Summary
Qui usiamo l'elettroforesi del gel dell'agarosi semi-denaturante bidimensionale per confermare la presenza di amiloide-come le fibre di dimensioni eterogenee ed escludere la possibilità che l'eterogeneità di dimensioni è dovuto dissociazione delle fibre amiloidi durante il gel processo in esecuzione.
Abstract
Fibre amiloidi o amiloide-come sono stati associati con molte malattie umane e ora stanno scoprende sarà importante per molte vie di segnalazione. La capacità di rilevare prontamente la formazione di queste fibre nelle varie circostanze sperimentali è essenziale per capire la loro funzione potenziale. Molti metodi sono stati utilizzati per rilevare le fibre, ma non senza alcuni inconvenienti. Ad esempio, la microscopia elettronica (EM), o colorazione con rosso Congo o Thioflavin T spesso richiede purificazione delle fibre. D'altra parte, elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante (SDD-età) permette la rilevazione delle fibre amiloide-come SDS-resistente in estratti delle cellule senza purificazione. Inoltre, permette il confronto tra la differenza di dimensioni delle fibre. Ancora più importante, può essere utilizzato per identificare le proteine specifiche nelle fibre mediante Western blotting. È molto meno tempo e più facilmente accessibile a un più ampio numero di laboratori. SDD-età risultati mostrano spesso variabile grado di eterogeneità. Solleva la questione se parte dell'eterogeneità deriva dalla dissociazione della proteina complessa durante l'elettroforesi in presenza di SDS. Per questo motivo, abbiamo impiegato una seconda dimensione di SDD-età per determinare se l'eterogeneità di dimensioni visto in SDD-età è davvero un risultato di fibra eterogeneità in vivo e non il risultato di degradazione o di dissociazione di alcune delle proteine elettroforesi. Questo metodo permette la veloce, qualitativa conferma che le fibre amiloidi o amiloide-come non sono parzialmente dissociando durante il processo di SDD-età.
Introduction
La formazione di fibre amiloidi a causa di misfolding proteico a lungo è stata conosciuta per svolgere un ruolo in condizioni patologiche come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e la malattia di Huntington1. Più recentemente, la formazione di fibre amiloidi o amiloide-come è stata indicata per essere una parte delle vie di segnalazione in esseri umani, compreso durante la risposta immunitaria innata anti-virale2 e necroptosis3,4e negli organismi inferiori come lievito5,6. Pertanto, la capacità di rilevare queste fibre in laboratorio è importante. Attualmente, ci sono tre modi principali per rilevare amiloide e amiloide-come le fibre: l'uso di coloranti, EM e SDD-età.
L'uso di coloranti, come il rosso Congo o Tioflavina T, offre il vantaggio di essere veloce e facilmente rilevabile mediante microscopia o spettroscopia7. Tuttavia, il rilevamento da microscopia, nel caso di colore rosso di Congo, non fornisce nessuna specificità sulle proteine comprendono le fibre, o la dimensione delle fibre. Analogamente, l'uso della spettroscopia per rilevare associazione rosso Congo o Thioflavin T complessi proteici fornisce solo un risultato positivo o negativo.
EM fornisce prove inconfutabili della presenza di fibre e anche informazioni quantitative sulla fibra di lunghezza e diametro8. Tuttavia, questo metodo richiede purificazione molto rigorose. Inoltre, EM è una tecnica specializzata che utilizza apparecchiature costose.
SDD-età è stato utilizzato per rilevare SDS-resistente complessi proteici di Dalton mega compreso amiloide o amiloide-come le fibre. Offre molti vantaggi. In primo luogo, esso non richiede la purificazione delle fibre ed è facile da peform9. In secondo luogo, fornisce informazioni qualitative circa le dimensioni delle fibre, tra cui la dimensione relativa e la quantità di heterogenicity di fibra. Infine, poiché macchiarsi occidentale può essere eseguita dopo l'elettroforesi, è facile rilevare la presenza di tutta la proteina per la quale c'è un anticorpo, anche se va notato che poiché SDD-età è semi-denaturante, alcuni epitopi possono rimanere nascosta che complica la rilevazione di anticorpi.
Recentemente, chinasi di proteina d'interazione del ricevitore 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) sono stati segnalati alle fibre amiloidi forma per servire come piattaforme di segnalazione durante necroptosis, una forma programmata di necrosi3. Studiando queste fibre, il nostro laboratorio ha dimostrato che un'altra proteina associata necroptosis, miscelati di chinasi di lignaggio dominio simile (MLKL), formata anche amiloide-come le fibre4. Tuttavia, su esame con SDD-età, la dimensione delle fibre MLKL apparso distinta dalle fibre RIPK1 e RIPK3, che è comparso identiche tra loro (Figura 1). Questo è stato inaspettato perché è ben noto che MLKL si lega al RIPK1/RIPK3 per formare la necroptosis segnalazione complesso denominato il necrosome10.
Ci sono almeno due spiegazioni. In primo luogo, due totalmente distinte amiloide-come le fibre possono formarsi durante necroptosis, contenente un RIPK1/RIPK3 e l'altro contenente MLKL. In secondo luogo, un solo tipo di amiloide-come le fibre che contenenti RIPK1/RIPK3/MLKL possono formarsi durante il necroptosis, ma l'associazione di MLKL con le altre proteine è abbastanza debole che dissocia in epoca di SDD.
Per risolvere questo problema, vi proponiamo di eseguire un bidimensionale (2D) SDD-età. SDD-età-stable amiloide o amiloide-come le fibre avrà lo stesso pattern di migrazione durante l'elettroforesi di prima e seconda dimensione. Questo sarà rilevabile dopo trasferimento le proteine ad una membrana e lo svolgimento di un Western blot. Stabile fibre esporrà un reticolo diagonale affilato. Qualsiasi deviazione da questo vorrei suggerire che le fibre subiscono cambiamenti dovuto l'elettroforesi di SDS.
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Protocol
1. preparare i campioni
- Amiloide di cultura 2 x 106 producendo le cellule di cancro del colon HT-29 in un piatto di coltura del tessuto 10 cm in 10 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale e penicillina-streptomicina. Cellule di coltura durante la notte in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
- Dopo che le cellule crescono per 80% confluency, lavare le cellule con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina e incubare a 37 ° C per 3 min.
- Dopo che le cellule sono totalmente dissociate dal piatto, aggiungere 10 mL di terreno di coltura e trasferire le cellule con una pipetta 10 mL in una provetta conica 15 mL. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente. Aspirare il mezzo, risospendere le cellule in 5 mL di terreno di coltura e contare le celle utilizzando un contatore di cellule. Piastra di 2 x 106 cellule in ciascuno dei due piatti di 10 cm.
- Permettono alle cellule di aderire e recuperare durante la notte in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2. Applicare il trattamento per un piatto di indurre la formazione di amiloidi con un fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), inibitore di 100 nM Smac-mimetici e 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK1120 ng/mL. La combinazione è abbreviata come TSZ. Trattare l'altro piatto con veicolo come un controllo.
- Dopo l'appropriato intervallo di tempo, solitamente 6 h, raccolto il lysate delle cellule.
- Raschiare le cellule fuori la piastra con un raschietto di plastica e usare una pipetta di 10 mL per trasferire in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 min a 4 ° C.
- Lavare le cellule 2 volte, risospendere in 10 mL di PBS freddo ghiaccio e centrifugazione a 1.000 x g per 3 min a 4 ° C. Aspirare la soluzione di PBS.
Nota: Il processo può essere sospeso qui il pellet cellulare di congelamento in azoto liquido e archiviando a ˗80 ° C per 1 mese. - Trasferire il pellet cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e incubare in 0,3 mL di tampone di lisi per 30 min in ghiaccio. Centrifuga a 20.000 x g per 15 min a 4 ° C. Il supernatante è l'intero lisato cellulare.
Nota: Il processo può essere sospeso qui memorizzando il campione a-20 ° C per fino a diversi mesi. - Misurare la concentrazione di proteina da un'analisi di Bradford secondo il protocollo del produttore. Aggiungere 4 x buffer di caricamento del SDD-età preparare 20 µ l di 3 µ g / µ l di campione e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
2. preparare ed eseguire gel
- Aggiungere 2 g di agarosio per 200 mL di tampone Tris-acetato di 1x (TAE) in un becher di vetro e il calore nel forno a microonde per sciogliere l'agarosio. Aggiungere 1 mL di SDS 20% per una concentrazione finale di 0.1% di SDS. Agitare accuratamente per mescolare. Fare attenzione a non per generare bolle dopo l'aggiunta di SDS.
- Versare la soluzione di agarosio in una lastra di gel di 15 cm x 14 cm. Utilizzare una pipetta 1 mL per eliminare eventuali bolle. Inserire un pettine 20-bene all'inizio.
- Prima dimensione: pipetta 60 µ g di intera cella lysata sulla corsia di destra. Esegua il gel a 60 V per circa 4 h (fino a quando la parte anteriore della tintura è circa ¾ attraverso il gel) utilizzando il TAE contenente 0,1% SDS del buffer in esecuzione.
- Secondo quota: ruotare delicatamente il gel 90° in senso antiorario (Figura 2A). Esegua il gel a 60 V per circa 4 ore.
Nota: La condizione di esecuzione generale è 4 V/cm di lunghezza di gel. È importante che le condizioni di funzionamento sono esattamente lo stesso per le dimensioni di prime e seconda.
3. trasferimento
- Utilizzare il metodo di trasferimento capillare per trasferire le proteine ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Figura 2B).
- Aggiungere 500 mL di buffer di trasferimento da un contenitore di 20 x 20 cm circa. Fare un 5 cm e alta pila di asciugamani di carta accanto al contenitore. L'area della superficie della parte superiore dello stack deve essere maggiore delle dimensioni del gel.
- Immergere un filtro di carta 14 x 15 cm in tampone di trasferimento e posto in cima alla pila di asciugamani di carta. Fare attenzione a posizionare sulla carta senza rughe o bolle. Ripetere con un altro pezzo di carta da filtro.
- Attivare una membrana PVDF 14 x 15 cm in metanolo per 30 s quindi lo strato su carta da filtro avendo cura di utilizzare un rullo per eliminare tutte le bolle. Risciacquare il gel con tampone di trasferimento e lo strato sulla parte superiore della membrana, ancora rotolando fuori tutte le bolle.
- Coprire il bordo degli asciugamani carta più vicini al contenitore del tampone di trasferimento con involucro di plastica. È importante che il ponte di carta costruito nel passaggio successivo non entrare in contatto diretto con la pila di asciugamani di carta.
- Immergere un pezzo di carta da filtro 15 x 35 cm in tampone di trasferimento e posizionarlo in modo che un'estremità copre la parte superiore del gel e l'altra estremità è nel contenitore del tampone di trasferimento. Ripetere con un altro ponte.
- Coprire il recipiente con pellicola trasparente e lasciare per una notte a temperatura ambiente.
4. Western Blotting rilevamento
- Risciacquare la membrana con 50 mL di PBS contenente 0.05% Tween-20 (PBST) in un contenitore di 20 × 20 cm. Aggiungere 20 mL di latte di 5% in PBST. Roccia a temperatura ambiente per 30 min bloccare.
- Pipettare 10 µ l di anticorpo di coniglio anti-MLKL in 20 mL di latte di 5% in PBST e aggiungere al contenitore. Incubare il bilanciere durante la notte a 4 ° C.
- Lavare la membrana in 20 mL di PBST per 5 min., ripetere 5 volte.
- 4 µ l di anti-coniugato-HRP a 20 mL di latte di 5% in PBST e aggiungere al contenitore. Incubare il rocker a temperatura ambiente per 2 h.
- Lavare la membrana in 20 mL di PBST per 5 min., ripetere 5 volte.
- Aggiungere substrato di chemiluminescenza (ECL) ed esporre a pellicole di raggi x secondo il protocollo del produttore.
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Representative Results
Dopo induzione di necroptosis, RIPK1 e RIPK3 hanno mostrato amiloide-come i modelli quasi identici (corsie 2 e 4, Figura 1). Tuttavia, MLKL fibre erano più eterogenei e sembravano di essere più piccolo di fibre di RIPK1/RIPK3 (corsia 6, Figura 1). Che li ha spinti a sviluppare il metodo 2D SDD-età per affrontare la possibilità se MLKL forma fibre di RIPK1/RIPK3-indipendente o MLKL semplicemente si dissocia da grandi fibre di RIPK1/RIPK3/MLKL durante SDD-età.
Uno schema generale procedura di elettroforesi e trasferimento è mostrato nella Figura 2. Durante la prima dimensione SDD-età, fibre amiloidi o amiloide-come esporrà una sbavatura caratteristica, come si vede in Figura 3A. Al momento dell'esecuzione della seconda dimensione SDD-età, ci sono due possibili esiti. Nel caso nessuna degradazione o dissociazione durante il gel in esecuzione il processo, le fibre migrerà identicamente durante l'esecuzione della seconda, come hanno fatto nella prima manche. In questo caso, un Western blot esporrà un reticolo diagonale sulla membrana ad un angolo di 45° come si vede nella Figura 3B. Se durante il processo di SDD-età, dissociano le fibre, le fibre più piccole migreranno più velocemente durante l'elettroforesi secondo. In questo caso, un Western blot esporrà striature verticali sotto la linea diagonale, come mostrato nella Figura 3C.
Nel caso delle fibre MLKL vista durante necroptosis, mostrano la caratteristica sbavatura durante la prima dimensione SDD-età (Figura 4A). Quando quelle stesse fibre sono stati sottoposti a 2D SDD-età, hanno esibito una linea tagliente diagonale con nessun verticale striature (Figura 4B). Con questa prova, è stato concluso che la MLKL era non dissociare dalle fibre durante il processo di SDD-età e che le fibre contenenti MLKL vista in Figura 1 sono stati infatti distinte dalle fibre di RIPK1/RIPK3. Inoltre, quando RIPK3 era immuno-vuotati dai lisati cellulari, le fibre MLKL è rimasto intatto4, confermando che fibre di MLKL e RIPK1/RIPK3 fibre sono infatti distinte entità.
Figura 1 . Esame di amiloide-come le fibre durante necroptosis. Lisati di cellule intere sono state raccolte da cellule che subiscono necroptosis indotta da TNF e sottoposti a SDD-età. Western blot sono stati effettuati per RIPK1, RIPK3 e MLKL. Le fibre contenenti MLKL ha esibito un modello di migrazione distinte dalle fibre di RIPK1/RIPK3-contenente. Il monomero MLKL è a malapena visibile in questa condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Protocollo sperimentale. (A) schema dell'elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante bidimensionale (2D SDD-età). Iniziare caricando il campione sulla corsia di destra la maggior parte, con l'etichetta in rosso. Dopo il termine della prima manche dimensione, ruotare il gel 90° in senso antiorario. Eseguire l'elettroforesi di dimensione secondo. Solida freccia indica la direzione della prima dimensione eseguita, freccia tratteggiata indica la direzione della seconda dimensione eseguita. (B) Schema di trasferimento per capillarità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Risultati possibili. (A) la migrazione prevista reticolo di fibre amiloidi o amiloide-come dopo la prima dimensione della SDD-età. Solida freccia indica la direzione di migrazione. Pattern (B), la migrazione prevista dell'amiloide SDD-età-stable (nessun degrado o dissociazione) o amiloide-come le fibre dopo 2D SDD-età. Solida freccia indica la direzione della prima dimensione SDD-età. Freccia tratteggiata indica la direzione della seconda dimensione SDD-età. (C) il modello di migrazione previsto dell'amiloide non SDD-età-stabili o amiloide-come le fibre. Solida freccia indica la direzione della prima dimensione SDD-età. Freccia tratteggiata indica la direzione della seconda dimensione SDD-età. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Migrazione di MLKL contenenti fibre durante 1D e 2D SDD-età. Lisati di cellule intere (A) sono state raccolte da cellule stimolate con TSZ a subire necroptosis. I lisati sono stati sottoposti a SDD-età e un Western blot è stato effettuato per MLKL. Una caratteristica sbavatura è stata osservata. Lisati di cellule intere (B) sono state raccolte da cellule stimolate con TSZ a subire necroptosis. I lisati sono stati sottoposti a 2D SDD-età e un Western blot è stato effettuato per MLKL. È stata osservata una linea netta ad un angolo di 45°, che indica che le fibre non subiscono dissociazione durante SDD-età. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'aspetto più critico della 2D SDD-età è che le condizioni di elettroforesi sono gli stessi per la prima e la seconda dimensione. La capacità di rilevare una forte linea diagonale a 45° (che indica che non si è verificato nessun dissociazione o degradazione) dipende le fibre la migrazione in maniera identica sia durante electrophoreses. Utilizzando diverse condizioni, ad esempio cambiando la tensione o la lunghezza della fase di esecuzione, nasconderanno questi risultati. Inoltre, come è il caso per tradizionale 1D SDD-età, bollendo il campione dovrebbe essere evitato, come questo altererà amiloide e amiloide-come le fibre. Come è il caso per tutti i trasferimenti, si dovrebbe prestare attenzione per evitare bolle tra gli strati di carta da filtro, membrana e gel. Infine, durante la fase di trasferimento, è fondamentale che il ponte non si struggono e contattare direttamente la risma di carta asciugamano. Un modo affidabile per evitare questo problema è quello di utilizzare un piccolo pezzo di pellicola trasparente per coprire il bordo di carta assorbente.
Delle condizioni di funzionamento previste nel protocollo (60 V per 4 h) possono essere regolate. Ad esempio, in questo protocollo, il gel dell'agarosi è 14 x 15 cm. Se viene utilizzato un gel più piccolo, tensione (lunghezza di gel 4 V/cm) e fase di esecuzione deve essere regolate in modo proporzionale. Due campioni possono essere analizzati contemporaneamente utilizzando due pettini quando si prepara il gel. I campioni devono essere caricati nella destra più bene per ogni pettine. In questo caso, il tempo di esecuzione deve essere ridotto ancora affinché il campione superiore non viene eseguito nella parte inferiore metà del gel. Se il tempo è regolato per una sola dimensione del gel, è fondamentale che l'altra dimensione è regolata per una partita.
A differenza di SDS-PAGE, 1D e 2D SDD-età sono semi-denaturante. Perché le fibre rimangono intatte, alcuni epitopi potrebbero rimanere inaccessibile. Questo potrebbe limitare la rilevazione di alcuni anticorpi. 2D SDD-età è limitato nella sua capacità di determinare l'esatta dimensione delle fibre amiloidi o amiloide-come. Tuttavia, un confronto di dimensioni relative può essere fatto.
Tutti i complessi della proteina sono soggetti a dissociazione o degrado durante età del SDD, e così i risultati qualitativi possono essere difficili da interpretare. L'uso di 2D SDD-età permette conferma che eterogeneità di dimensioni visto durante SDD-età non è a causa di dissociazione SDS-dipendente durante l'elettroforesi. 2D SDD-età è opportuno utilizzare in qualsiasi contesto dove viene utilizzato il tradizionale 1 D SDD-età. 2D SDD-età è particolarmente utile quando dimensioni eterogeneità è osservata in 1 D SDD-età.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da una borsa di studio per S.H.-A. dal NIH/NCATS (TL1TR001104), una fondazione di Welch concedere (I-1827) e una sovvenzione di R01 da NIGMS (RGM120502A) a Z.W. Z.W. è lo studioso di Linthicum Murchison Virginia nella ricerca medica e prevenzione del cancro e Research Institute del Texas Scholar (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
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