם לבחון שינויים תעתיק בגופם התא הנייד נוירון שלאחר הפציעה. 5 , 14 בנוסף, טכניקה זו תוארה בשיתוף עם שבבי microfluidics כדי לבחון ולחקור ניוון axonal ו התחדשות בזחלים תסיסנית . 7 מגבלות של טכניקה זו כוללות מוות של הזחלים עקב ניקוב של לציפורן במהלך הקדמה של הפציעה. עם זאת, מספר גדול של זחלים ניתן למחוץ בשאורט תקופה של זמן כדי להתגבר על שיעור מוות גבוה הזחל. שינוי זה כללנו הוא פציעה של instar 2 nd או הזחלים instar 3 rd מוקדם, שהינה קריטית לדמיין ניוון הנוירון המוטורי בבית NMJ, אשר מתרחשת 24 שעות לאחר פציעה.
כאן, אנו מדגימים כי פגיעה מכנית נוירונים יכול להיות מנוצל ללמוד ניוון נוירון המנוע ב NMJ. אנו משתמשים בשיטה מבוססת כדי לכמת נוירודגנרציה כי מנצל את העובדה נוירונים חלבונים הקשורים שלהם להתנוון מהר יותר מאשר השריר הסמוך. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 כדי לפקח לכמת ניוון, זה קריטי כי NMJ להיות מוכתמים בו זמנית הן סמנים מראש ו postsynaptic. הנה, אנחנו דלהדגים את השימוש של סמן אזור פעיל Brp ואת סמן postsynaptic Dlg, עם זאת, יש שפע של סמנים אחרים מראש ו postsynaptic זמין כי ניתן להשתמש כדי ללמוד neurodegeneration ב NMJ. בנוסף, fluorescently מתויג מולקולות של בחירה של אחד יכול להיות מועסק כדי לחקור את ההשפעות שלהם במהלך תהליך neurodegenerative. ישנן שיטות מסובכות יותר ללמוד ניוון לאחר פגיעה axonal, כגון microfluidics 7 , אבל השיטה שלנו יש מספר יתרונות: 1) הוא זול מאוד, 2) רוב המעבדות תסיסנית כבר יש את הציוד הדרוש, 3) הרקמה קבועה כך מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי ניתן להשתמש כדי לכמת אירועים נוירודגנרטיבים פוסט פוסט.
אנו רואים כי פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לבחון מגוון רחב של מנגנוני הסלולר המולקולריים הקשורים neurodegeneration לאחר הפציעה. בפרט, שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לבחון את behAvior של כל חלבון מתויג fluorescently לפני ואחרי פגיעה נוירונים ניוון נוירון המנוע התחדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדות קלר ומגי באוניברסיטת קוויניפיאק להצעות מועילות. בפרט, ברצוננו להודות Barron L. לינקולן II לפיתוח assay זה פגיעה בתוך המעבדה קלר. כמו כן, ברצוננו להודות Quinnipiac אוניברסיטת קולג 'לאמנויות ומדע גרנט- In-Aid הוענק ל LC קלר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
