Summary
Her beskriver vi en enkel og allment tilgjengelig metode for å skade segmentale nerver i Drosophila larver for å visualisere og kvantifisere nevrogenerasjon av motorneuroner ved det neuromuskulære veikrysset (NMJ) av tredje instar larver.
Abstract
Degenerasjonen av nevroner oppstår under normal utvikling og som respons på skade, stress og sykdom. De cellulære kjennetegnene for nevronal degenerasjon er bemerkelsesverdig lik hos mennesker og vertebrater, som de molekylære mekanismene som driver disse prosessene. Fruktfluen, Drosophila melanogaster , gir en kraftig, men enkel genetisk modellorganisme for å studere de cellulære kompleksiteten av nevrodegenerative sykdommer. Faktisk har omtrent 70% av sykdomsassosierte humane gener en Drosophila- homolog og en mengde verktøy og analyser er blitt beskrevet ved hjelp av fluer for å studere humane neurodegenerative sykdommer. Mer spesifikt har det nevromuskulære veikrysset (NMJ) i Drosophila vist seg å være et effektivt system for å studere nevromuskulære sykdommer på grunn av evnen til å analysere strukturelle forbindelser mellom neuron og muskel. Her rapporterer vi om en in vivo motor neuron skade skadeanalyse i Drosophila , somReproduserbart inducerer nevrodegenerering ved NMJ ved 24 timer. Ved hjelp av denne metoden har vi beskrevet en tidsmessig sekvens av cellulære hendelser som resulterer i degenerasjon av motorneuron. Skadesmetoden har forskjellige anvendelser og har også blitt brukt til å identifisere spesifikke gener som kreves for nevrogenerering og dissekere transkripsjonsresponser på nevronskader.
Introduction
Neuronal degenerasjon oppstår under normal utvikling og kan være forårsaket av naturlig aldringsprosess, skade, stress eller sykdomstilstander. Drosophila melanogaster , den felles fruktfluen, gir en enkel og kraftig modellorganisme for å studere neurodegenerasjon på grunn av de bemerkelsesverdige likhetene i molekylære mekanismer som driver degenerasjonen av nevroner. Disse likhetene er fremhevet av det faktum at ca. 70% av sykdomsassosierte humane gener har en Drosophila homolog. 1 I tillegg har mange analyser og teknologiske verktøy for å studere humane neurodegenerative sykdommer blitt utviklet og utnyttet i Drosophila . 2 , 3 Inne i Drosophila tillater det nevromuskulære krysset (NMJ) analyse av både cellulære og elektrofysiologiske egenskaper og har vist seg å være et viktig system for å studere nevromuskulær sykdom på grunn av den synlige nEuron-muskelforbindelser. 2 I denne studien beskriver vi en in vivo- neuronskadeanalyse i Drosophila larver som tillater reproduserbar skade av segmentale nerver. Denne motoneuron-skaden resulterer i en tidssekvens av cellulære hendelser som resulterer i neurodegenerasjon ved NMJ 24 h etter skade. Evnen til å reproduserbare skader motoneuroner som resulterer i neurodegenerasjon har forskjellige anvendelser, slik som å identifisere spesifikke gener som kreves for degenerative prosesser, disseksjonen av transkripsjonsresponser til nevronskader og analyse av beskyttende signalkaskader. 4 , 5 , 6 Denne metoden har også blitt brukt i kombinasjon med mikrofluidika for å studere neuronal degenerasjon og regenerering hos levende dyr. 7
Vi benytter en etablert kvantitativ analyse for å undersøke motor neuron degeneratIon ved Drosophila NMJ etter mekanisk skade. Denne analysen er basert på det faktum at tap av presynaptisk membran og proteiner foregår demontering av det subsynaptiske retikulum (SSR) karakterisert ved de postsynaptiske muskelmembranfoldene. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Denne analysen tillater kvantifisering av "synaptiske fotavtrykk" der det presynaptiske nevronet har mistet forbindelsen til den tilstøtende postsynaptiske muskelen. Den degenerative prosessen har vist seg å være progressiv gjennom larvalutvikling 12 og kan ikke regnes med endret synapsutvikling eller spiring. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 AnnonsenUtseende for å bruke mekanisk skade over tidligere eksisterende mutasjoner er at den tillater disseksjon av den tidsmessige sekvensen av cellulære hendelser som fører til nevrogenerasjon ved NMJ. 1. 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av reagenser og utstyr
- Forbered 1x Disseksjon buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sukrose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7,2).
- Tilbered 1x fosfatbuffert saltvann (PBS).
- Forbered 1x PBT ved bruk av 1x PBS med 0,01% Triton X-100.
- Forbered fruktsaft-agarplater. 14 Kort beskrevet blandes 30 g agar i 700 ml H2O og autoklav. Oppløs 0,5 g metylparaben i 10 ml etanol og tilsett oppløsning til 300 ml fruktjuicekonsentrat (drue eller eple). Bland konsentrert i autoklavert agaroppløsning og hell i lokkene på 10 mm x 35 mm petriskål.
MERK: Drue agar kraftforblanding kan også kjøpes fra ulike selskaper (se Tabls of Materials ). - Hent størrelse 5 tanger som lar deg mekanisk skade larver.
- Bruk standard Drosophila CO 2
2. Velge Drosophila Larvae
- Ta et hetteglass eller en flaske Drosophila inneholdende vandrende tredje instar larver som har blitt dyrket ved 25 ° C.
- Velg ti individuelle 2. og 3. stadium larver basert på utseende. Tredje instar larver kan identifiseres ved utseendet av fremre forgrenede spirakler, mens andre instar larver er mindre og har flere klubblignende anterior spiracles.
MERK: Larvstadier kan også identifiseres ved timing. Ved 25 ° C, vises andre instar larver ca 48 timer etter klekking, og tredje instar larver smelter omtrent 24 timer senere. Hvis det er interessert i å undersøke nevrodegenerasjon ved NMJ, må andre larver bli skadet.
3. Forberedelse av Drosophila Larvae for mekanisk skade
- Ta forsiktig opp individuelle larver opp med tanger eller en pensel, vær forsiktigIkke å komprimere det i alle fall.
- Plasser ti larver rett inn i glassfat med kald 1X PBS eller disseksjonsbuffer for å fjerne eventuelle matrester og å senke larvalmotiliteten.
4. Mekanisk skade og behandling av Drosophila Larvae
- Plasser hver enkelt larve på et CO 2 bedøvelsesapparat.
- Under et disseksjonsmikroskop skal du forsiktig rulle hver larv på deres dorsale side for å visualisere segmentale nerver gjennom kutikula.
- Posisjonsstørrelse 5 tinger ca. 1/2 til 2/3 vei ned langs larven som starter ved munnkrokene. Når du er plassert, klemmer du ca. 1/3 av ventral kutikula som inneholder segmentale nerver med størrelse 5 tinger.
- For å sikre at larvesegmenter er skadet, bruk tilstrekkelig kraft til å knuse de segmentale nerver, men la nagelen være intakt. For å bestemme riktig mengde kraft, knus 10 larver og sørg forDødsfallet etter 5 timer er under 50%.
- Etter skade, overfør forsiktig larvene til en fruktjuice-agarplate som inneholder omtrent 0,5 g gjærpasta. Plasser hver larve, så den fremre enden er på gjærpastaen, for fortsatt fôring til tross for forstyrret motilitet.
MERK: For å sikre at larvesegmenter har blitt skadet, kan det oppstå forstyrret larvalmotilitet etter overføring til agarplaten. Skadet larva er effektivt lammet bakover til skadestedet, men kan fortsatt bevege munnen kroker og mate. En høy dødelighet av dyr etter skade er vanlig, så det er best å skade 20-50% flere dyr enn det er nødvendig for et forsøk. - Plasser agarplater som inneholder gjærpasta og 10 skadede larver i bunnen av en tom 100 x 15 mm petriskål. Dekk denne petriplaten, som nå inneholder skadede larver på en agarplate med et fuktig papirhåndkle, slik at papirhåndkleet ikke berører larver eller agarplater. Plasser dettePetriskål i en større lufttett beholder, ved RT.
- Hent larver for disseksjon etter spesifiserte perioder (6, 12 eller 24 timer) etter skade.
MERK: For å undersøke umiddelbare effekter av skade på det aksonale cytoskelet kan larver dissekeres umiddelbart etter skade. For å undersøke aksonale transportfeil kan larver dissekeres ca 6 timer etter skade. Ca 12 timer etter skade kan en opphopning av ubiquitinerte proteiner observeres, og 24 timer etter skade kan degenerasjon av motorneuroner hos NMJ observeres.
5. Analyse av neurodegenerasjon ved NMJ
- Dissect Drosophila larval NMJ som beskrevet tidligere. 15 , 16 Kortfattet, pinn larver på en Sylgard plate, kutt langs dorsal overflaten, og filet med pins i en dråpe disseksjon buffer for å avsløre kroppens veggen muskulatur. Fix larver i enten 4% paraformaldehyd (PFA) eller Bouins løsning, avhengig av antiKropper pleide å visualisere neuroner og muskler.
MERK: PFA-fiksering bør brukes hvis fluorescerende protein-koder, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) skal visualiseres som Bouins fikseringsmiddel, kan være for hardt. - Utfør immunfluorescens, som har blitt beskrevet tidligere 11 , 13 , 16 , for samtidig å markere presynaptiske motorneuroner og tilstøtende postsynaptiske (SSR) muskelfoldinger. Visualiser presynaptiske membraner og axoner med fluorescenskonjugert pepperrotperoxidase (HRP) (1: 300) 17 og aktive soner kan farges med et anti-Bruchpilot (Brp) antistoff (nc82; 1: 100; Development Studies Hybridoma Bank). Merk samtidig postsynaptiske muskler med et anti-Dics Large (Dlg) antistoff (1: 10.000). 18
- Utfør en etablert analyse for å kvantifisere nevrodegenerering ved NMJ som beskrevet tidligere. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Kort, visualiser samtidig individuelle NMJ for både pre- og postsynaptiske rom. Noen boutoner merket med postsynaptiske markører, men ikke presynaptiske markører, indikerer steder for neurodegenerasjon ( figur 1 ). Gjennomsnittlig antall boutons per NMJ samt gjennomsnittlig antall NMJ per dyr kan kvantifiseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke prosedyren som presenteres her, har vi vist at mekanisk nevronskader muliggjør midlertidig disseksjon av nevrogenerative hendelser. 14 , 18 Sekvensen av hendelser har tidligere vært karakterisert og begynner med en umiddelbar forstyrrelse av cytoskeletet, etterfulgt av aksonal traffikeringsdefekter, en akkumulering av ubiquitinerte proteiner og etterfølgende neurodegenerasjon 24 timer etter skade. Før skade viser WT NMJs den presynaptiske aktive sonemarkøren Brp i tilslutning til den postsynaptiske markøren Dlg gjennom hele NMJ ( Figur 1A ). Mekanisk skade av segmentale nerver kan indusere moderat til alvorlig nevrogengenerasjon der bontons farget med Dlg nå mangler presynaptisk aktiv sone protein Brp ( Figur 1B ). Enhver bouton som er farget med Dlg, men mangler Brp-farging betraktes som en "synaptic fotavtrykk", og kan telles og kvantifisert som en nevrodegenerativ hendelse. Både hyppigheten og alvorlighetsgraden av den neurodegenerative fenotype kan kvantifiseres som beskrevet tidligere. 11
Figur 1: Mekanisk nevronskader induserer neurodegenerasjon ved NMJ i muskel 6/7. ( A ) Uninjured NMJ viser den presynaptiske aktive sonemarkøren, Brp (grønn) i tilslutning med den postsynaptiske markøren, Dlg (rød) i hele NMJ. ( B ) Neuronal mekanisk skade induserer neurodegenerasjon indikert av Dlg-farget boutons (rød) med tapet av Brp. Arrowheads indikerer enkelte steder for neurodegenerasjon. Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon avDenne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nevron mekanisk skade beskrevet tidligere og demonstrert her kan brukes til å indusere skade / stress i de segmentale nerver av Drosophila larver. 4 , 5 , 6 , 14 Denne eksperimentelle teknikken har tidligere blitt anvendt for å dissekere den tidsmessige rekkefølgen av hendelser som fører til nevrogenerasjon, samt å undersøke transkripsjonelle forandringer i motorneuroncelllegemene etter skade. 5 , 14 I tillegg er denne teknikken blitt beskrevet i forbindelse med mikrofluidikk chips for å observere og studere aksonal degenerasjon og regenerering i Drosophila larver. 7 Begrensninger av denne teknikken inkluderer død av larver på grunn av punktering av kutiklen under innføring av skaden. Imidlertid kan et stort antall larver knuses i en shOrt periode for å overvinne en høy larval dødsrate. En modifikasjon som vi har tatt er den skade av 2. instar eller tidlig 3. instar larver, som er kritisk for å visualisere motoriske nevroner degenerasjon ved NMJ, som skjer 24 timer etter skade.
Her demonstrerer vi at nevronisk mekanisk skade kan utnyttes for å studere motorisk neuron degenerasjon ved NMJ. Vi bruker en etablert metode for å kvantifisere neurodegenerasjon som utnytter det faktum at nevroner og deres tilknyttede proteiner degenererer raskere enn tilstøtende muskler. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 For å observere og kvantifisere nevrodegenerasjon er det kritisk at NMJ samtidig farves for både pre- og postsynaptiske markører. Her dUtstråle bruken av den aktive sonemarkør Brp og den postsynaptiske markøren Dlg, men det finnes en mengde andre pre- og postsynaptiske markører som kan benyttes til å studere neurodegenerasjon ved NMJ. I tillegg kan fluorescens-merkede molekyler du velger, bli brukt til å studere deres effekter under den neurodegenerative prosessen. Det er mer kompliserte metoder for å studere degenerasjon etter aksonal skade, for eksempel mikrofluidics 7 , men vår metode har flere fordeler: 1) det er veldig billig, 2) de fleste Drosophila laboratorier har allerede det nødvendige utstyret, og 3) vevet er fast så Konvensjonell fluorescensmikroskopi kan brukes til å kvantifisere neurodegenerative hendelser etter skade.
Vi ser at denne protokollen kan tilpasses for å undersøke et bredt spekter av cellulære og molekylære mekanismer relatert til nevrogenerering etter skade. Spesielt kan disse metodene brukes til å undersøke behAvior av noe fluorescensmerket protein før og etter nevronskader og degenerasjon og regenerering av motorneuron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke alle medlemmer av Keller og Magie Labs på Quinnipiac University for nyttige forslag. Spesielt vil vi takke Barron L. Lincoln II for utvikling av denne skadeanalysen i Keller Lab. Vi vil også takke Quinnipiac University College of Arts og Science Grant-In-Aid tildelt LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
