Summary
Direkter Einspritzung von Krebs-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) führt zur Neuprogrammierung des Knochenmarks Tumorprogression zu unterstützen; die Zellen dieser Effekt vermitteln, ist jedoch unklar. Hierin beschreiben wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur EV-vermittelten Tumor-mesenchymale Stammzellen (MSC) Interaktionen in VivoUntersuchung offenbart eine entscheidende Rolle für EV-gebildete MSCs in Metastasen.
Abstract
Innerhalb der Tumor Mikroumgebung beitragen ansässig oder rekrutierten mesenchymaler Stammzellen (MSCs) zur malignen Progression bei mehreren Krebsarten. Unter dem Einfluss von bestimmten Umweltsignale können diese adulten Stammzellen Parakrine Mediatoren führt zu beschleunigten Tumorwachstum und Metastasierung freigeben. Definieren das Übersprechen zwischen Tumor und MSCs ist von primärer Bedeutung zu verstehen, die Mechanismen der Tumorprogression und neue Ziele für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.
Krebszellen produzieren große Mengen von extrazellulären Vesikeln (EVs), die das Verhalten der Zielzellen in der Mikroumgebung Tumor oder an entfernten Standorten tiefgreifend beeinflussen können. Tumor-EVs beilegen funktionellen Biomoleküle, einschließlich der entzündlichen RNAs und (Onko) Proteine, die Stromale Zellen um die metastatische Verhalten der Krebszellen zu verbessern oder zur Teilnahme an der Pre-metastatischen Nische Bildung erziehen können. In diesem Artikel beschreiben wir die Entwicklung von einem präklinischen Krebs-Maus-Modell, die spezifische Auswertung an die EV-vermittelten Übersprechen zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen ermöglicht. Zunächst beschreiben wir die Reinigung und Charakterisierung von Tumor sezerniert EVs und die Bewertung der EV-Internalisierung von MSCs. Wir machen dann Verwendung von eine Multiplex-Perle-basierte Immunoassay auszuwertende Änderung des MSC-Zytokin-Expressionsprofil induziert durch Krebs EVs. Schließlich veranschaulichen die Generation eine biolumineszente orthotopen Xenograft-Maus-Modell der Osteosarkom, die die Tumor-MSC-Interaktion rekapituliert, und zeigen den Beitrag der EV-gebildete MSCs zu Wachstum und Metastasierung Tumorbildung.
Unser Modell bietet die Möglichkeit, wie Krebs EVs ein Tumor tragenden Umfeld gestalten zu definieren und zu bewerten, ob die Blockade der EV-vermittelten Kommunikation zwischen Tumor und MSCs Krebs Fortschreiten verhindert.
Introduction
Der Tumor Mikroumgebung beteiligt sich aktiv an den meisten, wenn nicht alle Aspekte der Tumorgenese und Krebs Fortschreiten, einschließlich Metastasenbildung und die Entwicklung von Resistenzen gegen Therapeutika1. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der präklinischen orthotopen Krebs-Maus-Modellen, die Dissektion der Auftritt in der Tumor-Nische komplexen Tumor-Stroma-Interaktionen zu ermöglichen.
Unter den vielen zellulären Komponenten des Tumors Mikroumgebung tragen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) stark zur Krebsentwicklung bei mehreren Krebsarten wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Hirntumoren, Multiple Myelom/Plasmozytom und Osteosarkom2 ,3,4,5,6,7. MSCs sind multipotente Stammzellen, die in verschiedenen Erwachsenen und fetalen Geweben, einschließlich Knochenmark, Fettgewebe, Plazenta, Nabelschnurblut und andere8,9befinden. In Reaktion auf inflammatorische Signale Krebs erzeugt MSCs migrieren in Tumor Standorte, in der Tumor-Mikroumgebung integrieren und letztlich in Unterstützung von Krebs Zellen10unterscheiden. Diese Krebs-assoziierten MSCs vorsehen Tumorprogression auf Tumorzellen und auf dem umgebenden Stroma2, handeln wesentliche Faktoren (z.B. Wachstumsfaktoren, Chemokine, Zytokine und immunsuppressive Mediatoren). 3 , 11 , 12 , 13. während die Tumor-fördernde Wirkung von Krebs-assoziierten MSCs in zahlreichen Krebs-Modelle untersucht wurden, sind die Mechanismen, durch die Tumorzellen MSCs Programmieren um eine Krebs-fördernde Nische Form, schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Generation eines orthotopen Xenograft-Modells, die die Studie der Pro-tumorigenic Interaktion zwischen Knochen Krebszellen und MSCs über extrazelluläre Vesikel (EVs) ausdrücklich erlaubt.
EVs sind wichtige Mediatoren der interzellulären Kommunikation zwischen Tumor und Stromazellen Zellen14. EVs tragen funktionelle Biomoleküle der Zelle Herkunft, einschließlich Proteine, Lipide und regulatorischen RNAs. Einmal in den Extrazellulärraum freigesetzt, diese Bläschen von umgebenden Zellen aufgenommen werden können oder an entfernten Standorten über das Blut oder die Lymphzirkulation durchgeführt und zutiefst Ziel Zelle Verhalten beeinflussen können. 15 , 16 , 17 zum Beispiel Aufnahme von Krebs EVs von Stromazellen Fibroblasten Myofibroblast Unterscheidung Angiogenese Unterstützung und Beschleunigung Tumor Wachstum in Vivo18,19, Internalisierung von Endothelzellen führen Zellen können Tumor-Angiogenese stimulieren und erhöhen die vaskuläre Permeabilität16,20, und Interaktion mit Immunzellen könnte zur Unterdrückung der Immunantwort Antitumor-21.
Wir vor kurzem gezeigt, mit einer Biolumineszenz orthotopen Xenograft-Maus-Modell der Osteosarkom, dass Tumorzellen hohe Mengen des EFD freigeben, die MSCs Pro tumorigenic und Pro-metastasiertem Phänotyp zu veranlassen. Dieser Effekt wird durch eine dramatische Veränderung in der MSC Zytokin Expressionsprofil (bezeichnet als "MSC Education") und kann durch die Gabe von einer therapeutischen Interleukin-6-Rezeptor (IL-6R) Antikörper7verhindert werden. Unsere Arbeit gezeigt, dass Krebs EVs sind entscheidende Modulatoren des MSC-Verhalten, wodurch eine Begründung für Mikroumgebung ausgerichtete Ansätze, Osteosarkom Fortschreiten zu stoppen. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll um die EV-vermittelten Tumor-MSC Interaktion in Vivozu untersuchen. Dieses Modell soll: (1) speziell definieren Krebs EV-induzierte Veränderungen des MSC Verhalten in den Tumor Mikroumgebung, 2) auszuwerten, wie diese Interaktion zu Knochen Tumorwachstum und Metastasenbildung und (3) Studie beiträgt, ob stören EV-vermittelten Übersprechen in Vivo verhindert Krebs Fortschreiten.
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Protocol
Menschlichen Fettgewebe für mesenchymale Stammzellen isoliert wurden erhalten aus der Abteilung für plastische Chirurgie des Tergooi Krankenhauses (Hilversum, Niederlande) nach Genehmigung durch institutionelle Ethikkommission und schriftliche Einwilligung. GFP-positiven adipösen MSCs wurden von der Abteilung für medizinische und chirurgische Wissenschaften für Kinder und Erwachsene (Universität von Modena und Reggio Emilia) erhalten.
Tierversuche wurden gemäß dem niederländischen Gesetz über Tierversuche durchgeführt, und das Protokoll stimmte der Ausschuss für Tierversuche am VU University medical Center, Amsterdam, Niederlande.
1. Isolierung von Tumor sezerniert extrazelluläre Vesikel.
- EV-abgereicherte fetalen Bovine Serum (FBS) durch Zentrifugieren FBS bei 70.000 x g über Nacht (16 Stunden), keine Bremse, bei 4 ° C mit einer Ultra-schwingende Eimer Rotor vorbereiten (1 h für Entschleunigung erwarten). Sorgfältig sammeln des Überstands (EV-abgereicherte FBS) ohne zu stören das Pellet. Filtern Sie die EV-abgereicherte FBS mit 0,22 µm Filter.
- Kulturmedium EV erschöpft durch die Ergänzung Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM) mit 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 2 mM Glutamin vorbereiten (1 x P/S/G) und 5 % EV-abgereicherte FBS.
- 3 x 106 143B Zellen in 175 cm2 Fläschchen Saatgut und Kultur sie in EV-abgereicherte Nährmedium in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Wenn die Zellen sind 80-90 % Zusammenfluss (in der Regel nach 36 h bis 48 h), sammeln des Überstands für EV-Isolierung aus 8 X 175 cm2 Kolben (28 mL/Flasche).
- Pre-Löschen des Zelle Überstands um Zellen und zellenrückstand durch Differentielle Zentrifugation (Zentrifugieren des Überstands der vorigen Runde jedes Mal) nach das folgende Protokoll zu entfernen:
- Zentrifugieren Sie den überstand zweimal bei 500 X g für 10 min.
- Zentrifugieren Sie den überstand zweimal bei 2000 X g für 15 min.
- Zentrifugieren Sie den überstand zweimal bei 10.000 x g für 30 min.
- Führen Sie alle Centrifugations bei 4 ° C mit maximaler Beschleunigung und Abbremsung Geschwindigkeitseinstellungen. Nach jedem Schritt sorgfältig sammeln des EV-haltigen Überstands, etwa 1 mL hinterlässt. Fahren Sie sofort um 1,5 oder Store Schritt bereits geräumten Medium bei-80 ° C bis EV Isolation bedingt.
- EVs durch Zentrifugieren der bereits geräumten konditionierten Mediums einmal 70.000 x g für 1 h zu isolieren, Bremse, bei 4 ° C in Ultra-Zentrifuge Röhrchen (Endvolumen 38,5 mL/Tube) mit einer Ultra-schwingende Eimer Rotor langsam.
- Sorgfältig entfernen den überstand, verlassen ca. 1 mL hinter Aufschwemmen der EV-haltigen Pellets in das restliche Volumen bündeln sie alle in einer Ultrazentrifuge Röhre und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis zum kompletten tubenabfüllung hinzufügen (Endvolumen 38,5 mL).
- Zentrifuge wieder bei 70.000 x g für 1 h bei 4 ° C, ohne Bremse (1 h für Entschleunigung erwarten). Sorgfältig entfernen des Überstands ohne zu stören das Pellet und 100-200 µL hinterlassen.
- Aufschwemmen Sie EV-Pellet und passen Sie das Endvolumen zu 200 µL mit PBS (standardisiert für alle EV-Isolationen). Die EV-Vorbereitung sofort verwenden und lagern bei-80 ° C bis Einsatz22.
Hinweis: EVs können bis zu 6 Monaten bei-80 ° c gelagert werden
(2) EV Charakterisierung.
Gereinigte EVs können durch Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM)23visualisiert werden.
- Mix-EV Preps mit ein gleiches Volumen von 4 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer.
- Mantel 200 mesh Formvar-Kohlenstoff-beschichtete Nickel TEM Raster mit 5 µL der EV-Aussetzung für 20 min bei Raumtemperatur.
- Die EV-Proben auf TEM Gittern mit 1 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), Kontrast mit Uranyl Oxalat (pH 7,0) zu fixieren, und Einbetten in eine Mischung aus 4 % Uranyl Acetat und 2 % Methylcellulose im Verhältnis 1:9 auf dem Eis.
- Entfernen Sie Gitter mit Edelstahl Schleifen zu und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier auf eine entsprechende Dicke der Folie Methyl Zellulose zu gewährleisten.
- Nach dem Trocknen untersuchen Sie Gitter mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop und erfassen Sie Bilder mit einer digitalen Kamera gekoppelt, um die entsprechende Software.
3. Bildung von MSCs durch Tumor-abgeleitete EVs.
- Bereiten Sie MSC Kulturmedium ergänzt Alpha-minimale wesentliche Medium (Alpha-MEM) mit 4 % EV-abgereicherte menschlichen Thrombozyten Lysate (hPL)24, Heparin (10 U/mL) und 1 x P/S/G.
Hinweis: EV-abgereicherte hPL erhält man nach dem Verfahren in Abschnitt 1.1 beschrieben. - Samen 1,4 x 106 Fettgewebe abgeleitete MSCs pro 75 cm2 Kolben und Kultur sie in EV-abgereicherte MSC-Nährmedium in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Wenn Zellen Zusammenfluss von 70 % zu erreichen, fügen 143B Osteosarkom - oder Kontrolle menschliche Fibroblasten (Hf)-EVs, 10 µL EV Vorbereitung/cm2 von Kultur-Kolben. 24 Stunden inkubieren Sie und fügen Sie die gleiche Menge an EVs für weitere 6 Stunden. Hinweis: Menschliche Fibroblasten kultiviert in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) 10 % FBS und EVs sind isoliert, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
- Sammeln des MSC Überstands, Zentrifugieren 1 X 500 X g für 5 min bei 4 ° C (mit maximaler Beschleunigung und Abbremsung Geschwindigkeitseinstellungen), an einen neuen Schlauch übertragen und Speichern des geräumten Überstands bei-80 ° C um zukünftige Zytokin Analyse (Abschnitt 5) zu ermöglichen.
- Für in Vivo Experimenten (siehe Abschnitt 6), GFP-positiven MSCs25 zu erziehen, wie in den Abschnitten 3.1 bis 3.3 beschrieben, sammeln die Zellen und Aufschwemmen sie mit PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 106 Zellen pro 100 µL. halten Sie Zellen auf Eis bis Injektion.
(4) EV Internalisierung Assay.
EV-Aufnahme durch MSCs visualisieren, beschriften EVs mit einem grün-fluoreszierende Linker Farbstoff (GFLD) (im Handel erhältlich) nach der Hersteller-Protokolls:
- Kurz, 180 µL des Verdünnungsmittels hinzu kommt der 200 µL EV Prep. 1 µL GFLD Farbstoff in 50 µL Verdünnungsmittel verdünnen und der verwässerte EV Prep 20 µL verdünnter Farbe hinzufügen.
- Vorsichtig mischen Sie, indem Sie pipettieren und 3 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 5 mL 0,1 % BSA in PBS, transfer zum Ultra-Zentrifuge Röhren und füllen Sie das Rohr mit PBS (Endvolumen 38,5 mL/Tube).
- 1 X bei 70.000 x g für 1 h bei 4 ° C, ohne Bremse Zentrifugieren (1 h für Entschleunigung erwarten). Nehmen Sie den überstand vorsichtig und Aufschwemmen der beschrifteten EV-Pellets in einem Endvolumen von 200 µL (Lautstärke mit PBS).
- Der MSC-Kultur der beschrifteten EVs hinzufügen oder bei-80 ° c Lagern Nach der Inkubation über Nacht bewerten Vesikel Internalisierung von Fluoreszenz-Mikroskopie und flow Cytometry7.
5. Bewertung der MSC Zytokin Expressionsprofil.
- Für die Multiplex-Quantifizierung von Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-10 (IL-10), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und Interleukin - 12p 70 (IL - 12p 70) Protein-Ebene in der MSC konditioniert Medium (siehe Punkt 3.4), verwenden Sie eine handelsübliche durchflusszytometrischen Wulst Array (CBA) für menschliche inflammatorischen Zytokinen, die Anweisungen des Herstellers.
- Kurz, mischen Sie die Antikörper konjugiert Capture-Perlen und fügen sie Sie alle Assay Röhren. Die Rohre der Zytokin-standard-Verdünnungen oder konditionierten mittlere Proben hinzufügen.
- Fügen Sie die Erkennung Reagenz und inkubieren 3 Stunden bei RT
- Waschen Sie die Perlen mit dem mitgelieferten Waschlösung. Messen Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer und analysieren Sie die Daten entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
6. Generation ein Orthotopic Xenograft-Maus-Modell der Osteosarkom.
- Lassen Sie sechs Wochen altes Baby, weiblich, Athymic nackt-Foxn1nu Mäuse für mindestens eine Woche vor Beginn der experimentellen Verfahren zu akklimatisieren.
- Einen Tag vor dem chirurgischen Eingriff sowie perioperative Analgesie Paracetamol hinzufügen das Trinkwasser. Verdünnen Sie "Paracetamol Lösung für Kinder" (siehe Tabelle der Materialien) mit Wasser, um eine Endkonzentration von 2 mg/mL zu erhalten. Basierend auf einer durchschnittlichen Wasseraufnahme von 150 mL/kg/Tag, und einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g, diese Dosis ist ausreichend, um eine Dosis von 6 mg zu erreichen/Maus/Tag (300 mg/kg/Tag).
- Analgetische Behandlung bis zu 24 Stunden nach der Operation, oder länger, wenn die Tiere von Schmerzen Anzeichen weiter.
- Am Tag des chirurgischen Eingriffs kultivierte Luciferase-positiv (Fluc) 143B Zellen (zuvor erzeugte Lentivirale Transduktion) sammeln, indem Sie bei 300 X g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 2 x 105 Zellen/µL mit PBS-Puffer. Die Zellsuspension auf Eis bis zu 6 Stunden mithalten.
- Autoklaven chirurgische Geräte. Bereiten Sie vor und reinigen Sie den Arbeitsbereich und die sterilisierten Schere und Pinzette auf sterile Blätter. 20 min vor dem chirurgischen Eingriff (Schritt 6,8), Spritzen die Tiere subkutan mit Buprenorphin (0,05 mg/kg, in 0,9 % Kochsalzlösung verdünnt) als Analgetikum mit 0,5 mL Insulinspritzen (29-Gauge-Nadel).
- Kurz vor jedem Tier zu betäuben, füllen Sie eine 10 µL Spritze mit mindestens 1 µL Zellsuspension konzentriert (Fluc) 143B (siehe Punkt 6.4).
- Betäuben Sie das Tier mit Isofluran Inhalation Anästhesie (ca. 2-3 % Sauerstoff). Überprüfen der Narkose durch Zehe-Kneifen das Tier. Wenn das Tier nicht reagiert, das kneifen, d. h. , die es zutiefst betäubt ist, gelten Sie die Salbe auf die Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Positionieren Sie das Tier auf den Rücken mit dem Kopf in einem Anästhesie-Maske und mit den Beinen in Richtung des Bedieners. Biegen Sie das linke Knie. Wischen Sie die Haut mit 70 % Ethanol und gelten Sie Lidocain (2 %) mit einem Wattestäbchen 3 mal als lokale Schmerzmittel.
- Verwenden Sie eine sterile chirurgische Messer, um einen kleinen Einschnitt (ca. 5 mm) auf die Haut unterhalb des Knies aussetzen die Tibia zu machen. Bohren Sie ein Loch in der Tibia, ca. 2 mm unterhalb des Knies mit Mikro Spiralbohrer 0,8 mm. Seien Sie vorsichtig, nicht, durch beide Tibia Cortex zu bohren.
- Injizieren Sie 1 µL Zellsuspension (ca. 2 x 105 Zellen) in das Loch mit einem 26-Gauge-Nadel langsam (in ca. 5 Sekunden). Schließen Sie das Loch mit ein Tröpfchen von Gewebekleber Rückfluss der Suspension zu verhindern.
- Schließen Sie die Haut mit Monofilen Nahtmaterial und einen Tropfen Gewebekleber. Lassen Sie die Tiere erholen in einer gut geheizten Umgebung (Verwendung einer Wärmelampe). Nicht unbeaufsichtigt lassen Tiere bis sie ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt haben. Erst nachdem die Tiere aus der Narkose vollständig wiederhergestellt sind, kehren sie an ihren eigenen Käfigen.
- Zwei Tage nach der Inokulation Tumor, zu injizieren, EV erzogen oder naiv GFP-positiven MSCs (106 Zellen in 100 µL PBS, siehe Punkt 3.5) intravenös mit einer 0,5 mL Insulin Spritze in die Vene der Schweif der Mäuse.
- Folgen Sie Tumorwachstum durch Biolumineszenz imaging26 zweimal in der Woche. Zu diesem Zweck die Mäuse i.p mit 150 µL injizieren D-Luciferin (30 mg/mL) mit einer Insulin-Spritze. Zehn Minuten nach der Injektion, positionieren Sie die Tiere in die Biolumineszenz imaging-System und Messen der Photon-Flux von Tumorzellen erzeugt.
- Darüber hinaus Messen Sie den Durchmesser des primären Knochentumor mit einer Zange. Breite x Länge2 x 0,5 wird das Tumorvolumen (in mm3) geschätzt.
- Hinweis: Humane Endpoints werden definiert als Tumor Durchmesser > 15 mm oder Gewichtsverlust > 15 %.
7. Bewertung der Lunge Knötchen Anzahl
- Wenn eines der Tiere die humaneren Endpunkt definiert im Schritt 6.14 (in ca. 3-4 Wochen) erreicht, beenden Sie das Experiment zu und sammeln Sie und analysieren Sie alle relevanten Gewebe.
- Zehn Minuten vor Euthanization, 150 µL injizieren D-Luciferin (30 mg/mL) mit einer 0,5 mL Insulin Spritze.
- Die Tiere mit Isofluran Inhalation Anästhesie zu betäuben (siehe Punkt 6.7). Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose durch das Fehlen von Reaktionen der Maus auf die Zehe kneifen. Die Mäuse durch zervikale Dislokation27einschläfern.
- Lunge, Leber, Milz und Nieren mit sterilisierten Schere und Pinzette zu sammeln. Waschen Sie die Organe in PBS, Blut-Spuren zu entfernen und sie auf eine Petrischale.
- Legen Sie die Petrischale mit den Organen in die Biolumineszenz imaging-System. Messen Sie die Biolumineszenz-Signal auf beiden Seiten der Organe. Sofort nach der Messung, stürzen Sie die Organe in 4 % Formalin fixieren sie (24-72 Stunden, bei RT) für künftige histologische Analysen.
- Die erhaltenen Bilder mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware durch manuelle Schwellwerte zu verarbeiten. Die Anzahl der Lunge Knötchen auf das jeweilige Bild. Zählen Sie die Gesamtzahl der Lunge Knötchen auf beiden Seiten der Lunge.
8. die histologische Analyse
- Zur histologischen Untersuchung der Lungengewebe:
- Betten Sie Formalin fixiert Organe in Paraffin ein und bereiten Sie 6 µm Gewebe Folien.
- Deparaffinate des Lungengewebes gleitet und Antigen-Retrieval durch Kochen sie für 15 min in 0,01 M Citrat-Puffer (pH 6) führen.
- Inkubieren Sie die Folien horizontal bei Raumtemperatur mit Anti-Human Vimentin Antikörper (200 µg/mL) verdünnt 1: 150 in Antikörper-Verdünnungsmittel (im Handel erhältlich) und anschließend mit dem sekundären, HRP-markierten Antikörper (0,5 mg/mL, Verdünnung 1: 500). Färben der Gewebe mit 3'-Diaminobenzidine (DAB) und Hämatoxylin Zähler Färbung.
- Beobachten Sie die gefärbten Gewebe Folien mit einem optischen Mikroskop gekoppelt an die entsprechende Kamera und Image-Software.
- Das Vorhandensein von GFP-positiven MSCs in Maus Tibien bewerten:
- Entkalken Sie die Schienbeine in Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Aktualisieren Sie EDTA Puffer täglich bis Knochen flexibler (ca. 1 Woche).
- Schienbeine zu entwässern und mit Paraffin zu infiltrieren. Betten Sie die Schienbeine (einschließlich Osteosarkom Gewebe) in Paraffin-Blöcke.
- Verwenden Sie ein Mikrotom 6 µm Paraffin Abschnitte vorzubereiten. Legen Sie die Paraffin-Abschnitte auf Objektträger. Nach dem Trocknen Lagern Sie Folien über Nacht bei Raumtemperatur
- Führen Sie Wärme vermittelt Antigen-Retrieval mit Citrat-Puffer (vgl. 8.1.2) und das Gewebe mit Anti-GFP Antikörper (ganze Antiserum) in einer 1:900 Verdünnung in Antikörper-Verdünnungsmittel färben. Counterstain Gewebe mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Beobachten Sie die Gewebe-Folien mit einem Fluoreszenzmikroskop gekoppelt, um die entsprechende Software zur Abbilderstellung.
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Representative Results
In dieser Studie erkundeten wir die Fähigkeit des Osteosarkom abgesondert EVs, MSCs in Richtung Pro tumorigenic und Pro-metastasiertem Phänotyp zu erziehen. Wir zeigen, dass Osteosarkom Zellen exosom-wie EVs freigeben, die von MSCs internalisiert werden. Wir die Änderung des MSC Zytokin Expressionsprofil induziert durch Krebs EVs gemessen und bewertet die Wirkung der EV-gebildete MSCs auf Tumorwachstum und Metastasenbildung. Die allgemeine Darstellung des Studiendesigns ist in Abbildung 1dargestellt.
EFD freigegeben durch 143B Osteosarkom Zellen oder Kontrolle menschlichen Fibroblasten durch Differentielle Zentrifugation gereinigt wurden. EV Reinheit bestätigte Elektronenmikroskopie, die ergab, dass die Vorbereitungen vor allem Vesikel mit einem Durchmesser zwischen 40-100 nm (Abbildung 2A) enthalten. Um festzustellen, ob Krebs EVs mit MSCs interagieren, wir beschriftet die Vesikel mit einem lipophilen Linker grün fluoreszierenden Farbstoff (GFLD) und sie mit den Zielzellen über Nacht inkubiert. Durch Fluoreszenz-Mikroskopie beobachteten wir effiziente EV Aufnahme durch MSCs (Abbildung 2B). Ferner ergab Flow Cytometry-Analyse, dass Osteosarkom und Kontrolle EVs mit vergleichbarer Effizienz (Abbildung 2C) internalisiert werden. Um zu untersuchen, ob Osteosarkom EVs die immunmodulatorische Eigenschaften des MSCs verändern, verwendeten wir eine Multiplex-Perle-basierte Zytokin-Immunoassay, die zeigten, dass Tumor EVs eine 2-fache Erhöhung in der IL-8 und IL-6 im Vergleich zu menschlichen Fibroblasten bestimmen EVs (Abbildung 2D, E) zu kontrollieren.
Um zu untersuchen, ob Osteosarkom EVs erziehen MSCs Pro tumorigenic und Pro-metastasiertem Phänotyp zu verabschieden, haben wir eine Biolumineszenz, orthotopen Xenograft-Maus-Modell der Osteosarkom beschäftigt. Alle Tierversuche wurden durch eine Bedienperson durchgeführt. Metastasiertem 143B-Fluc Zellen wurden in der Tibia von nackten Athymic Mäusen verpflanzt, und nach zwei Tagen waren eine einzige Verwaltung der GFP-positiven EV-gebildete MSCs. Mäuse naiv (erzogen) MSCs oder kein MSCs erhalten Osteosarkom-xenografted Mäuse ausgesetzt dienten als Kontrollgruppe. Keine Tiere starben vor der beschriebenen Endpunkte. Wir von Bremssattel Messung demonstriert und Biolumineszenz Bildgebung (BLI), die behandelten Mäuse mit EV-gebildete MSCs beschleunigt Wachstum des Tumors im Vergleich zu Kontrollgruppen(Abbildung 3). Repräsentative Bilder der Tumorgröße von jeder Behandlung Arm sind in Abbildung 3Cdargestellt. Unsere Daten zeigen, dass eine einzelne intravenöse Verabreichung von gebildeten MSCs Tumorprogression bereits 10 Tage nach der Inokulation (Abbildung 3B) beeinflusst. Darüber hinaus konnte vier Tage nach systemischer Injektion von erzogen/naiv GFP exprimierenden MSCs (Abb. 4A), visualisieren wir GFP exprimierenden Zellen im Knochenmark (Abbildung 4B) und im Tumorgewebe (Abbildung 4 ( C), MSC homing auf die Tumor-Website zeigen.
Ex-vivo BLI Analyse der Lunge, Leber, Niere und Milz (Daten nicht gezeigt) zeigte Lunge knöllchenbildung ausschließlich in der Lunge bei Mäusen von allen Therapiearmen (Abbildung 4-D-F). Auffallend, erzogen Mäuse erhalten EV-gebildete MSCs höherer Anzahl von Lungenmetastasen verglichen mit Mäusen erhalten nicht-MSCs oder kein MSCs (Abb. 4G) ausgebildet hatte, darauf hindeutet, dass innerhalb der Tumor Mikroumgebung MSCs Erhöhung der metastatischen Potenzial der Osteosarkom Zellen in Vivo7.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung des Studiendesigns. Menschliche primäre MSCs sind mit EVs aus kultivierten metastasierendem Osteosarkom (143B) Zellen isoliert erzogen. Krebs-EV Reinheit wird bewertet durch Elektronenmikroskopie und Internalisierung von MSCs ist durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und durch Durchflusszytometrie analysiert. Änderungen in der MSC-Zytokin-Expressionsprofil werden von durchflusszytometrischen Wulst Array (CBA) bewertet. Definieren die Rolle von EV erzogen sind MSC auf Tumorwachstum und Metastasenbildung, Osteosarkom-tragenden Mäusen injiziert mit EV-erzogen (oder naiv) MSC. Tumorwachstum ist gefolgt von Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und Bremssattel Messung während Metastasenbildung bei der experimentellen Endpunkt durch ex-Vivo BLI und histologische Analyse ausgewertet wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Reinigung des EFD und deren Wechselwirkung mit MSCs. (A) Transmission Electron Microscopy Schliffbild des EFD vom 143B Zellen isoliert (Maßstab: 100 nm). (B) Aufnahme des GFLD beschriftet 143B EVs von MSCs durch Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet (Skala: 10 µm). (C) mit der Bezeichnung der Internalisierung von GFLD 143B EFD (orange) oder Kontrolle (menschlichen Fibroblasten, Hf) EVs (grün) von MSCs wie durch Durchflusszytometrie analysiert. (D) Multiplex-Erkennung von inflammatorischen Zytokinen in der Überstände von MSCs 143B ausgesetzt (143B EV-MSC) oder Hf-EVs (Hf EV-MSC) von durchflusszytometrischen Wulst Array. 143B-MSC express höhere IL-6 und IL-8 im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelt und hF EV behandelt) MSCs. Die gestrichelten Linien zeigen die Verlagerung der Produktion von Zytokinen. (E) IL-8 und IL-6 Proteinkonzentration in den konditionierten Medien der EV-behandelten MSCs als analysierten von durchflusszytometrischen Wulst Array, ausgedrückt als Induktion im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolle zu falten. Daten werden ausgedrückt als ± SD bedeuten n = 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Biolumineszenz, orthotopen Xenograft Mausmodell der Osteosarkom. (A) Abschätzung der Tumorvolumen mit Bremssattel Messungen und (B) Tumorwachstum durch Biolumineszenz imaging (BLI) gemessen. Größe des Tumors wird als Photon Flux (Photonen/s) ausgedrückt. p < 0,01, nicht-gebildeten MSC (n = 6) Vs erzogen MSC (n = 6), ungepaarten t-Test. Daten werden ausgedrückt als ± SEM (C) Vertreter BLI Bilder von Mäusen mit etablierten Osteosarkom Tumoren (Oberseite) bedeuten. Farbskala Bar reicht von 7,7 x 107 (violett) bis 2,6 x8 (rot) Photonen/10sec. Im unteren Bereich wird der Tumor-Umgebung ohne BLI Overlay visualisiert. Pfeile zeigen die tumormasse. Skalieren Sie Bars: 0,6 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Bildgebung des MSCs und ex Vivo Lungengewebe. (A) Fluoreszenz-Mikroskopie Bild der kultivierten GFP-positiven Fettgewebe abgeleitete MSCs (grün). (B) Immunfluoreszenz-Färbung des GFP-positiven MSCs im Knochenmark und (C) im Tumorgewebe von MSC-Empfang Mäusen (grün: MSCs, blau: DAPI gefärbt Kerne; Skala bar 10 µm). (D-F) Ex-Vivo Biolumineszenz imaging (BLI) zeigen höheren Anzahl von metastatischen Herde bei Mäusen erhalten EV-gebildete MSCs (F) im Vergleich zu Mäusen naiv MSC (E) oder ohne MSC (D)empfangen. Farbleiste Skala reicht von 1 x 106 (lila) bis 1,5 x 106 (rot) Photonen/s. (G) Quantifizierung der Lunge Metastasen Zahl wie von BLI visualisiert (Linien stellen den Median; * p < 0,05, einseitigen t-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Tumor sezerniert extrazelluläre Vesikel (EVs) verändern die Physiologie von lokalen und entfernten Mesenchymale Zellen ein Tumor-unterstützendes Umfeld zu generieren. Hier beschreiben wir die Generation von einem präklinischen Mausmodell der Osteosarkom, die Dissektion der EV-vermittelten Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen erlaubt und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Vivo. Wir zeigen, dass systemische Injektion von menschlichen Tumor EV-gebildete MSCs bei Mäusen mit Osteosarkom Xenotransplantate stark Wachstum und Metastasierung Krebsentstehung fördert durch die Aktivierung der IL-6/STAT3 Signalisierung Weg7.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass Krebs EVs bei der Bildung der Pre-metastatischen Nische helfen können, durch die Veränderung des Verhaltens von lokalen oder dem Knochenmark stammenden Stromazellen Zellen16,28,29. Diese Studien haben meist durch direkte Injektion Krebs stammenden Vesikeln in der Empfänger Maus, die was die Identifizierung der Zelltypen verantwortlich für die Tumor-fördernde Wirkung erschwert. In unserem Protokoll tritt die Bildung von MSCs krebskranke EVs in Vitro vor der MSC-Injektion. Dieser Ansatz ermöglicht die Adressierung von den spezifischen Beitrag der Tumor-MSC Übersprechen, Tumorprogression und verwirrende indirekte Auswirkungen von Krebs EVs auf andere Komponenten der lokalen oder systemischen Umgebung minimiert.
Um festzustellen, ob die gebildeten MSCs auf die Tumor-Website nach Hause, injiziert wir systemisch GFP-positiven MSCs im Heck Stile von Tumor-tragenden Mäusen. Tail Vene Injektionen sind ein entscheidender, aber technisch anspruchsvolle Schritt in viele experimentelle Protokolle. Um nur minimale Unterschiede zwischen den Injektionen zu gewährleisten sollte das Verfahren durch erfahrene Untersucher durchgeführt werden. Richtige intravenöse Verabreichung kann visuell bestätigt werden, durch die Beobachtung der Bewegung der Flüssigkeit über die Vene. Wenn eine weiße Fläche am Heck erscheint oder während der Injektion auf Widerstand gestoßen ist, wurde Gefäßzugang nicht erreicht. In diesem Fall sollte das Verfahren wiederholt werden, durch die Nadel oberhalb der ersten Injektionsstelle. Da MSCs bereitwillig auf den Tumor in Hause, kann erfolgreiche Verwaltung (GFP-positiven) MSCs durch Immunfluoreszenz-Färbung des Tumorgewebes und Knochenmark vier Tage nach der Injektion (Abbildung 4B, C) bestätigt werden.
Wir zeigen, dass Krebs abgesondert EVs einen Tumor-unterstützende Phänotyp in MSCs durch Veränderung der Produktion von inflammatorischen Zytokinen induzieren. Diese Feststellung gilt insbesondere seit Immunmodulation und Tumor immun Steuerhinterziehung sind wichtige Mechanismen in der malignen Progression. Unsere Daten deuten darauf hin, dass Krebs EVs könnte direkt, ausgewiesen durch unabhängige Studien21,30,31,32,33, oder indirekt (über MSCs) angeborenen oder adaptive Immunsystem beeinflussen Komponenten. Allerdings schränkt die Verwendung von einem Xenograft (immungeschwächte) Modell die Möglichkeit, diesen Aspekt der EVs zu untersuchen. Ähnliche Ansätze in immunkompetenten oder humanisierte Mausmodelle müssen so durchgeführt werden, um die Rolle der EV-vermittelten Tumor-MSC-immun-Zell-Interaktionen in der Krebstherapie.
Schließlich, weil MSCs aus dem Knochenmark oder anderen Quellen Gewebe Tumoren eingestellt werden können, unsere Methode beschränkt sich nicht auf die Untersuchung von Knochenkrebs, sondern kann angewendet werden, um die Rolle des Tumors EV-gebildete MSCs in mehreren Krebs Typ2, zu untersuchen 3 , 4 , 5 , 6, wie jüngste Studien in Melanom und Lymphom Modelle bestätigen34.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
S.R. Baglio wurde durch ein Stipendium von Associazione Italiana per la Ricerca Sul Ariete (AIRC) kofinanziert von der Europäischen Union unterstützt. Darüber hinaus hat dieses Projekt erhielt Fördermittel aus der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter der Marie Sklodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung keine 660200 (, S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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