Summary
Aqui usamos a eletroforese em gel de agarose semi desnaturação bidimensional para confirmar a presença de amiloide-como fibras de tamanho heterogêneo e excluir a possibilidade de que a heterogeneidade de tamanho é devido à dissociação das fibras de amiloides durante o gel processo em execução.
Abstract
Fibras de amiloides ou amiloide-como tem sido associadas com muitas doenças humanas e agora estão sendo descobertas importante para muitas vias de sinalização. A capacidade de detectar prontamente a formação destas fibras sob diferentes condições experimentais é essencial para a compreensão de sua função potencial. Muitos métodos têm sido utilizados para detectar as fibras, mas não sem alguns inconvenientes. Por exemplo, microscopia de elétron (EM), ou coloração com vermelho Congo ou Thioflavin T muitas vezes requer purificação das fibras. Por outro lado, eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação (SDD-idade) permite a detecção das fibras de amiloide como SDS-resistente em extratos de células sem purificação. Além disso, permite a comparação entre a diferença de tamanho das fibras. Mais importante, ele pode ser usado para identificar proteínas específicas dentro das fibras pela mancha ocidental. É menos demorado e mais facilmente acessível a um maior número de laboratórios. SDD-idade resultados muitas vezes mostram um grau variável de heterogeneidade. Levanta a questão se parte da heterogeneidade resulta da dissociação da proteína complexa durante a eletroforese na presença de SDS. Por esta razão, nós empregamos uma segunda dimensão de SDD-idade para determinar se a heterogeneidade de tamanho vista em SDD-idade verdadeiramente é um resultado de fibra heterogeneidade na vivo e não um resultado de degradação ou dissociação de algumas das proteínas durante eletroforese. Este método permite a confirmação rápida e qualitativa que as fibras de amiloide ou amiloide-como não são parcialmente dissociando durante o processo de SDD-idade.
Introduction
A formação de fibras amiloides devido ao enrolamento de proteínas tem sido conhecida para jogar um papel em condições patológicas como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e a doença de Huntington1. Mais recentemente, a formação de fibras amiloides ou amiloide-como foi mostrada para ser uma parte das vias de sinalização em humanos, incluindo durante anti-virais resposta imune inata2 e necroptosis3,4e em organismos inferiores como fermento5,6. Portanto, a capacidade de detectar essas fibras no laboratório é importante. Atualmente, existem três maneiras principais para detectar amiloide e fibras de amiloide, como: o uso de corantes e EM SDD-idade.
O uso de corantes, como o vermelho de Congo ou Thioflavin T, oferece a vantagem de ser rápida e facilmente detectável usando microscopia ou espectroscopia de7. No entanto, a detecção de pela microscopia, no caso de vermelho de Congo, não fornece nenhuma especificidade sobre quais proteínas compõem as fibras, ou o tamanho das fibras. Da mesma forma, o uso da espectroscopia para detectar a ligação vermelho Congo ou Thioflavin T de complexos de proteínas fornece somente um resultado positivo ou negativo.
EM fornece evidência conclusiva da presença de fibras e também informações quantitativas sobre a fibra comprimento e diâmetro8. No entanto, este método requer purificação muito rigorosa. Além disso, é uma técnica especializada que utiliza o equipamento caro.
SDD-idade tem sido usado para detectar SDS-resistente complexos de proteínas de Dalton mega incluindo amiloides ou amiloide-como fibras. Oferece muitas vantagens. Primeiro, ele não requer a purificação das fibras e é fácil de efetuar9. Em segundo lugar, fornece informações qualitativas sobre o tamanho das fibras, incluindo o tamanho relativo e a quantidade de heterogenicity de fibra. Por último, porque mancha ocidental pode ser realizada após eletroforese, é fácil detectar a presença de qualquer proteína para a qual existe um anticorpo, embora Note-se que porque SDD-idade é semi desnaturação, alguns resumos podem permanecer escondida que complica a deteção pelo anticorpo.
Recentemente, interação proteína quinase do receptor do 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) foram relatados à fibras de amiloides formulário para servir como plataformas de sinalização durante a necroptosis, uma forma programada de necrose3. Enquanto estudava estas fibras, nosso laboratório mostrou que outra proteína associada necroptosis, misturado a quinase de linhagem como domínio (MLKL), também formado de fibras de amiloide como4. No entanto, após um exame detalhado com SDD-idade, o tamanho das fibras MLKL apareceu distinto das fibras RIPK1 e RIPK3, que apareceu idênticas uns aos outros (Figura 1). Isso foi inesperado porque é sabido que MLKL vincula a RIPK1/RIPK3 para formar o necroptosis sinalização complexo chamado o necrosome10.
Existem pelo menos duas explicações. Primeiro, duas fibras de amiloide como totalmente distintas possam formar durante o necroptosis, um RIPK1 contendo/RIPK3 e o outro contendo MLKL. Em segundo lugar, apenas um tipo de amiloide-como fibras que contendo RIPK1/RIPK3/MLKL podem ser formado durante a necroptosis, mas a associação de MLKL com as outras proteínas é fraco suficiente que ele dissocia-se durante a idade do SDD.
Para resolver isso, propomos realizar uma bidimensional (2D) SDD-idade. SDD-idade-stable amiloide ou fibras de amiloide, como terá o mesmo padrão de migração durante a electroforese de primeira e segunda dimensão. Isto será detectável após a transferência das proteínas para uma membrana e realizar um Western blot. Fibras estáveis irão expor um padrão diagonal afiado. Qualquer desvio isto sugeriria que as fibras se submetem a mudanças devido a electroforese de SDS.
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Protocol
1. preparar as amostras
- Amiloide de cultura 2x106 produzindo células de câncer de cólon HT-29 em um prato de cultura de tecido de 10 cm em 10 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina. Células de cultura durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.
- Depois que as células crescem a confluência de 80%, lave as células com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 3 mL de solução de tripsina e incubar a 37 ° C por 3 min.
- Depois que as células são totalmente dissociadas do prato, adicionar 10 mL de meio de cultura e transferir as células com uma pipeta de 10 mL para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 1.000 x g, durante 3 min à temperatura ambiente. Aspire o meio, Ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura e contar as células usando um contador de célula. Placa de 2 x 106 células em cada um dos dois pratos de 10 cm.
- Permitir que as células de aderir e recuperar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2. Aplica o tratamento por um prato para induzir a formação de amiloides com fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), inibidor de 100 nM Smac-mimética e 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK11de 20 ng/mL. A combinação é abreviada como TZ. Trate o outro prato com veículo como um controle.
- Após o período adequado de tempo, geralmente de 6 h, colha o lisado celular.
- Raspe as células no prato com uma espátula de plástico e usar uma pipeta de 10 mL para transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 1.000 x g, durante 3 min a 4 ° C.
- Lavar as células 2 vezes por resuspending em 10 mL de PBS frio gelo e centrifugação a 1.000 x g, durante 3 min a 4 ° C. Aspire a solução de PBS.
Nota: O processo pode ser pausado aqui congelando o centrifugado em nitrogênio líquido e armazenando a ˗80 ° C por até 1 mês. - Transfira o centrifugado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e incubar em 0,3 mL de tampão de Lise por 30 min no gelo. Centrifugar a 20.000 x g por 15 min a 4 ° C. O sobrenadante é o lisado celular.
Nota: O processo pode ser pausado aqui armazenando a amostra a-20 º C por até diversos meses. - Medir a concentração de proteína por um ensaio de Bradford, de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione 4 x amortecedor do carregamento do SDD-idade para preparar 20 µ l de 3 µ g / µ l de amostra e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
2. preparar e executar géis
- Adicione 2 g de agarose para 200 mL de 1x Tris-Acetato tampão (TAE) num copo de vidro e calor no microondas para derreter o agarose. Adicione 1 mL de SDS 20% para uma concentração final de 0,1% SDS. Cuidadosamente agite para misturar. Tome cuidado para não gerar bolhas após a adição de SDS.
- Despeje a solução de agarose em uma laje de gel 15 cm x 14 cm. Utilize uma pipeta de 1 mL para eliminar quaisquer bolhas. Coloque um pente de 20-bem no topo.
- Primeira dimensão: pipeta 60 µ g de lisado na faixa da extrema-direita celular. Funcione o gel em 60 V para cerca de 4 h (até a frente do corante é cerca de ¾ através do gel) usando o TAE contendo SDS 0,1% como o buffer de execução.
- Segunda dimensão: Rode cuidadosamente o gel 90° no sentido horário(Figura 2). Funcione o gel em 60 V para cerca de 4 h.
Nota: A condição de funcionamento geral é 4 V/cm de comprimento de gel. É importante que as condições de execução são exatamente o mesmo para as primeiras e segunda dimensões.
3. transferência
- Use o método capilar de transferência para transferir as proteínas para uma membrana de difluoreto (PVDF) do polyvinylidene (Figura 2B).
- Adicionar 500 mL de tampão de transferência para um contêiner de 20 x 20 cm aproximadamente. Fazer uma pilha alta de 5 cm de toalhas de papel ao lado do recipiente. A área de superfície da parte superior da pilha deve ser maior que as dimensões de gel.
- Mergulhe num filtro de papel 14 x 15 cm no buffer de transferência e coloque no topo da pilha de toalha de papel. Tome cuidado para colocar no papel sem rugas ou bolhas. Repita com outro pedaço de papel de filtro.
- Ativar uma membrana PVDF 14 x 15 cm em metanol por 30 s em seguida mergulhá-la sobre o papel de filtro, tendo o cuidado de usar um rolo para remover todas as bolhas. Enxaguar o gel com buffer de transferência e mergulhá-la em cima da membrana, lançando novamente quaisquer bolhas.
- Cobrir a borda as toalhas de papel mais próximas ao contêiner do buffer de transferência com o envoltório plástico. É importante que a ponte de papel construída na próxima etapa não entre em contato direto com a pilha de papel toalha.
- Mergulhe um pedaço de papel de filtro de 15 cm x 35 cm no buffer de transferência e colocá-lo para uma extremidade cobre a parte superior do gel e a outra extremidade é no recipiente do buffer de transferência. Repita com a outra ponte.
- Cubra o recipiente com filme plástico e deixe durante a noite à temperatura ambiente.
4. Western mancha deteção
- Lavar a membrana com 50 mL de PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBST) em um recipiente de 20 cm x 20 cm. Adicione 20 mL de leite de 5% em PBST. Rocha em temperatura ambiente por 30 min bloquear.
- Pipete 10 µ l de anticorpo anti-MLKL em 20 mL de leite de 5% em PBST e adicionar ao recipiente. Incubar em roqueiro durante a noite a 4 ° C.
- Lave a membrana em 20 mL de PBST por 5 min. Repita 5 vezes.
- Pipete 4 µ l de anti-rabbit-HRP a 20 mL de leite de 5% em PBST e adicionar ao recipiente. Incube em balancim em temperatura ambiente por 2 h.
- Lave a membrana em 20 mL de PBST por 5 min. Repita 5 vezes.
- Adicione o substrato de quimioluminescência reforçada (ECL) e expor para películas de raio x, de acordo com o protocolo do fabricante.
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Representative Results
Após a indução de necroptosis, RIPK1 e RIPK3 mostraram quase idênticos padrões como amiloide (faixas 2 e 4, Figura 1). No entanto, fibras MLKL foram mais heterogêneas e pareciam ser menor do que fibras RIPK1/RIPK3 (faixa 6, Figura 1). Que nos levou a desenvolver o método de SDD-idade 2D para abordar a possibilidade MLKL formam fibras de RIPK1/RIPK3-independente ou MLKL dissocia-se simplesmente partir de fibras de RIPK1/RIPK3/MLKL grandes durante SDD-idade.
Um esquema geral do processo de eletroforese e transferência é mostrado na Figura 2. Durante a primeira dimensão SDD-idade, fibras de amiloides ou amiloide-como irão expor uma característica mancha, como visto na Figura 3. Após a execução da segunda dimensão SDD-idade, existem dois resultados possíveis. No caso de nenhuma degradação ou dissociação durante o gel, executando o processo, as fibras migrará identicamente durante a segunda execução como fizeram na primeira corrida. Neste caso, um Western blot vai expor um padrão diagonal da membrana em um ângulo de 45°, como visto na Figura 3B. Se as fibras se dissociam durante o processo de SDD-idade, as fibras menores irão migrar mais rápido durante o segundo eletroforese. Neste caso, um Western blot vai expor estrias verticais abaixo da linha diagonal, como mostrado na Figura 3C.
No caso das fibras MLKL vistas durante necroptosis, eles mostram o esfregaço característico durante a primeira dimensão SDD-idade(Figura 4). Quando essas mesmas fibras foram submetidas a 2D SDD-idade, eles exibiram uma linha diagonal afiada com nenhuma vertical estrias (Figura 4B). Com estas provas, concluiu-se que MLKL era não dissociando das fibras durante o processo de SDD-idade e que as fibras contendo MLKL vistas na Figura 1 foram efectivamente distintas das fibras RIPK1/RIPK3. Além disso, quando RIPK3 era imuno-esgotada dos lisados celulares, as fibras MLKL permanecem intacta4, confirmando que MLKL fibras e fibras de RIPK1/RIPK3 são entidades de fato distintas.
Figura 1 . Exame de amiloide-como fibras durante necroptosis. Lisados celulares toda foram colhidos das células, passando por necroptosis induzida por TNF e submetidos a SDD-idade. Borrões ocidentais foram realizados por RIPK1, RIPK3 e MLKL. As fibras que contenham MLKL exibiram um padrão de migração distinta da RIPK1/RIPK3-contendo fibras. O monômero MLKL é pouco visível sob esta condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Protocolo experimental. (A) esquema da eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação bidimensional (2D SDD-idade). Comece por carregar a amostra na maioria faixa da direita, marcada em vermelho. Após o término da execução de primeira dimensão, gire o gel 90° no sentido horário. Execute o segundo eletroforese de dimensão. Sólidos seta indica a direção da primeira dimensão executar, seta pontilhada indica a direção da segunda dimensão executar. (B) esquema de transferência por ação capilar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Possíveis resultados. (A), a migração esperada padrão de fibras amiloides ou amiloide-como após a primeira dimensão da SDD-idade. Sólidos seta indica a direção de migração. (B) a migração esperada padrão do amiloide SDD-idade-estável (sem degradação ou dissociação) ou amiloide-como fibras após 2D SDD-idade. Sólidos seta indica a direção da primeira dimensão SDD-idade. Seta pontilhada indica a direção da segunda dimensão SDD-idade. (C) o padrão de migração esperado do não-SDD-idade-stable amiloide ou amiloide-como fibras. Sólidos seta indica a direção da primeira dimensão SDD-idade. Seta pontilhada indica a direção da segunda dimensão SDD-idade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Migração de MLKL contendo fibras durante 1D e 2D SDD-idade. (A) célula inteira lisados foram colhidos de células estimuladas com Ederaldo submeter-se a necroptosis. Os lisados foram sujeitos a SDD-idade, e realizou-se um Western blot para MLKL. Observou-se uma característica mancha. (B) célula inteira lisados foram colhidos de células estimuladas com Ederaldo submeter-se a necroptosis. Os lisados foram sujeitos a SDD-idade 2D e um Western blot foi realizado por MLKL. Observou-se uma linha afiada em um ângulo de 45°, indicando que as fibras não sofrem dissociação durante SDD-idade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O aspecto mais importante da 2D SDD-idade é que as condições de eletroforese são os mesmos para a primeira e segunda dimensão. A capacidade de detectar uma nítida linha diagonal a 45° (indicando que não há dissociação ou degradação ocorreu) depende das fibras migrando de forma idêntica durante os dois de electroforese. Usar diferentes condições, por exemplo, alterando a tensão ou o comprimento de tempo de execução, irá obscurecer estes resultados. Também, como é o caso de tradicional 1D SDD-idade, a amostra de ebulição deve ser evitado, como isso vai interromper amiloide e amiloide-como fibras. Como é o caso de todas as transferências, deve ter cuidado para evitar bolhas entre as camadas de papel de filtro, membrana e gel. Por último, durante a etapa de transferência, é fundamental que a ponte não descaírem e contatar diretamente a pilha de papel toalha. Uma maneira confiável de evitar isto é usar um pequeno pedaço de filme plástico para cobrir a borda as toalhas de papel.
As condições de execução previstas no protocolo (60 V para 4 h) podem ser ajustadas. Por exemplo, no presente protocolo, o gel de agarose foi 14 x 15 cm. Se for usado um gel menor, tensão (comprimento de gel de 4 V/cm) e tempo de execução devem ser ajustadas proporcionalmente. Duas amostras podem ser analisadas de uma vez usando dois pentes, ao preparar o gel. As amostras devem ser carregadas no canto direito mais bem para cada pente. Neste caso, o tempo de execução novamente deve ser encurtado para que a amostra de topo não é executado no fundo metade do gel. Se o tempo é ajustado para a uma dimensão do gel, é fundamental que a outra dimensão é ajustada para corresponder.
Em contraste com o SDS-PAGE, ambos 1D e 2D SDD-idade são semi desnaturação. Porque as fibras permanecem intactas, alguns resumos podem permanecer inacessíveis. Isto pode limitar a deteção por alguns anticorpos. SDD-idade 2D é limitada em sua capacidade de determinar o tamanho exato de amiloides ou amiloide-como fibras. No entanto, pode ser feita uma comparação do tamanho relativo.
Todos os complexos de proteína estão sujeitos a dissociação ou degradação durante SDD-idade, e então os resultados qualitativos podem ser difíceis de interpretar. O uso do 2D SDD-idade permite a confirmação de que a heterogeneidade de tamanho vista durante SDD-idade não é devido à dissociação SDS-dependente durante a electroforese. SDD-idade 2D é apropriada para ser usada em qualquer contexto onde é usado o tradicional 1 D SDD-idade. SDD-idade 2D é especialmente útil quando a heterogeneidade de tamanho é observada em 1 D SDD-idade.
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Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por uma bolsa em S.H.-A. de NIH/NCATS (TL1TR001104), uma fundação de Welch conceder (I-1827), e uma concessão de R01 da NIGMS (RGM120502A) para Z.W. Z.W. é a Virginia Murchison Linthicum estudioso em pesquisas médicas e prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas estudioso (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
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