Summary
Direktinsprutning av cancer-derived extracellulära blåsor (EVs) leder till omprogrammering av benmärg stödja tumör progression; Det är dock oklart vilka celler medla denna effekt. Häri, beskriver vi ett stegvisa protokoll för att undersöka EV-medierad tumör-mesenkymala stamceller (MSC) interaktioner i vivo, avslöjar en avgörande roll för EV-utbildade MSCs i metastaser.
Abstract
Inom den tumör mikromiljö bidra bosatta eller rekryterade mesenkymala stamceller (MSC) till malign progression i flera typer av cancer. Under påverkan av specifika Miljösignaler, kan dessa vuxna stamceller frigöra parakrin medlare leder till accelererad tumörtillväxt och metastasering. Definiera överhörning mellan tumör och MSCs är av primär betydelse att förstå mekanismerna bakom cancer progression och identifiera nya mål för terapeutisk intervention.
Cancerceller producerar höga mängder av extracellulära blåsor (EVs), som djupt kan påverka beteendet hos målceller i den tumör närmiljön eller på avlägsna platser. Tumör EVs bifoga funktionella biomolekyler, inklusive inflammatoriska RNAs och (onco) proteiner, som kan utbilda stromaceller att förbättra beteendet metastaserande cancer celler eller delta i förväg metastaserande nisch bildandet. I den här artikeln beskriver vi utvecklingen av en musmodell för prekliniska cancer som möjliggör specifik utvärdering av EV-medierad överhörning mellan tumör och mesenkymala stamceller. Först beskriver vi rening och karakterisering av tumör-utsöndras EVs och bedömning av EV internalisering av MSCs. Vi sedan göra användningen av en multiplex pärla-baserad immunoassay att utvärdera förändringen av MSC cytokin uttryck profilen framkallas genom cancer EVs. Slutligen vi illustrera generationen av en självlysande ortotop xenograft musmodell av osteosarkom som recapitulates tumör-MSC samspelet, och visar bidraget av EV-utbildade MSCs att tillväxt och metastas tumörbildning.
Vår modell ger möjlighet att definiera hur cancer EVs formar en tumör-stödjande miljö, och att utvärdera om blockad av EV-medierad kommunikation mellan tumör och MSCs förhindrar cancer progression.
Introduction
Den tumör närmiljön deltar aktivt i de flesta, om inte alla aspekter av uppkomst och cancer progression, inklusive metastaser bildandet och utvecklingen av resistens mot therapeutics1. Detta betonar prekliniska ortotop cancer musmodeller som tillåter dissektion av komplexa tumör-stroma interaktioner som inträffar i tumör nisch.
Bland de många cellulära komponenterna i den tumör mikromiljö bidra mesenkymala stamceller (MSC) starkt till cancer progression i flera cancerformer som bröstcancer, prostatacancer, hjärntumörer, multipelt myelom och osteosarkom2 ,3,4,5,6,7. MSCs är multipotenta stamceller som finns i olika vuxna och fostrets vävnader, inklusive benmärg, fettvävnad, moderkakan, navelsträngsblod och andra8,9. Svar på cancer-genererade inflammatoriska signaler, MSCs migrera mot tumören platser, införliva den tumör närmiljön och i slutändan differentieras till cancer-stödjande celler10. Dessa cancer-associerade MSCs tillhandahålla väsentliga faktorer (dvs, tillväxtfaktorer, chemokiner, cytokiner och immunsuppressiva medlare) för tumör progression agerar både i tumörceller och på omgivande stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. medan tumör-främja effekterna av cancer-associerade MSCs har undersökts i flera cancer modeller, de mekanismer genom vilka tumörceller programmera MSCs att forma en cancer-främjande nisch är dåligt känd. Här beskriver vi generationen av en ortotop xenograft modell som uttryckligen tillåter studier av pro-tumörframkallande samspelet mellan ben cancerceller och MSCs via extracellulära blåsor (EVs).
EVs är avgörande medlare av kommunikationen mellan tumör och stromaceller14. EVs bär funktionella biomolekyler cellens ursprung, inklusive proteiner, lipider och reglerande RNAs. När släpptes extracellulära, dessa blåsor kan tas upp av omgivande celler eller bärs till avlägsna platser via blodet eller lymfatiska cirkulationen och djupt kan påverka målet cellen beteende. 15 , 16 , 17 exempelvis upptag av cancer EVs av stromal fibroblaster kan resultera i myofibroblast differentiering stödja angiogenes och accelererande tumör tillväxt i vivo18,19, internalisering av endotelceller celler kan stimulera tumör angiogenes och öka vaskulär permeabilitet16,20, och interaktion med immunceller kan leda till förtryck av den antitumöreffekt immunsvar21.
Vi har nyligen visat, med hjälp av en självlysande ortotop xenograft musmodell av osteosarkom, att tumörceller frigör stora mängder EVs som uppmanar MSCs att förvärva en pro-tumörframkallande och pro-metastaserad fenotyp. Denna effekt beror på en dramatisk förändring i MSC cytokin uttryck profilen (kallad ”MSC utbildning”), och kan förebyggas genom administrering av en terapeutisk interleukin-6-receptorn (IL-6R) antikropp7. Vårt arbete visat att cancer EVs avgörande modulatorer av MSC beteende, vilket ger en logik för närmiljön-riktade strategier för att stoppa osteosarkom progression. Häri, beskriver vi ett stegvisa protokoll för att undersöka den EV-medierad tumör-MSC interaktion i vivo. Denna modell syftar till att: 1) specifikt definiera cancer EV-inducerad förändringarna av MSC beteende i den tumör mikromiljö, 2) utvärdera hur detta samspel bidrar till ben tumörtillväxt och metastas-bildning, och 3) studie om stör av EV-medierad överhörning i vivo förhindrar cancer progression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänsklig fettvävnad för mesenkymala stamceller isolering var erhålls från Institutionen för plastikkirurgi av sjukhuset Tergooi (Hilversum, Nederländerna) efter godkännande av den institutionella etiska kommitté och skriftligt informerat samtycke. GFP-positiv fett MSCs erhölls från Institutionen för medicinsk och kirurgisk vetenskap för barn och vuxna (universitetar av Modena och Reggio Emilia).
Djurförsök har utförts i enlighet med den nederländska lagen om djurförsök, och protokollet godkändes av kommittén för djurförsök för VU University medical center, Amsterdam, Nederländerna.
1. isolering av tumör-utsöndras extracellulära blåsor.
- Förbered EV-utarmat fetalt bovint Serum (FBS) genom centrifugering FBS vid 70 000 x g under natten (16 timmar), ingen broms, vid 4 ° C med hjälp av en ultra svängande hink rotor (räkna med 1 h för retardation). Omsorgsfullt samla supernatanten (EV-utarmat FBS) utan att störa pelleten. Filtrera EV-utarmat FBS med 0,22 µm filter.
- Förbered EV-utarmat odlingsmedium genom att komplettera Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM) med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM glutamin (1 x P/S/G) och 5% EV-utarmat FBS.
- Seed 3 x 106 143B celler i 175 cm2 kolvar och kultur dem i EV-utarmat odlingsmedium i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2. När cellerna är 80-90% konfluenta (vanligtvis efter 36 h-48 h), samla in supernatanten från 8 x 175 cm2 kolvar (28 mL/kolv) för EV-isolering.
- Pre avmarkera cellen supernatanten för att avlägsna celler och cellfragment differentiell centrifugering (centrifugering supernatanten av snurrningen varje gång) enligt följande protokoll:
- Centrifugera supernatanten två gånger vid 500 x g i 10 min.
- Centrifugera supernatanten två gånger vid 2000 x g i 15 min.
- Centrifugera supernatanten två gånger vid 10 000 x g i 30 min.
- Utför alla centrifugations vid 4 ° C med högsta acceleration och retardation hastighetsinställningar. Efter varje steg noggrant samla EV-innehållande supernatanten, lämna ca 1 mL bakom. Fortsätt omedelbart för att steg 1,5 eller store den pre clearade luftkonditionerade medium vid-80 ° C tills EV isolering.
- Isolera EVs genom centrifugering före rensas luftkonditionerade medlet en gång på 70 000 x g för 1 h, långsam broms, vid 4 ° C i ultra-centrifugrör (slutlig volym 38,5 mL/tub) med hjälp av en ultra svängande hink rotor.
- Noggrant avlägsna supernatanten, lämna ca 1 mL bakom, Omsuspendera EV-innehållande pellets i den resterande volymen, samla dem alla i en ultracentrifugen tub och Lägg fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills komplett tube fyllning (slutlig volym 38,5 mL).
- Centrifugera återigen vid 70 000 x g för 1 h vid 4 ° C, utan broms (räkna med 1 h för retardation). Försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten och lämna 100-200 µL bakom.
- Återsuspendera EV-pelleten och justera den slutliga volymen till 200 µL med PBS (standardiserat för alla EV-isoleringar). Använd EV beredning omedelbart eller förvaras vid-80 ° C fram till användning22.
Obs: EVs kan förvaras upp till 6 månader vid-80 ° C.
2. EV karakterisering.
Renat EVs kan visualiseras genom överföring elektronmikroskopi (TEM)23.
- Blanda EV preps med en lika stor volym 4% PARAFORMALDEHYD i fosfatbuffert.
- Coat 200 mesh Formvar-kol-coated nickel TEM nät med 5 µL EV suspension för 20 min i rumstemperatur.
- Fixera EV proverna på TEM rutnät med 1% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,0), kontrast med uranyl oxalat (pH 7,0) och bädda in i en blandning av 4% uranyl acetat och 2% metyl cellulosa i förhållandet 1:9 på is.
- Ta bort nät med rostfria slingor och blot överflödig vätska med filterpapper att säkerställa en lämplig tjocklek av metyl cellulosa filmen.
- Efter torkning, undersöka nät med ett transmissionselektronmikroskop och ta bilder med en digitalkamera kopplad till motsvarande bildbehandlingsprogram.
3. utbildning av MSCs av tumör-derived EVs.
- Förbereda MSC odlingsmedium genom att komplettera alpha-minst viktigt medium (alpha-MEM) med 4% EV-utarmat mänskliga blodplättar Lysate (hPL)24, heparin (10 U/mL) och 1 x P/S/G.
Obs: EV-utarmat hPL erhålls enligt anvisningarna i avsnitt 1.1. - Utsäde 1,4 x 106 adipose-derived MSCs per 75 cm2 kolv och kultur dem i EV-utarmat MSC-odlingsmedium i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- När celler nå 70% sammanflödet, lägga till 143B osteosarkom - eller styra mänskliga fibroblaster (hf)-EVs, 10 µL EV förberedelser/cm2 av kultur kolv. Inkubera under 24 timmar och tillsätt samma mängd EVs i ytterligare 6 timmar. Obs: Mänskliga fibroblaster odlas i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) 10% FBS och EVs isoleras som beskrivs i avsnitt 1.
- Samla MSC supernatanten, Centrifugera 1 x 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C (med högsta acceleration och retardation hastighetsinställningar), överföra till en ny tub och lagra clearade supernatanten vid-80 ° C för att möjliggöra framtida cytokin analys (avsnitt 5).
- För in vivo experiment (avsnitt 6), utbilda GFP-positiv MSCs25 som beskrivs i avsnitt 3.1-3,3, samla cellerna och återsuspendera dem i PBS med en slutlig koncentration på 106 celler per 100 µL. Behåll celler på is tills injektionen.
4. EV internalisering Assay.
För att visualisera EV upptag av MSCs, etikett EVs med ett grönt fluorescerande linker färgämne (GFLD) (kommersiellt tillgängligt) efter tillverkarens protokollet:
- Kort, tillsätt 180 µL spädningsvätska till 200 µL EV prep. Späd 1 µL GFLD färgämne i 50 µL spädningsvätska, och tillsätt 20 µL utspädda färgämne i utspädda EV prep.
- Försiktigt blanda genom pipettering och inkubera i 3 min i rumstemperatur i mörkret.
- Tillsätt 5 mL 0,1% BSA i PBS, transfer till ultra-centrifugrör och fyll röret med PBS (slutlig volym 38,5 mL/tub).
- Centrifugera 1 x vid 70 000 x g för 1 h vid 4 ° C, utan broms (räkna med 1 h för retardation). Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera märkt EV-pelleten i en slutlig volym av 200 µL (justera volymen med PBS).
- Lägg till märkt EVs till MSC kultur eller lagra dem vid-80 ° C. Efter natten inkubation, bedöma vesikler internalisering genom fluorescensmikroskopi och flöde flödescytometri7.
5. bedömning av MSC cytokin uttryck profil.
- För multiplex kvantifiering av interleukin-8 (IL-8), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumörnekrosfaktor (TNF) och interleukin - 12p 70 (IL - 12p 70) proteinnivåer i MSC luftkonditionerade medium (se steg 3,4), Använd en kommersiellt tillgängliga flödescytometrisk bead array (CBA) för mänskliga inflammatoriska cytokiner efter tillverkarens anvisningar.
- Kortfattat, blanda antikropp-konjugerad fånga pärlor och lägga till dem i alla assay rör. Lägga till cytokin standard spädningarna eller konditionerat medium proverna i rören.
- Tillsätt upptäckt reagens och inkubera 3 timmar vid RT.
- Tvätta pärlorna med medföljande tvättlösningen. Mäta de prover som använder en flödescytometer och analysera data enligt tillverkarens anvisningar.
6. generering av en ortotop Xenograft musmodell av osteosarkom.
- Kan sex veckor gamla, Kvinna, Athymic naken-Foxn1nu möss acklimatisera sig för minst en vecka innan de experimentella rutiner.
- En dag före det kirurgiska ingreppet och som perioperativ analgesi lägga till paracetamol i dricksvattnet. Späd ”paracetamol lösningen för barn” (se Tabell för material) med vatten för att få en slutkoncentration av 2 mg/mL. Baserat på ett genomsnittligt intag på 150 mL/kg/dag, och en genomsnittlig kroppsvikt av 20 g, denna dos är tillräcklig för att nå en dos på 6 mg/mus/dag (300 mg/kg/dag).
- Fortsätta smärtstillande behandling förrän 24 timmar efter operationen, eller längre om djur som visar tecken på smärta.
- På dagen för det kirurgiska ingreppet, samla odlade luciferas-positiv (Fluc) 143B celler (tidigare genereras av lentiviral transduktion) genom centrifugering vid 300 x g i 10 min och resuspendera cellerna vid en koncentration på 2 x 105 celler/µL i PBS. Hålla cellsuspension på is till 6 timmar.
- Autoklav kirurgisk utrustning. Förbered och rengör arbetsområdet och placera de steriliserade sax och pincett på sterila lakan. Tjugo minuter före det kirurgiska ingreppet (steg 6,8), injicera subkutant djuren buprenorfin (0,05 mg/kg, utspädd i 0,9% koksaltlösning) som smärtstillande medel med 0,5 mL insulinsprutor (29-gauge nål).
- Strax före anesthetizing varje djur, fylla en 10 µL spruta med minst 1 µL av koncentrerad (Fluc) 143B cellsuspensionen (se steg 6,4).
- Söva djuret med isofluran inandning anestesi (2-3% syre). Kontrollera nivån av anestesi av tå-klämmande djuret. När djuret inte reagerar på den nyper, dvs det är djupt sövda, applicera salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Placera djuret på rygg med huvudet i en anestesi mask och med benen mot operatören. Böj vänster knä. Torka av huden med 70% etanol och tillämpas lidokain (2%) med bomull spets 3 gånger som lokal smärtstillande.
- Använd en steril kirurgisk kniv för att göra ett litet snitt (ca 5 mm) på huden precis under knäet att exponera skenbenet. Borra ett hål i tibia, cirka 2 mm under knäet med en 0,8 mm micro twist drill. Var försiktig att inte borra igenom båda tibia cortices.
- Injicera 1 µL cellsuspension (cirka 2 x 105 celler) långsamt (i ungefär 5 sekunder) i hålet med en 26-gauge nål. Nära hålet med en droppe av vävnad lim för att förhindra återflödet av suspensionen.
- Nära huden med monofilament suturer och en droppe av vävnad lim. Låt den animaliska återvinna i en väl uppvärmda miljön (Använd en värmelampa). Lämna inte djur utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Först efter att djuren är helt återhämtat sig från anestesi, återlämna dem till sina egna burar.
- Två dagar efter tumör Inympning, injicera EV utbildade eller naiva GFP-positiv MSCs (106 celler i 100 µL PBS, se steg 3.5) intravenöst med en 0,5 mL insulinspruta i svansen venen i möss.
- Följ tumörtillväxt genom Mareld imaging26 två gånger i veckan. I detta syfte injicera möss i.p. med 150 µL D-luciferin (30 mg/mL) med en insulinspruta. Tio minuter efter injektion, placera djuren i Mareld imaging system och mäta photon-flux genereras av tumörceller.
- Dessutom, Mät diametern på den primära ben-tumören med ett skjutmått. Tumör volymen (i mm3) uppskattas av bredd x längd2 x 0,5.
- Obs: Humana slutpunkter definieras som tumör diameter > 15 mm eller viktnedgång > 15%.
7. bedömning av Lung knöl nummer
- När en av djuren når den humana slutpunkten som definieras i steg 6.14 (i cirka 3-4 veckor), avsluta experimentet och samla in och analysera alla relevanta vävnader.
- Tio min innan dödshjälp, injicera 150 µL D-luciferin (30 mg/mL) med 0,5 mL insulinspruta.
- Söva djuren med isofluran inandning anestesi (se steg 6,7). Bekräfta djup anestesi genom avsaknad av reaktioner av musen till tå-klämmande. Euthanize möss av cervikal dislokation27.
- Samla lungor, lever, mjälte och njurar med steriliserad sax och pincett. Tvätta organen i PBS att avlägsna blod spår och sätta dem på en petriskål.
- Placera petriskål med organ i Mareld imaging system. Mäta Mareld signalen på båda sidor av organen. Omedelbart efter mätning, störta organ i 4% formalin att fixera dem (24-72 timmar, på RT) för framtida histologisk analys.
- Bearbeta erhållna bilderna med lämplig programvara för bildåtergivning genom manuell tröskelvärde. Räkna antalet lung noduli på varje bild. Räknas det totala antalet lung noduli på båda sidor av lungorna.
8. histologisk analys
- För histologisk analys av lung vävnader:
- Bädda in formalin-fasta organ i paraffin och förbereda 6 µm vävnad diabilder.
- Deparaffinate lungvävnad diabilder och utföra antigen hämtning genom att koka dem i 15 min i 0,01 M citratbuffert (pH 6).
- Inkubera bilderna horisontellt vid rumstemperatur med anti-humant vimentin antikropp (200 µg/mL) spädd 1:150 i antikropp-spädningsvätska (kommersiellt tillgängligt) och därefter med den sekundära, HRP-märkt antikroppen (0,5 mg/mL, spädning 1: 500). Färga vävnader med 3'-Diaminobenzidin (DAB) och hematoxylin counter färgning.
- Observera de färgade vävnad diabilder med ett optiskt mikroskop kopplat till motsvarande kameran och bildbehandlingsprogram.
- Att bedöma förekomsten av GFP-positiv MSCs i mus förbenade:
- Om avkalkning förbenade i etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Uppdatera EDTA buffert varannan dag tills ben bli flexibel (ca 1 vecka).
- Torka förbenade och infiltrera dem med paraffin. Bädda in de förbenade (inklusive osteosarkom vävnad) i paraffinblock.
- Använda en mikrotom för att förbereda 6 µm paraffin avsnitt. Placera i paraffin avsnitt på objektglas. Efter torkning, lagra bilder över natten i rumstemperatur.
- Utför värme-medierad antigen hämtning med citratbuffert (se 8.1.2) och färga vävnader med anti-GFP antikropp (hela antiserum) i en 1:900 utspädning i antikropp-spädningsvätska. Counterstain vävnader med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI).
- Observera vävnad bilderna med fluorescens Mikroskop kopplat till motsvarande avbildningsprogrammet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie utforskade vi osteosarkom-utsöndras EVs förmåga att utbilda MSCs mot en pro-tumörframkallande och pro-metastaserad fenotyp. Vi visar att osteosarkom celler släppa exosome-liknande EVs som är internaliserad av MSCs. Vi mätte förändringen av MSC cytokin uttryck profilen framkallas genom cancer EVs och utvärderade effekten av de EV-utbildade MSCs på tumörtillväxt och metastaser bildning. Den allmänna framställningen av studiedesign illustreras i figur 1.
EVs frisätts av 143B osteosarkom celler eller kontroll mänskliga fibroblaster var renas genom differential centrifugering. EV renhet bekräftades av elektronmikroskopi, som visade att förberedelserna främst innehöll blåsor med en diameter mellan 40-100 nm (figur 2A). För att bedöma om cancer EVs interagera med MSCs, vi märkt blåsor med ett grönt fluorescerande lipofila linker färgämne (GFLD) och inkuberas dem över natten med målceller. Genom fluorescensmikroskopi observerade vi effektiv EV upptag av MSCs (figur 2B). Flödescytometri Flödesanalys visade dessutom att osteosarkom och kontroll EVs är internaliserad med jämförbar effektivitet (figur 2C). För att undersöka huruvida osteosarkom EVs alter MSCs immunmodulerande egenskaper, använde vi en multiplex pärla-baserade cytokin immunoassay, som visade att tumören EVs avgöra en 2-faldig ökning av IL-8 och IL-6 produktionen jämfört med mänsklig fibroblast styra EVs (figur 2D, E).
För att undersöka huruvida osteosarkom EVs utbilda MSCs att anta en pro-tumörframkallande och pro-metastaserad fenotyp, anställt vi en självlysande, ortotop xenograft musmodell av osteosarkom. Alla djurförsök utfördes av en operatör. Metastaserande 143B-Fluc celler transplanterade i skenbenet atymiska naken möss, och, efter två dagar, osteosarkom-xenografted möss utsattes för en enstaka administrering av GFP-positiva EV-utbildade MSCs. möss som fick naiv (icke-utbildade) MSCs eller ingen MSCs användes som kontrollgrupper. Inga djur dog innan beskrivs slutpunkterna. Vi visade genom bromsok mätning och Mareld imaging (BLI) att möss behandlas med EV-utbildade MSCs hade påskyndat tumörtillväxt jämfört med kontrollgrupper (figur 3A). Representativa bilder av tumörstorlek varje behandling arm visas i figur 3C. Våra data indikerar att en enda i.v. administrering av utbildade MSCs påverkar tumör progression så tidigt som dag 10 efter inympningen (figur 3B). Dessutom kan fyra dagar efter systemisk injektion av utbildade/naiv GFP-uttryckande MSCs (figur 4A), vi visualisera GFP-uttryckande celler i benmärgen (figur 4B) och i tumörvävnad (figur 4 ( C), visar MSC homing till webbplatsen tumören.
Ex vivo BLI analys av lungor, lever, njurar och mjälte (inga data anges) visade lung Knöl bildning uteslutande i lungorna hos möss av alla behandlingsarmar (figur 4D-F). Påfallande, utbildade möss som får EV-utbildade MSCs hade högre antal lungmetastaser jämfört med möss som får icke-utbildade MSCs eller ingen MSCs (figur 4G), tyder på att inom den tumör mikromiljö MSCs ökning av metastaserande potentialen av osteosarkom celler i vivo7.
Figur 1 . Schematisk framställning av studiedesign. Människans primära MSCs är utbildad med EVs isolerade från odlade metastaserat osteosarkom (143B) celler. Cancer EV renhet bedöms genom elektronmikroskopi och internalisering av MSCs är visualiseras genom fluorescensmikroskopi och analyseras med flödescytometri. Förändringar i MSC cytokin uttryck profilen utvärderas av flödescytometrisk bead array (CBA). För att definiera rollen som EV utbildad civilingenjör på tumörtillväxt och metastaser bildning, osteosarkom-bärande möss injiceras med EV-utbildade (eller naiv) MSC. Tumörtillväxt följs av Mareld imaging (BLI) och bromsok värdering, medan metastaser bildning utvärderas vid experimentell slutpunkten av ex vivo BLI och histologisk analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Rening av EVs och deras interaktion med MSCs. (A) överföring elektronmikroskopi Mikrograf av EVs isolerade från 143B celler (skalstapeln: 100 nm). (B) upptag av GFLD-märkta 143B EVs av MSCs bedömas av fluorescensmikroskopi (skalstapeln: 10 µm). (C) internalisering av GFLD-märkta 143B EVs (orange) eller kontroll (human fibroblast, hf) EVs (grön) av MSCs som analyseras med flödescytometri. (D) Multiplex detektion av inflammatoriska cytokiner i supernatanterna av MSCs utsätts för 143B (143B EV-MSC) eller hf-EVs (hf EV-MSC) av flödescytometrisk bead array. 143B-MSC express högre nivåer av IL-6 och IL-8 jämfört med kontroll (obehandlat och hF EV-behandlade) MSCs. De streckade linjerna anger förskjutningen av cytokin produktion. (E) IL-8 och IL-6 proteinkoncentration i konditionerat media av EV-behandlade MSCs som analyseras av flödescytometrisk bead array, uttryckt som vik induktion i förhållande till den obehandlade kontrollen. Data är uttryckta i genomsnitt ± SD, n = 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Självlysande, ortotop xenograft musmodell av osteosarkom. (A) uppskattning av tumör volym med skjutmått mätningar och (B) tumörtillväxt mäts av Mareld imaging (BLI). Tumörens storlek uttrycks som fotonen flux (fotoner per sekund). p < 0,01, icke-utbildade MSC (n = 6) vs utbildad civilingenjör (n = 6), oparade t-test. Data är uttryckta i menar ± SEM. (C) företrädare BLI bilder av möss med etablerade osteosarkom tumörer (övre panelen). Färg-skala bar spänner från 7,7 x 107 (lila) till 2,6 x 108 (röd) fotoner per sekund. I den nedre panelen visualiseras området tumör utan BLI overlay. Pilarna visar tumören huvuddelen. Skala barer: 0,6 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Avbildning av MSCs och ex vivo lungvävnad. (A) Fluorescence mikroskopi bild av odlade GFP-positiv adipose-derived MSCs (grön). (B) immunofluorescens färgning av GFP-positiv MSCs i benmärgen och (C) i tumörvävnad MSC-mottagande möss (grön: MSCs, blå: DAPI missfärgade kärnor; skala bar 10 µm). (D-F) Ex vivo Mareld imaging (BLI) visar högre antalet metastaserande foci i möss som får EV-utbildade MSCs (F) jämfört med möss som fick naiva MSC (E) eller ingen MSC (D). Färg skalstapeln varierar från 1 x 106 (lila) till 1,5 x 106 (röd) fotoner per sekund. (G) kvantifiering av lung metastaser nummer som visualiseras av BLI (linjerna representerar medianen; * p < 0,05, ensidiga t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumör-utsöndras extracellulära blåsor (EVs) kan ändra physiologyen av lokal och avlägsen mesenkymala celler att generera en tumör-stödjande miljö. Här beskriver vi generationen av en preklinisk musmodell av osteosarkom som gör dissekering av EV-medierade interaktioner mellan tumörceller och mesenkymala stamceller (MSC) i vivo. Vi visar att systemisk injektion av humana tumör EV-utbildade MSCs i möss med osteosarkom xenograft starkt främjar cancer tillväxt och metastas bildas genom att aktivera den IL-6/STAT3 signalering väg7.
Nyligen genomförda studier har visat att cancer EVs kan stöd i bildandet av den pre metastaserande nischen genom att förändra beteendet hos lokala eller benmärg-derived stromaceller16,28,29. Dessa studier har utförts främst genom direkt injicering cancer-derived blåsor i mottagarens musen, vilket försvårar identifieringen av celltyper som är ansvarig för tumör-främjande effekter. I våra protokoll uppstår utbildning av MSCs med cancer EVs i vitro före MSC injektion. Detta tillvägagångssätt tillåter adressering av tumör-MSC överhörning till cancer progression specifika bidrag och minimerar störande indirekta effekter av cancer EVs på andra komponenter i lokala eller systemiska miljön.
För att utvärdera om de utbildade MSCs hem till webbplatsen tumören, injiceras vi systemiskt GFP-positiv MSCs i svansen venen i tumör-bärande möss. Svans ven injektioner är en avgörande, men tekniskt utmanande steg i många experimentella protokoll. För att säkerställa minimal variation mellan injektioner bör förfarandet utföras av erfarna utredare. Korrekt intravenös administrering kan bekräftas visuellt genom att rörelsen av vätska genom venen. Om ett vitt område visas på svansen eller motstånd påträffas under injektion, uppnåddes inte kärlaccessen. I detta fall bör förfarandet upprepas genom att sätta in nålen ovan första injektionsstället. Eftersom MSCs hem lätt på tumören, kan framgångsrika administrering av (GFP-positiv) MSCs bekräftas genom immunofluorescens färgning av tumörvävnad och benmärgen fyra dagar efter injektion (figur 4B, C).
Vi visar att cancer-utsöndras EVs inducerar en tumör-stödjande fenotyp i MSCs genom att förändra produktionen av inflammatoriska cytokiner. Detta resultat är särskilt relevant eftersom immun modulering och tumör immun skatteflykt är viktiga mekanismer i malign progression. Våra data tyder på att cancer EVs kan direkt, som rapporterats av oberoende studier21,30,31,32,33, eller indirekt (via MSCs) påverka innate eller adaptiva immunförsvaret komponenter. Men begränsar användningen av en xenograft (nedsatt immunförsvar) modell möjligheten att undersöka denna aspekt av EVs. Således, liknande synsätt i immunkompetenta eller humaniserad musmodeller måste göras för att definiera rollen för de EV-medierad tumör-MSC-immun-cell interaktionerna i cancer.
Slutligen, eftersom MSCs kan rekryteras från benmärg eller annan vävnad källor till tumörer, vår metod är inte begränsad till studiet av ben cancer, men kan användas för att undersöka betydelsen av tumör EV-utbildade MSCs i flera cancer typer2, 3 , 4 , 5 , 6, som nyligen genomförda studier i melanom och lymfom modeller bekräfta34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
S.R. Baglio stöddes av en gemenskap av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medfinansieras av Europeiska unionen. Detta projekt har dessutom fått finansiering från EU: s forskning och innovation-programmet Horisont 2020 enligt Marie Sklodowska-Curie bidragsavtalet ingen 660200 (att S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
