Summary
Существует нехватка значительной донорской печени, и были расширены критерии для печени доноров. Нормотермических ex vivo печени перфузии (NEVLP) был разработан для оценки и изменения функции органа. Это исследование демонстрирует модель крыса NEVLP и проверяет способность Пегилированный каталазы, для уменьшения травмы печени сохранения.
Abstract
Существует значительный дефицит печени аллотрансплантация тканей для трансплантации, а в ответ были расширены критерии доноров. В результате была введена нормотермических ex vivo печени перфузии (NEVLP) как метод для оценки и изменения функции органа. NEVLP имеет много преимуществ по сравнению с гипотермического и subnormothermic перфузии включая снижение сохранения травмы, восстановление нормальной орган функции в физиологических условиях, оценки производительности орган и как платформа для ремонта орган , ремонт и модификации. Были описаны мышиных и свиные NEVLP модели. Мы продемонстрировать мышиной модели NEVLP и использовать эту модель, чтобы показать один из его важных приложений — использование терапевтические молекулы, добавлен в печени perfusate. Каталаза является мусорщик эндогенного реактивнооксигенных видов (ров) и продемонстрировал снижение ишемии реперфузии в глаз, головного мозга и легких. Было показано, что ПЭГилирование целевой каталазы эндотелия. Здесь, мы добавили Пегилированный каталазы (PEG-CAT) в базу perfusate и продемонстрировала свою способность смягчения травмы печени сохранения. Преимуществом нашей грызунов NEVLP модели является недорогой по сравнению с более крупных животных моделей. Ограничение этого исследования является, что она не включает в настоящее время пересадки печени после перфузии. Таким образом прогнозирование функции после пересадки нельзя сделать с уверенностью. Однако модель трансплантации печени крысы хорошо известна и безусловно могут быть использованы в сочетании с этой моделью. В заключение мы продемонстрировали недорогой, простой, легко воспроизводимые NEVLP модель, с помощью крыс. Применение этой модели может включать тестирование Роман перфузатов и perfusate добавки, тестирования программного обеспечения, предназначенного для оценки орган и экспериментов, предназначенные для ремонта органов.
Introduction
Есть 14,578 больных в листе ожидания для трансплантации печени и приблизительно 7.000 пересадки выполняются за год1,2. В ответ на этой нехватки доноров расширили критерии для печени доноров; они часто называют маргинальных органов или расширенные критерии доноров и, как ожидается, для выполнения менее хорошо после трансплантации, чем стандартные критерии аллотрансплантантов, с более высокими ставками первичных трансплантата дисфункции и задержки трансплантата функция3, 4,5,6. В результате NEVLP была введена как метод для оценки и изменения функции органа6,7. Мы разработали модель крыса NEVLP и использовал эту модель для демонстрации одной из ее важных потенциальных – тестирование приложений Роман молекулы добавок к печени perfusate.
NEVLP был оценен как Мурина (Крыса), так и свинину модели, а также в брошенные человеческие органы6,8,9. Результаты первого испытания на человеке NEVLP были также недавно опубликованный10. Хотя явно гипотермического машина перфузии стал стандартом для сохранения почек, температура, при которой печени машина должна происходить перфузии остается спорным. NEVLP имеет много предлагаемые преимущества по сравнению с гипотермического и subnormothermic перфузии. К ним относятся сокращение сохранения травмы, восстановление нормальной орган функции в физиологических условиях, возможность оценить производительность орган и как платформа для органа ремонта, реконструкции и модификации7,11, 12,13,14,,1516,17.
Значительное количество исследований были завершены с использованием свиных NEVLP моделей. Хотя эти модели являются сравнительно недорогой, при рассмотрении модели с помощью органов человека или клинические испытания на человеке, они являются очень дорогими по сравнению с нашей небольшой животных NEVLP модели. Важным компонентом в эксперимент стоит perfusate. Мы в состоянии выполнить 4 h перфузии с 300 мл perfusate при относительно низких затратах. Кроме того стоимость мелких животных, включая крысы является очень низким по сравнению со стоимостью свиней.
По сравнению с других моделей NEVLP в крыса модель, представленная здесь относительно прост в реализации и имеет широкий спектр применения. Перфузии цепи можно увидеть на рисунке 1. Perfusate начинается в perfusate водохранилище (1), который является контейнером с рубашкой воды. Perfusate вытащил из водохранилища с помощью валика насоса (2) и толкнул в windkessel (3), а затем Оксигенатор (4). Оксигенатор устанавливается противоточный газа и perfusate потока для обеспечения максимальной газообмена. Perfusate затем приступает к Отопление катушки (5) внутри камеры перфузии для обеспечения его физиологического температуре, и Пузырь ловушки (6) для предотвращения перфузии пузырьков воздуха там до органа (7) и после органа (8) образца порты, которые позволяют perfusate быть пробы. Perfusate затем поступает через канюлю воротной вены печени. Канюля воротной вены прилагается к давление монитор, что диаграммы значения на программное обеспечение сбора данных. Perfusate затем выходит из печени через канюлю МКВ и впадает в блоке эквалайзер давления (9). Наконец perfusate вытащил из блока давления обратно через насос ролик и опорожняется в водохранилище. Эта модель включает в себя непрерывное перфузии в воротной вены и оставляет пульсирующего поток печеночной артерии и диализа, используемых в некоторых других моделей, каждая из которых требует отдельного и дополнительного цепи, но показали, ранее, чтобы не быть необходимые9,13.
Чтобы исследовать дополнение Роман терапевтические молекулы perfusate, мы выбрали фермента каталазы. Каталаза является эндогенного мусорщик ROS, которая является частью клетки внутренней обороны механизма для смягчения последствий ROS18. Каталаза выражение увеличение печени ишемии реперфузионных повреждений19. Для уменьшения ишемии реперфузии в глаз, головного мозга и легких20,21,22,,2324была продемонстрирована экспериментальная дополнением каталазы. Было показано, что ПЭГилирование целевой каталазы в эндотелия и помощь в освоении каталазы в эндотелиальных клеток25. ПЭГ-CAT находится под управлением системно, с ограниченной эффективности в снижении печеночная ишемии реперфузии травмы; Однако мы предположили, что добавление PEG-CAT к цепи перфузии изолированной органа приведет к улучшению результатов26,27,28. Здесь, мы добавляем PEG-CAT для нашей базы perfusate и продемонстрировать его способности смягчить травмы печени сохранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены согласно указаниям институциональный уход животных и Национальный исследовательский совет руководство для гуманного ухода и использования лабораторных животных (IACUC) и претерпела утверждения IACUC университета Огайо государственного комитета.
1. Начальная настройка
-
Приготовляют раствор перфузии, объединяя следующие: 86 мл 25% альбумина, 184 мл Уильямс средств массовой информации, 30 мл пенициллина/стрептомицина (10 ед/мл пенициллин и 0,01 мг/мл стрептомицина), инсулин (50 U/L), гепарином (0.01 ед/мл), L-глютамин (0,292 г/Л), и гидрокортизон (0,010 г/Л) в суммарный объем 300 мл. Базовый perfusate, ПЭГ-CAT группы и добавьте 625 ед/мл PEG-Cat.
- Буферного раствора perfusate, с помощью трис (гидроксиметил) aminomethane (THAM) до рН 7,4. Используете машину газов артериальной крови для подтверждения perfusate рН.
-
Настройка цепи (рис. 1).
- Включите теплую ванну водой и установите его в 37 ° C. Позвольте камере орган для разминки.
- Вылить смешанные и буферизации perfusate в водохранилище и начать распространение.
Примечание: Perfusate, упомянутых в этом шаге был подготовлен на шаге 1.1.1. - Включите кислородом газ (95% кислорода и 5% двуокиси углерода) в счетчик потока через Оксигенатор в линии.
- Включите программное обеспечение сбора данных и нажмите кнопку «Пуск», чтобы записать в течение всего эксперимента.
-
Настройка хирургический микроскоп и операционной комнате (рис. 2).
- Включите все оборудование, включая Совет потепления, электрокоагуляции, анестезии и жизненно важные признаки (сердца и кислорода насыщения) мониторинг оборудования.
Примечание: Микроскоп параметры будут зависеть от Микроскоп используется и может быть скорректирована для комфорта пользователя. - Заполните шприц 10 мл анестезии с 10 мл жидкой изофлюрановая для ингаляции (молекулярная масса 184.5 г/моль) и место в группе анестезии.
- Поместите шприц 0,5 мл гепарина (50 ед), хирургические инструменты, 4-0 и 7-0 Шелковый шов, стерильные ватные тампоны и 4 x 4 см нетканый марлевые губки надлежащим образом (рис. 2).
- Включите все оборудование, включая Совет потепления, электрокоагуляции, анестезии и жизненно важные признаки (сердца и кислорода насыщения) мониторинг оборудования.
- Подготовьте изофлюрановая камеры.
2. индукции анестезии
- Носить следующие средства индивидуальной защиты (СИЗ): хирургические маски, хирургические перчатки, одноразовые платье.
- Взвешивание крыс.
Примечание: Мы используем крысах Sprague-Dawley между 250-350 г. - Включите компрессор кислорода и изофлюрановая. Поместите крыса, после весил, в изофлюрановая камеру и закрепите крышку. Вызвать обезболивание с помощью 6% изофлюрановая поставляется с 2 Л/мин кислорода.
Примечание: Точное изофлюрановая дозы, используемой будет зависеть от используемой системы конкретных анестезии. - Использование электронных Клипперс обрезать волосы животного брюшной.
- Замените животного в изофлюрановая камере.
- Включите блок анестезии, расположенный в операционной комнате.
- Удаление крысы из изофлюрановая камеры при анестезии полностью индуцируется. Подтвердите глубины анестезии с помощью щепотку мыс.
3. закупки процедура
-
Подготовьте 16 G портала манжеты (рис. 3).
- Начинаются с 16 G angiocatheter. Вырежьте часть трубы 7 мм. Определить середину секции 7 мм, измеряя 3,5 мм. Incise на середину и снимите переднюю половину трубы.
- Используйте зажим для раздавить это теперь плоская часть. Используйте зажигалку таять на другом конце angiocatheter для создания губ. Место кончике непосредственно в пламени или он будет воспламеняться.
-
Подготовьте канюля желчных протоков.
- Возьмите angiocath 27 G и отрезали инъекционным портом, оставив только катетер. Подключите это 10 см раздел 27 G cannular труб.
- Позиция Крыса с его носом в анестезии носовой конус и ее четыре конечности прикол. Контролировать жизненно важные признаки подключив монитор к левой задние конечности. Выполните щепотку мыс, чтобы подтвердить соответствующие глубины анестезии. Продолжить анестезии на 4% изофлюрановая (для животных, которые весят > 250 g).
- Spray животного живота с 70% изопропиловый спирт. Дайте высохнуть. Место стерильным драпировка над животным.
- Сделайте срединной разрез от мечевидного лобка с помощью острых ножниц и проходящий через кожу (рис. 4). Осторожно введите брюшины и надрезать мышцы. Позаботьтесь, чтобы избежать повреждения мочевого пузыря в нижней аспект этого разреза и печени в Улучшенный аспект этого разреза.
- Расширить разрез сбоку слева и справа в форме креста на уровне нижней границы печени.
- Поверните анестезии до 2% (для животных весом > 250 g).
- Отказаться от мечевидного отростка, с использованием хомут изогнутые комаров и ребра, используя ребро ретракторы (рис. 5).
- Вырезать серповидной, диафрагмальный и gastrohepatic связки с острыми ножницами.
- Найдите и галстук офф диафрагмальный вен с 7-0 шва как недалеко от его происхождения, как можно предотвратить протечки.
- Потрошение крыса, используя аппликатор наконечник стерильным хлопка смоченной и завернуть в марлю, смоченную 0,9% нормальное saline кишечника. Будьте осторожны чтобы не растянуть сосудистую тонкой кишки.
- Вскрыть над нижней полой вены (IVC), чтобы удалить излишки ткани. Вскрыть за просто превосходит бифуркации МКВ и пройти цикл 4-0 Шелкового шва для последующего использования (рис. 6).
- Убрать правой почки оказывать воздействия на право надпочечниковой Вены. Убрать правой доли печени сверху марлей. Галстук с право надпочечниковой Вены с Шелковый шов 7-0, как можно ближе к IVC как можно скорее и прижечь через его дистальнее галстук (рис. 7).
- Тщательно анализировать, селезеночной вены, связать его с помощью двух 7-0 шелковыми швами и пересекают его между двумя швами.
- Галстук с и перевязать дополнительные вен с помощью 7-0 Шелковый шов для дополнительной длины на воротной вены, при необходимости.
Примечание: Иногда существуют мелкие ветви infrahepatic IVC между правом надпочечниковой Вены и уступает печени. - Вскрыть вокруг гастродуоденальной артерии, галстук с гастродуоденальной артерии с Шелковый шов 7-0 и перевязать гастродуоденальной артерии.
- Вскрыть вокруг печеночной артерии и затем поместите 7-0 Шелковый шов галстук вокруг него (рис. 8).
-
Вскрыть из желчных протоков.
- Проверьте длину желчных протоков. Галстук с желчных протоков на дистальном конце с помощью 7-0 Шелковый шов. Место в цикле 7-0 Шелкового шва вокруг желчных протоков проксимально как можно скорее.
- Вырезать отверстие, что составляет половину диаметра протоков малых ножницами и 27 G катетер в желчных протоков проксимально. Галстук катетер на месте с помощью римские сандалии галстук шов (рис. 9).
- Inject 0,5 мл гепарина (50 ед) в Вену полового члена или IVC животного, с помощью иглы 27 G.
Примечание: 27 G шприц инсулина может также использоваться вместо. - Зажим и галстук с мкВ, используя ранее установленный Шелковый шов 4-0.
- Галстук с печеночной артерии, используя ранее установленный Шелковый шов 7-0.
- Зажим от воротной вены, с использованием микрохирургической клип. Иглу воротной вены, используя 22 G angiocatheter. Флеш воротной вены с 60 мл холодного физиологический 0,9% с 1 мл раствора гепарина (100 ед) до печени бланша (Рисунок 10).
Примечание: Если печень не бланшировать сразу же он может массируют с аппликаторами наконечник стерильным хлопка. - Подвергать suprahepatic МКВ и вырезать через его как высокий в грудь как можно скорее.
- Выполняйте гепатектомии. Вырезать вокруг диафрагмы, вырезать печеночной артерии, вырезать мкВ, вырезать воротной вены, вырезать любых дополнительных связок и вынуть печень. Место печени в лед холодной 0.9% нормальное saline (Рисунок 11).
- Место 16 G сосудистого манжете в воротной вены (Рисунок 12). Место печени на контуре ex vivo нормотермических печени перфузии.
4. Ex Vivo нормотермических печени перфузии
Примечание: Perfusate, здесь был подготовлен протокол шаге 1.1.1.
- Поместите канюля воротной вены в манжетами воротной вены (рис. 13).
- Во время размещения канюля воротной вены поддерживать поток perfusate через цепь в 2 мл/мин для начала. Смотреть монитор для любой шипы в портальной Вене давления; Это может указывать на судно стали закрыта и репозиционирования канюлю необходима.
- Шовный материал в IVC канюля для возвращаемого потока perfusate, с помощью 7-0 Шелковый шов.
- Как только оба канюли в место, начните, поднимая потока в 1 мл/мин до достижения физиологической давления в диапазоне 10 – 16 КМЗ2O.
-
Возьмите 1 мл образца от до и после портов на 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 мин перфузии. 1 мл капель делят на две пробы 0,5 мл.
Примечание: 0,5 мл это будет использоваться в протоколе шаг 4.5.1 и 0,5 мл будет использоваться протокол шаге 4.5.2.- Оснастки заморозить 0,5 мл данного образца в криогенных трубы в жидком азоте.
- Выполните анализ газов артериальной крови с помощью оставшиеся 0,5 мл perfusate.
- После запуска анализ газа крови в каждый момент времени (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 мин) изучения уровня pH и буфера perfusate при необходимости вернуться к рН 7,4.
- В конце 4 h перфузии отключите печени от цепи перфузии. Разделите 0,5 g сегментов печени. Оснастки заморозить ткани печени в криогенных трубы в жидком азоте.
5. после эксперимента анализ
-
Определите Аланинаминотрансфераза (АЛТ) (ALT) уровень в perfusate на 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 мин, с использованием коммерческих колориметрические пробирного комплекта.
- Короче говоря, инкубировать perfusate с реакция смеси реагентов при 37 ° C 60 мин измерения оптической плотности значений на 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
-
Однородный 0,5 г с 100 мкл буфера lysis ткани печени и анализировать ткани lysate аденозинтрифосфатом (АТФ), глутатион (GSH) и диальдёгида (MDA).
- Короче говоря Измерьте уровни ATP с использованием коммерческих пробирного комплекта образцов ткани печени. Смешать образца с буфером реакции и инкубации при комнатной температуре за 30 мин измерения оптической плотности в 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
- Измерения уровней GSH с использованием коммерческих пробирного комплекта образцов ткани печени. Смешайте образцы тканей с Пробирной коктейль. Измерение оптической плотности значений на 405-414 Нм.
- Измерения уровней MDA с использованием коммерческих пробирного комплекта образцов ткани печени. Смешать образцы с ТБА и тепла до 95 ° C 60 мин центрифуги реагент и передать плиту 96-луночных супернатант. Измеряют оптическую плотность на 532 нм.
-
Однородный 0,5 г с 100 мкл буфера lysis ткани печени и анализировать lysate для Относительная активность каспазы-3/7, используя набор коммерческих пробирного ткани.
- Смешать lysate ткани с буфером пробирного каспазы-3-7 реагента и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
- Измерьте уровень флюоресценции в каждой хорошо с помощью Считыватель микропланшетов.
-
Определите уровень apoptotic клеток в образцах тканей печени, используя набор коммерческих в месте обнаружения смерти.
- Предварительно обработать 0,5 g ткани разделы с 10 U/mL протеиназы K 10 мин и затем инкубации с реакционной смеси при 37 ° C 60 мин выполнять анализ, используя флуоресцентный Микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Размер выборки три крыс каждой группы был использован. ALT была измерена на 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 мин перфузии. Мы использовали студента t-тесты для сравнения результатов между базовой perfusate и базовый perfusate плюс PEG-CAT групп на каждом этапе. Сравнивая базовый perfusate и базовый perfusate плюс PEG-CAT групп, существует значительно меньше (p < 0,05) ALT в базовый perfusate плюс PEG-CAT группы на 150, 180, 210 и 240 мин (Рисунок 14А).
Для того, чтобы анализировать повреждения тканей из базового perfusate и базовый perfusate плюс PEG-CAT групп было закуплено ткани печени. Мы использовали студента t-тесты для сравнения результатов между базовой perfusate и базовый perfusate плюс PEG-CAT групп. Ткани СПС была сохранена в базу perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с группой только базовый perfusate (рисунок 14B, p < 0,05). Производство тканей MDA был значительно выше в группе базовый perfusate, чем в базовой perfusate плюс PEG-CAT группы (Рисунок 14C, p < 0,05). Общая GSH была сохранена в базу perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с группой только базовый perfusate (Рисунок 14D, p < 0,05).
Чтобы проанализировать апоптоза, ткани печени активность каспазы-3/7 сравнивали между группами. Флуоресценции была измерена в каждой скважине. Мы использовали студента t-тесты для сравнения результатов между базовой perfusate и базовый perfusate плюс PEG-CAT групп. В базовый perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с базовой perfusate только группа заметно снизилась активность каспазы-3/7 (Рисунок 15A, p < 0,05). Окрашивание маркировки Ник-конец (TUNEL) dUTP трансферазы (TdT) терминала deoxynucleotidyl был использован для сравнения апоптоз между группами. Процент apoptotic клеток была значительно меньше в базовый perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с базовой perfusate одиночку группа (Рисунок 15B, p < 0,05).
Рисунок 1: схема перфузии. Компоненты контура помечены. Perfusate начинается в perfusate водохранилище (1), который является контейнером с рубашкой воды. Perfusate вытащил из водохранилища с помощью валика насоса (2) и толкнул в windkessel (3), а затем Оксигенатор (4). Оксигенатор устанавливается противоточный газа и perfusate потока для обеспечения максимальной газообмена. Perfusate затем переходит к нагревательной спирали (5) в камере перфузии чтобы убедиться, что это физиологическая температуры, и Пузырь ловушки (6) для предотвращения перфузии воздушных пузырьков. Есть предварительно органа (7) и после органа (8) образца порты, которые позволяют perfusate для выборки. Perfusate затем поступает через канюлю воротной вены печени. Канюля воротной вены прилагается к давление монитор, который регулирует давление эквалайзер (9). Наконец perfusate вытащил из блока давления обратно через насос ролик и опорожняется в водохранилище. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: операционной комнате и хирургический инструмент set-up. Хирургический микроскоп (1) должна быть скорректирована соответствующим высоту и масштаб для пользователя. Изофлюрановая могут быть предварительно загружены в анестезия машины (2). Нос животного помещается в носовой конус (3). Хирургические инструменты должны быть изложены где они могут быть легко доступны (4). Электрокоагуляции (5) поблизости полезно. Швы (6) должны быть предварительно нарезанные так куски могут быть получены быстро, когда это необходимо и дополнительно должны быть доступны (7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: подготовить 16 G воротной вены манжету. Начинаются с 16 G angiocatheter. Вырежьте часть трубы 7 мм. Определить середину секции 7 мм, измеряя 3,5 мм. Incise здесь и снимите переднюю половину трубы. Используйте зажим для раздавить это теперь плоская часть. Используйте зажигалку сжечь на другом конце angiocatheter для создания губ. Место кончике непосредственно в пламени или он будет воспламеняться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: срединная разрез. Сделайте срединной разрез от мечевидного (1) до лобка (2) с помощью острых ножниц и проходящий через кожу и мышцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: получить достаточное опровержение. Отказаться от мечевидного отростка (1) с помощью изогнутой комаров зажим (2) и ребра, поставив ребром ретракторы (3, 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: рассечение нижней полой вены (IVC). Флип печени до подвергайте правой почки (1) и воротной вены (2). Вскрыть вокруг IVC (3) и поместите петлю шва 7-0 для использования в будущем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: перевязка право надпочечниковой Вены. Убрать правой почки (1) предоставлять воздействия право надпочечниковой Вены. Галстук с правом надпочечниковой Вены и сократить его. Смачивают марлевые (2) может использоваться для защиты печени во время этот маневр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: печеночная артерия диссекции. Вскрыть вокруг и место галстук вокруг печёночной артерии (1) возле где он проходит под воротной вены (2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: желчных протоков катетеризации. Cannulate желчных протоков (1) с помощью angiocatheter 27 G (2) подключены к 27 G труб (3). Это поможет собрать желчи во время перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: печень заподлицо. Очистка печени (1) с 60 cc холодной физиологический 0,9% с 100 ед (1 мл) гепарина с помощью 16 G angiocatheter (2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11: после гепатектомии. Выполните гепатектомии и печени в холодной соленой. Будьте осторожны, не выбить канюля желчных протоков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 12: воротной вены наручников. Найдите воротной вены. Используйте большой зажим (1) провести до Вены, оставив несколько миллиметр губы Вену выше зажима. Чтобы поместить сосудистого манжете 16 G (4) в воротной вены используйте микрохирургическое щипцы (2, 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 13: манжета воротной вены и Улучшенный IVC катетеризации. Иглу воротной вены манжеты (1) и Улучшенный IVC (2). Необходимо соблюдать осторожность не для того, чтобы выбить канюля желчных протоков (3) или расслабиться в сауне. Кроме того заботиться не крутить Улучшенный мкВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 14: анализ повреждения тканей в базовые основания и perfusate только perfusate и плюс PEG-CAT группы (N = 3/группа). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. (A) Аланинаминотрансфераза (АЛТ) (ALT) уровнях. Сравнивая ALT уровнях между базовой perfusate и базовый perfusate плюс Пегилированный каталазы (PEG-CAT) группы, существует значительно меньше ALT в базовый perfusate плюс PEG-CAT группы на 150, 180, 210 и 240 мин (p < 0,05). (B) аденозинтрифосфат уровни. Ткани аденозинтрифосфатом (АТФ) была сохранена в базу perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с группой только базовый perfusate (p <0,05). (C) диальдёгида уровни. Производство тканей диальдёгида (MDA) был значительно выше в группе базовый perfusate, чем в базовой perfusate плюс PEG-CAT группе (p < 0,05). (D) глутатиона. Общая глутатиона (GSH) была сохранена в базу perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с группой только базовый perfusate (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 15: Анализ апоптоза в базовые основания и perfusate только perfusate и плюс PEG-CAT группы (N = 3/группа). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. (A) в базовый perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с базовой perfusate только группа заметно снизилась активность каспазы-3/7 Activity.Caspase 3/7 (p < 0,05). (B) терминала deoxynucleotidyl трансферазы (TdT) dUTP Ник-конце маркировки (TUNEL) пятнать. Изображения были взяты с помощью 4 X флуоресцентный Микроскоп. Процент apoptotic клеток была значительно меньше в базовый perfusate плюс PEG-CAT группы по сравнению с базовой perfusate (p < 0,05). Зеленый: apoptotic клетки. Синий: ядерная. Масштаб баров = 1000 мкм. TUNEL позитивные клетки были количественно путем подсчета клеток от 4 случайных микроскопических полях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует значительный дефицит печени аллотрансплантация тканей для трансплантации, и в ответ критерии доноров были Расширенный1,2,3,4,5. В результате нехватки доноров была введена NEVLP как метод для оценки и изменения функции органа6,7. Мы разработали модель крыса NEVLP. Кроме того, мы использовали эту модель, чтобы продемонстрировать один из его важных потенциальных приложений — тестирование Роман молекулы добавок в печени perfusate. Здесь, мы добавили PEG-CAT в базу perfusate и продемонстрировала свою способность смягчения травмы печени сохранения.
Важнейшие шаги
Контуре печени перфузии был приобретен и использован без изменений. Цепи могут быть визуализированы на рисунке 1. Perfusate водохранилище используется — водяной рубашкой контейнер, который используется для поддержания perfusate физиологических температуре. Из водохранилища perfusate вытащил валиком накачкой и толкнул в windkessel камеру. Эта камера помогает ослабить пульсирующего поток perfusate и сделать его более ламинарные для вступления в этот орган. После windkessel камеры perfusate потоки в Оксигенатор. Оксигенатор устанавливается для противоточный газ и perfusate потока, обеспечивая максимальный газообмена в perfusate с 95% кислорода. Perfusate затем переходит к Отопление катушки для обеспечения, что это до сих пор на физиологических температур. Пузырь ловушку перед органом предотвращает перфузии воздушных пузырьков. Perfusate затем закачивается из Пузырь ловушки и через канюлю воротной вены печени. Канюля воротной вены имеет небольшой филиал отходящими от него для контроля давления. Трубки датчика следует загрунтовать с жидкостью не воздух, поэтому нет потерь давления на датчик. После насыщения кислородом орган, perfusate течет из печени через уступает Вены канюля для давления эквалайзер. Давление эквалайзер блок помогает предотвратить над наддув цепи или органа. Наконец perfusate вытащил из блока давления обратно через насос ролик и опорожняется в водохранилище.
Перед началом каждого перфузии визуальный осмотр цепи должны выполняться для выявления любой ущерб или накопления на схеме компонентов или трубы. Если есть накопление бактерий или других веществ на цепи, части следует заменить или очищены, если это возможно. Далее следует промыть раствором моющего средства, поддержание внутренних компонентов. Поскольку компоненты являются время промыть датчика давления и давления линии должны быть очищены от любых воздушных пузырьков с дейонизированной водой. Кроме того поток должен корректироваться на регулярной основе, чтобы убедиться, что чтение давления надлежащим образом реагировать на изменения. Если датчик давления не отвечает надлежащим образом, все элементы в строке датчика следует проверить и калибровку при необходимости. В начале перфузии важно убедиться, что сосуды печени не стал сильно перегнут или витой при подключении печени к цепи. Если это произошло там будет непосредственным давлением Спайк видно на мониторе логарифмический тренд. Наиболее распространенная ошибка является излом в воротной вены с плохо позиционируется канюли. Эта проблема может быть решена путем перемещения судна в более естественное положение, потянув его немного и выпрямление воротной вены. Давление монитор показывает решение этой проблемы с падением давления и повышения согласованности. Далее при подключении воротной вены манжеты к воротной вены канюля судно может стать витой препятствующих кровоснабжения органа. Регулировка манжеты и исправление этой ошибки приведет к внезапного всплеска в воротной вены давления, которые должны затем немедленно вернуться к понижение давления и уровня покинуть на последовательного потока. Изломами или витой IVC быстро может быть идентифицирован не вытекают из канюли и выпуклые судна. Оба из этих ошибок в верхней полой вены приведет также к повышенное давление, однако в отличие от неприятностей воротной вены это давление, оказываемое на орган и должна быть решена быстро. Этот вопрос должен быть решен в течение 10 мин или эксперимент должен быть отменен. Немедленное указание для отмены эксперимент видя ясно отек в органе в течение первых 20 мин.
Если есть утечка из печени или от одного из канюли соединений важно контролировать уровень perfusate водохранилище. Запуск из perfusate и откачки воздуха могут быть катастрофическими для эксперимента. Как только воздух закачивается в линии невозможно приостановить эксперимент и повторно премьер Кровопроводящие магистрали. Единственным возможным коррекции предназначен для Пузырь ловушки для захвата вводится воздух.
Модификации и устранение неполадок
После того, как схема очищается Оксигенатор можно поместить в строку и затем можно грунтовать цепь с perfusate. Правильно очистки воздуха от Оксигенатор может занять несколько минут, но является важным шагом в убедившись, что эмболии в середине перфузии не генерируется. После Оксигенатор полностью заливают perfusate Пузырь ловушки должны быть заполнены рядом с захватить воздушные пузыри, которые формируют. На данный момент схема потока должно быть присвоено поток 1 или 2 мл/мин держать perfusate, перемещение, пока печень не готова для катетеризации.
После cannulating воротной вены и IVC печени, давление следует увеличить и затем выравниваться. Как поток увеличивается до нормальной физиологической давления записанные давление следует начать наращивать поэтапный аналогично. После того, как был достигнут требуемый расход (8 – 16 mmHg) давление должно оставаться довольно постоянным. Мы нацелены на давление 10 мм ртутного столба и соответствующим образом скорректировать потока. Орган может отличаться требуемого расхода до давления 10 мм ртутного столба. Там могут быть небольшие утечки perfusate от органа, но этот perfusate может быть сбор и вернулся в водохранилище.
Цепи должны быть очищены после каждого перфузии для поддержания в камере и водохранилище и сохранения одноразовые трубки и портов. Все perfusate должны быть удалены из схемы. Цепи должны быть немедленно очищены с минимум 300 мл деионизованной воды. В то время как обессоленной воды очищает схема труб внешние части должны быть очищены надлежащим образом. Внешние компоненты следует смыть или нежно вытер вниз и разрешено воздух сухой. Схема компонентов хрупкие и могут быть легко повреждены. Поэтому крайне важное значение для его очистки осторожно. Внутренний контур должны быть сохранены в 5% растворе щелочного моющего средства в деионизированной воде когда не в пользе. Моющее средство в цепи помогает продлить срок службы труб и предотвратить накопление на другие компоненты, такие как Пузырь ловушки и давление эквалайзер.
Наибольшие трудности с цепью можно предотвратить с тщательной чистки и обслуживания схемы после каждого использования. Это помогает обеспечить что есть не накопление остаточных perfusate, которые могут привести к засорение трубки и канюли. Схемы компонентов и труб следует осмотр регулярно и заменить при необходимости перед каждым использованием убедитесь, что нет загрязнения или ограничение потока.
Ограничения
Ограничение этой небольшой животных NEVLP модели является, что она не включает в настоящее время трансплантации после перфузии. Поэтому невозможно оценивать функцию печени трансплантата после пересадки. Это является важной областью для будущих исследований. Кроме того используя контуре мелких животных требует знаний и навыков.
Значение в отношении существующих моделей
Свинину и мышиных (Крыса) модели гипотермического, subnormothermic и нормотермических ex vivo печени перфузии были описаны в литературе. Хотя споры по-прежнему существует относительно температуры перфузии, было показано, что машина перфузии может улучшить функцию печени графтов независимо от температуры9. NEVLP модель, представленная здесь простой, легко воспроизводимые, низкая стоимость и имеет широкий спектр применения. Эта модель не включает диализа или пульсирующего поток печеночной артерии, которые включены в некоторых других моделях, как они показали быть ненужных9,13. Кроме того, результаты первого испытания на человеке, с помощью NEVLP показали, чтобы быть эффективным методом сохранения печени это — таким образом, эта модель идеально подходит для тестирования будущих приложений ex vivo печени перфузии10.
Будущие приложения
В литературе был выдвинут целый ряд будущих приложений для NEVLP. Каждый из них нужно будет испытываться методично в животных моделях до тестирования отбрасываются органов человека и затем в человеческой печени. Модель, представленная здесь идеально подходит для тестирования этих Роман будущих приложений, как это легко воспроизводимые, устраняет лишние шаги и низкой стоимости. Один из наиболее важных потенциальных применений этой модели продемонстрировали здесь - тестирование новых фармакологических perfusate добавок. Другие предлагаемые приложения включают ремонт поврежденных органов, обезжиривания печени позволяют трансплантации steatotic органов, введение сопротивление вирусный гепатит С, мезенхимальных стволовых клеток, генной модификации и перфузии с Иммунодепрессанты агентов11,,3132,33,34,35,36,37,38.
Выводы
В заключение мы продемонстрировали недорогой, легко воспроизводимые NEVLP модель, с помощью крыс. Использование этой модели требует тщательной подготовки, практики и знаний, но может осуществляться при низких затратах. Применение этой модели может включать тестирование Роман perfusate добавки, как было показано в результатах представитель. Дополнительные применения этой модели может включать тестирования программного обеспечения, предназначенного для оценки орган, различные перфузатов и искусственные или на основе гемоглобина кислородом перевозчиков и агентов, предназначенных для восстановления органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы сообщают, что у них нет соответствующей информации.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана низ T32AI 106704-01A1 и т. показатель удобочитаемости Flesch фонд для трансплантации, перфузии, инженерные и регенерации в университете штата Огайо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
