Summary
والهدف العام لأسلوب التنميط polysome تحليل النشاط متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو مرناس الترنسكربيتوم خلال تخليق البروتين. الأسلوب مهم لدراسات البروتين التوليف تنظيم وتفعيل الترجمة والقمع في الصحة والأمراض البشرية المتعددة.
Abstract
تعبير البروتين المناسبة في الوقت المناسب وفي المبالغ الصحيحة التي هي أساس وظيفة الخلية الطبيعية والبقاء على قيد الحياة في بيئة سريعة التغير. لفترة طويلة، يهيمن عليها البحوث على المستوى النسخي دراسات التعبير الجيني. ومع ذلك، مستويات مستقرة مرناس ترتبط أيضا بإنتاج البروتين، وطواعية مرناس يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للظروف. في بعض الكائنات، مثل طفيلي الليشمانيا، ينظم التعبير البروتين معظمها على مستوى متعدية الجنسيات. أظهرت الدراسات الأخيرة أن التقلبات ترجمة البروتين يرتبط بالسرطان، والايض والأعصاب وغيرها من الأمراض البشرية. Polysome التنميط وسيلة قوية لدراسة تنظيم ترجمة البروتين. أنها تسمح لقياس حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو دراسة الترجمة على نطاق الجينوم. أساس هذا الأسلوب هو فصل polysomes وريبوسوم، والوحدات الفرعية ومرناس الحرة أثناء الطرد المركزي من هيولى من خلال تدرج سكروز. نقدم هنا، بوليسومي عالمي تنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة--طفيل ليشمانيا كبيرة، استزراع الخلايا البشرية والأنسجة الحيوانية. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة، بينما يمثل الخصية الماوس عينة أنسجة حيوانية. وهكذا، التقنية تتكيف مع كل مصدر من هذه المصادر. ويتضمن البروتوكول المتعلق بتحليل الكسور بوليسومال الكشف عن مستويات مرناً الفردية التي RT-قبكر، البروتينات لطخة غربية والتحليل للكشف الريباسي بالتفريد. الأسلوب يمكن تمديد دراسة رابطة مرناس مع الريبوسوم على مستوى الترنسكربيتوم بتسلسل الحمض النووي الريبي العميق وتحليل البروتينات المرتبطة الريبوسوم بالتحليل الطيفي الشامل للكسور. الأسلوب يمكن تعديلها بسهولة للنماذج البيولوجية الأخرى.
Introduction
ويسيطر تنظيم التعبير الجيني في الخلايا آليات النسخي وبوسترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال. السلف في تسلسل الحمض النووي الريبي عميقة تسمح دراسة مستويات مرناً مستقرة على نطاق الجينوم بمستوى لم يسبق له مثيل. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن مستوى مرناً حالة ثابتة لا يرتبط دائماً بإنتاج البروتين1،2. مصير نسخة فردية معقدة جداً ويعتمد على عوامل كثيرة مثل المحفزات الداخلية والخارجية، والإجهاد، إلخ. تنظيم التعبير الجيني خلال تخليق البروتين يوفر طبقة أخرى من التعبير التحكم اللازمة لاستجابة سريعة في الظروف المتغيرة. بوليسومي (أو "بوليريبوسومي") التنميط، والانفصال، والتصور بنشاط ترجمة ريبوسوم، وسيلة قوية لدراسة تنظيم تخليق البروتين. وعلى الرغم من تطبيقاته التجريبية الأولى ظهرت في الستينات3، polysome التنميط حاليا واحدة من التقنيات الأكثر أهمية في البروتين ترجمة الدراسات4. يمكن ترجمة مرناس واحدة من الريبوسوم واحد أو أكثر مما يؤدي إلى تشكيل بوليسومي. يمكن أن توقف المحاضر في ريبوسوم مع سيكلوهيكسيميدي5 ويمكن فصل مرناس التي تحتوي على أرقام مختلفة من بوليسوميس عملية تجزئة بوليسومي بواسطة السكروز تنبيذ فائق التدرج6،7 , 8 , 9-يسمح تحليل الحمض النووي الريبي للكسور بوليسومال ثم قياس التغيرات في الدول المتعدية في مرناس الفردية على نطاق الجينوم، وخلال مختلف الظروف الفسيولوجية4،7، 10-الأسلوب قد استخدمت أيضا لتكشف عن أدوار 5 'UTR و 3' UTR تسلسل في السيطرة على مرناً طواعية11، ودراسة دور ميرناس في القمع متعدية12، كشف العيوب في الريبوسوم نشوء حيوي13 ، وفهم دور البروتينات المرتبطة الريبوسوم مع الأمراض التي تصيب الإنسان14،15. خلال العقد الماضي، برز دور متنام لتنظيم التعبير الجيني أثناء الترجمة أن يوضح أهميتها في الأمراض التي تصيب الإنسان. دليل مراقبة متعدية الجنسيات في السرطان، الأيضية وأمراض الأعصاب هو الساحقة15،16،،من1718. على سبيل المثال، يسهم في التقلبات eIF4E-تعتمد على مراقبة متعدية الجنسيات ذات الصلة بالتوحد في العجز15 وفمرب وتشارك في المماطلة من ريبوسوم في مرناس مرتبطة بالتوحد14. وهكذا، التنميط بوليسومال أداة هامة جداً لدراسة العيوب في التنظيم متعدية الجنسيات في العديد من الأمراض البشرية.
تحليل البروتين الكسور بوليسومال تحت ظروف فسيولوجية مختلفة يشرح وظيفة العوامل المرتبطة ريبوسوم أثناء الترجمة. وقد استخدمت تقنية polysome التنميط في العديد من الأنواع بما في ذلك الخميرة وخلايا الثدييات والنباتات والبروتوزوا10،19،،من2021. معرض الطفيليات الأوالي مثل المثقبيات و ليشمانيا التحكم النسخي محدودة للتعبير الجيني. وتنظم على الجينوم في مجموعات الجينات بوليسيسترونيك التي تفتقر إلى النسخ ينظم مروج22. بدلاً من ذلك، التعبير الجيني إنمائية يتم التحكم في الغالب على مستوى الترجمة البروتين والاستقرار مرناً في مثقبيات الأنواع23،24. ولذلك، فهم التحكم متعدية الجنسيات في غياب تنظيم النسخي أهمية خاصة بالنسبة لهذه الكائنات. التنميط بوليسومال أداة قوية لدراسة بوسترانسكريبشونال تنظيم التعبير الجيني في ليشمانيا25،26،،من2728.
التقدم الذي أحرز مؤخرا في الكشف عن المستويات الفردية مرناس ريال مرة PCR الكمي (RT-qPCR) وكامل الترنسكربيتوم بتسلسل الجيل القادم، فضلا عن التكنولوجيات البروتيوميات، يجلب القرار ومزايا التنميط بوليسومال إلى مستوى جديد. استخدام هذه الأساليب يمكن تمديد بتحليل للكسور بوليسومال الفردية بتسلسل الحمض النووي الريبي العميقة جنبا إلى جنب مع تحليل البروتين لرصد حالة متعدية الجنسيات من الخلايا في نطاق الجينوم. وهذا ما يسمح تحديد اللاعبين جزيئية جديدة تنظم الترجمة تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. نقدم هنا، بوليسومي عالمي التنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة: طفيل ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية، والأنسجة الحيوانية. نقدم المشورة في إعداد ليساتيس الخلية من الكائنات المختلفة، والاستفادة المثلى شروط التدرج واختيار مثبطات رناسي وتطبيق قبكر RT ولطخة غربية والتفريد الحمض النووي الريبي لتحليل الكسور بوليسومي في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع علاجات الحيوانات والتعامل مع الأنسجة التي تم الحصول عليها في الدراسة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز العلوم تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة وفقا للمعاهد الوطنية لرعاية الحيوان المؤسسية الإرشادات الصحية رعاية الحيوان، رقم بروتوكول 96005. الرجاء التضحية الحيوانات الفقارية وتعد الأنسجة وفقا للمبادئ التوجيهية من رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. في حالة عدم وجود مثل هذه لجنة، يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للرفق بالحيوان "المعاهد الوطنية للصحة". الكبار (> 60 يوم من العمر) واستخدمت الفئران C57BL/6. وتم الحصول على جميع الحيوانات والأنسجة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز العلوم تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة وفقا للمبادئ التوجيهية للرفق بالحيوان "المعاهد الوطنية للصحة" ورعاية الحيوان المؤسسية. للقتل الرحيم، وضعت ماوس واحدة في غرفة صغيرة، وتم تشريد الهواء تدريجيا مع حوالي 30% ثاني أكسيد الكربون لتخدير والتقليل من كرب الحيوان. في أعقاب توقف التنفس، استخدمنا التفكك عنق الرحم لتأكيد وفاة الحيوان قبل الحصاد الأنسجة.
تنبيه: جميع مع الخلايا البشرية مثقف ويعيش ليشمانيا العمل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء في BSL-2 شهادة المختبر.
1-إعداد ليساتيس هيولى من ليشمانيا كبيرة ، استزراع الخلايا البشرية والأنسجة الماوس
ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات في الأعمال التحضيرية ليساتي من مواد مختلفة المصدر. خطوات أخرى بما في ذلك إعداد التدرج السكروز وتجزئة بوليسومال متطابقة ولا تعتمد على مصدر العينة.
-
ليشمانيا كبيرة إعداد ليستي هيولى
- تلقيح خلايا ليشمانيا كبيرة (سلالة FV1) في 30 مل من متوسطة 1 x M19929 الذي يحتوي على خليط 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين (وحدات 100 و 100 ميكروغرام/مل في المقابل)في كثافة 1 × 105 خلايا/مل .
ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات التي تنطوي على خلايا ليشمانيا كبيرة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. - وضع الخلايا في الحاضنة وتنمو لهم في 27 درجة مئوية حتى المرحلة لوغاريتمي (منتصف سجل يطابق 5 × 106 خلايا/مل). عادة ما يستغرق يومين تنمو.
- إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى ثقافة ليشمانيا كبيرة لتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل للقبض على ريبوسوم في مرناس المترجمة. وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 10 دقائق عند 27 درجة مئوية.
- بعد الانتهاء من العلاج سيكلوهيكسيميدي، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور لهم في 1,800 س ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 8 تجاهل المادة طافية.
- تغسل الخلايا مع 30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). الطرد المركزي في 1,800 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
- تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل دببس.
- تأخذ قاسمة للخلايا ومزجها مع 3.5% فورمالدهايد الحل.
- حساب عدد الخلايا التي هيموسيتوميتير وتحديد تركيزها. تحويل العدد المطلوب من الخلايا إلى [ميكروفوج] أنابيب. أعدت من 0.5x108-2 × 108 خلايا/مل غير كافية لتحميل واحد السكروز التدرج.
- وتدور الخلايا في 1,800 س ز 4 درجة مئوية للحد الأدنى 8 تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية على الجليد في 1 مل من تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على مثبطات البروتياز ومثبط رناسي (20 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.4، 100 ملم بوكل، 10 مم مجكل2, 2 مم DTT، 1% NP-40، 1 x حوزتي المانع كوكتيل (يدتا الحرة)، المانع رناسي 200 وحدة/مل).
- يمر إبرة 23-قياس ثلاث مرات. ينبغي أن تصبح شفافة بعد المرور عبر الإبرة.
- أجهزة الطرد المركزي في 11,200 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتوضيح ليستي. نقل توضيح إلى جديدة أنبوب وإبقائه على الجليد حتى السكروز تنبيذ فائق التدرج.
- جمع 400-500 ميكروليتر من ليساتي كمدخل (تحليلها في وقت لاحق)، تجميد من الحق بعيداً في النتروجين السائل لتحليل البروتين مستقبلا أو إضافة كاشف تنقية الحمض النووي الريبي قبل تجميد لتحليل الحمض النووي الريبي.
- تلقيح خلايا ليشمانيا كبيرة (سلالة FV1) في 30 مل من متوسطة 1 x M19929 الذي يحتوي على خليط 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين (وحدات 100 و 100 ميكروغرام/مل في المقابل)في كثافة 1 × 105 خلايا/مل .
-
إعداد ليساتي هيولى من استزراع الخلايا البشرية هيلا
- تقسيم خلايا هيلا والبذور منها إلى 20 مل المتوسطة دميم المحتوية على خليط 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين (وحدات 100 و 100 ميكروغرام/مل في المقابل) مع خلية العد 2 × 105 خلايا/مل في صفيحة 15 سم.
- تنمو خلايا هيلا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاء 20-24 إجراء بلازميد الدنا تعداء وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- نشر خلايا ح 24 بعد تعداء على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى خلايا هيلا نمت إلى تركيز 100 ميكروغرام/مل لاعتقال ريبوسوم في مرناس المترجمة واحتضان خلايا لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2النهائي. نضح المتوسطة. تغسل الخلايا مرتين مع دببس الباردة على الجليد.
- إضافة 500 ميكروليتر من تحلل المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 20 مم كوه حبيس 7.4، 100 ملم بوكل، 5 مم مجكل2، 1 مم DTT، 0.5% NP-40، 1 x حوزتي المانع كوكتيل (يدتا خالية)، 200 وحدة/مل رناسي الهيبارين المانع أو 1 مغ/مل) اللوحة وكشط الخلايا على الجليد.
- نقل الخلايا ليسيد إلى [ميكروفوج] أنابيب. ضبط تركيز NP-40 إلى 0.5% و مجكل2 إلى 5 ملم وفقا للزيادة في حجم العينة.
- يمر إبرة 23-قياس 3-6 مرات.
- تدور في 11,200 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لتوضيح ليستي. بعد الطرد المركزي، بنقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. استخدام جهاز المطياف الضوئي تقييم كفاءة تحلل الخلية وتحديد حجم العينة للتحميل على التدرج. إضافة 10 ميكروليتر من عينة إلى 0.5 مل من 0.1% الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي). فارغة ضد الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%. قياس امتصاص في 260 نيوتن متر. القيمة المتوقعة امتصاص حوالي 15-20 وحدة/مل.
- تمييع جميع العينات مع تحلل المخزن المؤقت إلى نفس القيمة امتصاص قبل السكروز التدرج الطرد المركزي. الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى السكروز التدرج الطرد المركزي.
-
إعداد ليساتي هيولى من الخصية الماوس
- تشريح الخصية الماوس. إجراء شق صغير في الباجينا الغلالة وجمع الخصي الخصيتين وتحويلها في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل دببس تكملة مع فلوريد فينيلميثيلسولفونيل مم 0.1 (بمسف).
- مزج الأنسجة بقوة بعكس عدة مرات. تسمح الأنسجة لتستقر عند وحدة الجاذبية على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إزالة وتجاهل غائم المخزن المؤقت الذي يحتوي على خلايا الضام والأنسجة الشظايا. كرر الإجراء 2-3 مرات أكثر. بيليه الأبيض المتبقي هو إثراء للخصي والخلايا الجرثومية.
- نقل بيليه أنبوب سيمينيفيروس إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل وتدور في 500 غرام x للحد الأدنى 1 تجاهل المادة طافية.
- إضافة 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 100 ملم بوكل، 5 مم مجكل2، 1 مم DTT، 0.5% NP-40، 1 x حوزتي المانع كوكتيل (يدتا الحرة)، الهيبارين 1 ملغ/مل أو 200 وحدة/مل من مثبط رناسي) للأنابيب. استخدام ماصة إلى تريتوراتي الأنسجة.
- نقل التعليق صغير (0.5-1.0 مل) الخالطون دونس. تعطيل الأنسجة مع السكتات الدماغية سبعة إلى ثمانية من مدقة الزجاج.
- نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
- الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز و 4 درجات مئوية عن 8 دقيقة لمسح في ليساتي. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد ومخزن على الجليد حتى التحميل على التدرج السكروز.
- جمع 50 ميكروليتر من ليساتي كنموذج الإدخال، وتجميد من الحق بعيداً في-80 درجة مئوية لتحليل البروتين مستقبلا؛ أو إضافة كاشف تنقية الحمض النووي الريبي قبل تجميد لتحليل الحمض النووي الريبي.
2-السكروز إعداد التدرج وتنبيذ فائق
- إعداد الحلول التدرج هما السكروز (20 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.4، 100 ملم بوكل، 10 مم مجكل2، 1 مم DTT، مثبط البروتياز x 1 كوكتيل)، الذي يحتوي على السكروز 10% أو السكروز 50%. (يمكن استخدام تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، بدلاً من حبيس). إضافة 200 وحدة/مل الهيبارين المانع أو 1 مغ/مل رناسي وفقا للتصميم التجريبي. وضع أنبوب ultracentrifuge للدوار SW 41 إلى كتلة ماركر ورسم الخط على طول الطابق العلوي من الكتلة. نقل الأنبوب إلى رف مستقرة.
- تأخذ حقنه 10 مل مع طبقات الجهاز يعلق وملء المحاقن مع محلول السكروز 10% (أعدت كما ذكر أعلاه). بلطف الإصدار في الجزء السفلي من أنبوب أولتراسينتريفوجي حتى تصل إلى العلامة في الأنبوب.
- تعبئة آخر حقنه بمحلول السكروز 50% وإدراج الجهاز الخاص به طبقات من خلال طبقة السكروز 10% على الجزء السفلي من الأنبوب بعناية. الإفراج عن محلول السكروز بدءاً من القاع حتى تصل إلى علامة على الأنبوب بلطف. إغلاق الأنبوب مع غطاء المقدمة.
- إعداد التدرج السكروز، قم بتشغيل الجهاز صانع التدرج على. مستوى استخدام لأعلى أو لأسفل أزرار اللوحة واضغط حرر. التسوية أمر مهم للخطى للتدرج.
- بعد الاستواء اللوحة اضغط غراد لفتح قائمة التدرج. انتقل إلى قائمة التدرج من القائمة وحدد الدوار SW 41 منظمة الشفافية الدولية. ثم اختر التدرج السكروز المرجوة من قائمة القائمة باستخدام الأزرار أعلى واسفل . اضغط على استخدامها.
- مكان صاحب أنبوب التدرج في لوحة التدرج صانع. نقل الأنبوبة في الحامل. يمكن إعداد تصل إلى 6 التدرجات في نفس الوقت. اضغط على الزر تشغيل. صانع التدرج تدور هذه الأنابيب في السرعة المبرمجة وزوايا تشكيل تدرج خطي. وسوف يستغرق سوى بضع دقائق لإعداد التدرج.
- عند اكتمال العملية، وضع الأنابيب في رف. خلع القبعات. إزالة وحدة التخزين نفسها كحجم العينة من الجزء العلوي من أنابيب أولتراسينتريفوجي.
- تحميل 400-500 ميكروليتر ليستي التي تحتوي على 15-20260 وحدات من بوليسوميس على الأعلى بعناية. ضع الأنابيب في دلاء الدوار والتوازن لهم.
- الطرد المركزي في س 260,000 ز و 4 درجة مئوية عن ح 2 استخدام SW 41 دوار.
3-بوليسومي تجزئة وجمع العينات
ملاحظة: بينما الاستعدادات ليستي بعض الاختلافات تبعاً للمصدر، إعداد التدرج بروتوكولي تجزئة polysome هي نفسها بالنسبة لجميع أنواع ليساتيس.
- بعد الانتهاء من تنبيذ فائق، ضع دلاء الدوار مع الأنابيب على الجليد. دورة جامع الكسر والتدرج فراكتيوناتور على. انقر فوق مسح القائمة فراكتيوناتور. وضع رف مع 24 مجموعة أنابيب في جامع الكسر.
- ملء خزان شطف على جانب فراكتيوناتور بالمياه. اضغط على مفتاح الشطف 10 s شطف المضخة في فراكتيوناتور. إرفاق محول شطف مع حقنه مليئة بالمياه إلى المكبس للمعايرة.
- افتح برنامج فراكتيوناتور على الكمبيوتر. الصحافة معايرة. استخدام الإعدادات الافتراضية ، ثم اضغط على موافق. تكون على استعداد لضخ المياه من المحاقن.
- اضغط موافق للقيام بالمعايرة. البدء فورا في حقن الماء لل 5 القادمة s. خلال هذا الوقت، سوف تتدفق المياه من خلال خلية تدفق للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية وسوف تكون محسوبة في الصك. إتمام المعايرة الصفر سوف تظهر العلامة. الصك جاهز لتجزئة.
- قم بإزالة محول شطف مع المحاقن. إرفاق تلميح إلى المكبس فراكتيوناتور.
- فتح النحاس الجوية الصحافة وصمام الهواء مفتاح 10 s للأنابيب الجافة وتدفق الخلية. إغلاق صمام الهواء.
- بلطف إزالة أنبوب التدرج من دلو الدوار ووضعه في الرف. تطبيق غطاء حامل أنبوب في الجزء العلوي من الأنبوب بعناية تحريك الأنبوبة في حامل الأنابيب وقفله في الموقف.
- مكان صاحب تحت المكبس فراكتيوناتور. وغالباً ما يمكن رؤية العصابات بوليسومال بالعين المجردة. إدخال الإعدادات المطلوبة لكسر الأرقام وحجم (24 الكسور في 500 ميكروليتر/الكسر تكفي عادة). اسم الملف شكل مناسب. اضغط "موافق"، ومن ثم زر الذهاب إلى الرسم البياني . في الإطار التالي، اضغط بدء المسح الضوئي. وسوف تظهر الإعدادات، اضغط موافق. جامع سينتقل من البالوعة للكسر الأول وسيتم نقل المكبس في الأنبوب. عندما يصل المكبس إلى الأعلى من التدرج أنه سيتباطأ إلى السرعة المحددة وسيتم جمع الكسور. عند الانتهاء، يتحرك المكبس من الأنبوب التدرج.
- فتح النحاس الجوية الصحافة وصمام الهواء المفتاح على فراكتيوناتور لاسترداد جزء آخر.
- نقل الأنابيب من الرف على الجليد.
- إضافة 2 وحدات من الجيش الملكي النيبالي تنقية كاشف لكل جزء وفلاش تجميد في النتروجين السائل حتى تنقية الحمض النووي الريبي. وبدلاً من ذلك، إذا كان البروتين يحتاج إلى تحليل، إضافة حمض التريكلوروسيتيك بتركيز نهائي 10% للتركيز عليها لغربي النشاف (انظر القسم 8).
4-إعداد "رنا الاصطناعية" في المختبر لتطبيع مرناس "المستويات أثناء تحليل البيانات" RT-قبكر
ملاحظة: يتم استخدام مرناً أومبا كولاي في هذا البروتوكول للتطبيع. أي رنا الأخرى ليس لديها هوية واسعة النطاق مع مرناس في الحي درس (الثدييات أو ليشمانيا) يمكن استخدامها.
- إعداد الجزء "أومبا الحمض النووي" تحتوي على تسلسل المروج SP6 بفعل PCR قياسية من بلازميد يحتوي على الجينات أومبا30.
- إعداد 100 ميليلتر من الخليط: 80 مم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 16 مم مجكل2, 2 مم سبيرمدين، 10 مم DTT، 3 مم ATP، 3 مم CTP، 3 مم UTP، 3 مم غتب، مثبط رناسي U/ميكروليتر 0.5، 1 ميكروغرام من "أومبا بكر الحمض النووي"، 3 ميكروليتر SP6 رنا بوليميراز ، 0.005 يو/ميكروليتر بيروفوسفاتاسي.
- احتضان عند 40 درجة مئوية ح 2.
- تنقية الحمض النووي الريبي بمجموعة مواد تنقية الحمض النووي الريبي.
- قياس تركيز بجهاز المطياف الضوئي وينظر في [اغروس] هلام التفريد.
5-الجيش الملكي النيبالي "في معزل" عن "الكسور التدرج" وكدنا إعداد
ملاحظة: انتقل مباشرة مع هذا البروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي إذا استخدمت مثبطات رناسي كمثبط ريبونوكليسي. ومع ذلك، عندما تستخدم كمثبط ريبونوكليسي، سوف تمنع الهيبارين المنتسخة العكسية المستخدمة في إعداد كدنا. ولذلك، سيلزم تنقية إضافية من الحمض النووي الريبي إذا استعمل الهيبارين في المخزن المؤقت لتحلل والتدرج. انظر القسم 6 إعداد الجيش الملكي النيبالي لتوليف كدنا إذا استعمل الهيبارين.
- ذوبان الجليد العينات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي تنقية الكاشف، إضافة 20 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الاصطناعية كالمراقبة الداخلية للتطبيع لنتائج RT-قبكر. المضي قدما في إعداد الجيش النيبالي الملكي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة باستثناء تعديل واحد. أضف 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الصف الجليكوجين (20 ميكروغرام) ترسيب الايزوبروبانول السابقة. حل الكريات الجيش الملكي النيبالي في 20-25 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
ملاحظة: الجليكوجين بمثابة ناقل ويساعد على تجنب الخسائر وتصور بيليه الجيش الملكي النيبالي خلال تنقية. يتم استخدام أومبا مرناً لمزيد من التطبيع في الرايت qPCR ردود فعل. - قياس تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي لضمان عائد كاف. الجمع بين كميات متساوية من الحمض النووي الريبي الكسور التي تحتوي على 60S، 40S ومونوسوميس بريبوليسوميس. الجمع بين الكسور التي تحتوي على 2-4 ريبوسوم ك polysomes الخفيفة والكسور مع ريبوسوم 5-8 الجمع ك polysomes الثقيلة.
- استخدم 5-10 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي من الكسور مجتمعة لإعداد كدناس باستخدام مجموعة أدوات واتباع توصيات الشركة المصنعة.
- إضافة ميليلتر 80 من المياه مجاناً نوكلاس إلى 20 ميليلتر من كدنا. تجميد عينات كدنا في-20 درجة مئوية.
6-الجيش الملكي النيبالي التنقية من تلوث الهيبارين
ملاحظة: يمنع الهيبارين الحمض النووي تجهيز الإنزيمات مثل المنتسخة العكسية. ولذلك، استخدام هذا البروتوكول تنقية إضافية عندما يتم استخدام الهيبارين في المخزن المؤقت لتحلل و/أو في التدرج.
- إضافة ليكل إلى تركيز نهائي 1 م لعينات الحمض النووي الريبي المنقي.
- خلط العينات واحتضان على الجليد ح 1.
- وتدور هذه العينات في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إزالة المادة طافية كاملا بقدر الإمكان باستخدام ماصة.
- أيردري الكريات لمدة حوالي 5 دقائق.
- إعادة تعليق الكريات في حجم المياه خالية من رناسي الأولى.
- إجراء القياس سبيكتروفوتوميتريك في 260 نيوتن متر لتحديد تركيز الجيش الملكي النيبالي. عادة، إلى فقدان العينة الحد الأدنى.
7--الرايت قبكر وتحليل البيانات لتوزيع مرناً
- الجمع بين 10.2 ميكروليتر المياه، 20 ميكروليتر من "الأخضر سيبر"، ميكروليتر 4.8 من الجينات محددة الإشعال (2.5 ميكرومتر في كل مجموعة)، 5 ميكروليتر من كدنا ومزيج جيد وتحميل 10 ميكروليتر الواحدة وكذلك في تريبليكاتيس في لوحة 384-جيدا.
- تغطية صفيحة مع فيلم لاصق محكم والطرد المركزي لوحة في س 1,800 ز لمدة 5 دقائق.
- باستخدام أداة PCR الوقت الحقيقي إعداد رد فعل qPCR تحت الشروط المبينة في الجدول 1.
- استخدام عتبة دورة (جر) القيم و الأسلوب جر (ΔΔCر) مقارنة31 حساب النسبة المئوية (%) للتوزيع مرناً في بريبوليسوميس والخفيفة والثقيلة بوليسوميس ك وصف32 مع تعديل واحد. استخدام الاصطناعية الحمض النووي الريبي (أومبا هنا) لتطبيع البيانات في تحليل البيانات RT-قبكر. الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية يوفر عنصر تحكم تطبيع الذي يسمح لحساب مستويات مرناس النسبي ومقارنتها بكسور مختلفة من التدرج.
8-تحليل البروتينات في الكسور بوليسومال من النشاف الغربية
- من أصل 100% (w/v)، إضافة حمض التريكلوروسيتيك (TCA) للكسور مختارة (500 ميكروليتر) بتركيز نهائي 10%، الحفاظ على الجليد لمالا يقل عن 15 دقيقة، أجهزة الطرد المركزي في [ميكروفوج] لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية ويغسل مرتين مع الأسيتون المثلج وتذوب في 25 ميكروليتر من S س-صفحة نموذج تحميل المخزن المؤقت للتفريد.
- تحميل في الحزب الديمقراطي الصربي الصفحة وإجراء التفريد القياسية مع نقل التالي للغشاء PVDF. انتقل إلى غرب النشاف33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، يصف لنا تطبيق أسلوب التنميط بوليسومال إلى ثلاثة مصادر مختلفة: الطفيلية ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية والخصية الماوس. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في وسائل الإعلام السائلة في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة على لوحات والخصية الماوس تمثل عينة أنسجة. الأسلوب يمكن تعديلها بسهولة لأنواع أخرى من الخلايا المزروعة بحرية في التعليق، وأنواع مختلفة من الأنسجة، أو من كائن آخر، وأنواع مختلفة من الخلايا المستزرعة. النهج الذي يتكون من أربع خطوات رئيسية: إعداد ليستي وإعداد التدرج السكروز والخطوة تنبيذ فائق، تجزئة بوليسومي وجمع العينات التي تليها تحليل للكسور. جمع الخلايا من مصادر مختلفة، وغسلها وتفكيك في المخزن المؤقت لتحلل بالمرور من خلال إبرة أو الخالطون دونس. يتم استخدام الطرد المركزي لإزالة الحطام خلية، توضيح. ويبين الشكل 1Aمخطط تجزئة التدرج. تدرج مستمر سكروز يتكون من الخلط بين 10% و 50% من حلول السكروز في صانع تدرج. يتم تحميل أعلى التدرج. تنبيذ فائق يفصل مرناس المرتبطة بعدد مختلف من ريبوسوم التي ترصدها كاشف الأشعة فوق البنفسجية خلال تجزئة، تشكيل طيف امتصاص متميزة. الكسور التي يتم جمعها تستخدم لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتين (الشكل 1B). يمكن تحليل الحمض النووي الريبي بالتفريد تليها شمال وصمة عار أو المستخدمة لإنتاج كدنا متبوعاً بفعل RT-qPCR لتحليل رابطة مرناس الفردية مع بوليسوميس. يمكن استخدام تسلسل الجيل القادم لتحليل حالة مرناس على نطاق الجينوم7متعدية الجنسيات. لتحليل البروتين الكسور بوليسومال، هي عجلت البروتينات مع حمض التريكلوروسيتيك للتركيز عليها. ثم يتم تحليل البروتينات بالغربية النشاف أو بواسطة التحليل الطيفي الشامل على مستوى البروتين.
يبين الشكل 2 ألفملف تعريف بوليسومال نموذجية التي تم إنشاؤها من ليشمانيا كبيرة تنمو بنشاط الثقافة. الرسم البياني لتجزئة امتصاص قد شكل متميزة مع قمم نموذجي الريبوسوم مفارز (40S و 60S)، واحد ريبوسوم (80S أو مونوسوميس) وبوليسوميس.
الكمية RT-PCR (RT-qPCR) استخدمت للكشف عن الرابطة لفرادى ليشمانيا مرناس ريبوسوم وبوليسوميس. الأسلوب31 جر (ΔΔCر) مقارنة نهج بسيطة وملائمة لدراسة مستويات مرناس النسبي في الخلايا. يتطلب هذا الأسلوب رقابة داخلية (مستقرة مرناً، يتغير التعبير أثناء العلاج أو ظروف التجربة) لإجراء العمليات الحسابية. ومع ذلك، هناك لا الرقابة الداخلية في الكسور بوليسومال لأنه سوف تختلف مستويات أي مرناً أو الحمض النووي الريبي الريباسي في الكسور، تبعاً لارتباطها ريبوسوم، بوليسوميس، إلخ. لحل مشكلة رقابة داخلية، وقد استخدمنا مرناً أومبا البكتيرية الاصطناعية لتطبيع ليشمانيا مرناً المستويات الفردية النسبية في الكسور. وكان المركب في المختبر مرناً أومبا وتضاف بكميات متساوية لكل جزء قبل استخراج الحمض النووي الريبي. إضافة للجيش الملكي النيبالي الاصطناعية مهم لأنه يجعل حسابات البيانات RT qPCR أدق، كالمراقبة الداخلية للحسابات بالنسبية (ΔΔCتي) جر الأسلوب.
كانت مختلطة مختبرين للكسور التدرج إلى ثلاث مجموعات: بريبوليسوميس (مفارز ومونوسوميس)، الخفيفة polysomes (تتألف من ريبوسوم 2-4)، و polysomes الثقيلة (تتألف من ريبوسوم 5-8). وأجرى RT-قبكر في الجيش الملكي النيبالي من الكسور مجتمعة لتحليل التوزيع مرناً بين هذه الكسور مجتمعة (الشكل 2). واستخدمت كعنصر تحكم 18S ribosomal RNA. مستويات النسبية يحددها RT qPCR ارتباطاً جيدا مع التوزيع التقديري للوحدات الفرعية الصغيرة ريبوسومال (وحدة فرعية مجاناً، كجزء من مونوسوميس وبوليسوميس، و) في الطيف. تحليل RT qPCR كشفت أن مرناس الفردية اختبار درجة مختلفة من المشاركة في الترجمة خلال مرحلة النمو ليشمانيا لوغاريتمي. ويرتبط مرناً tubulin تفضيلي مع polysomes الثقيلة، مما يشير إلى كفاءة الترجمة. وفي المقابل، تم العثور على مرناً شيرب أساسا مع بريبوليسوميس والخفيفة polysomes دعم الترجمة أقل نشاطا بالمقارنة مع tubulin مرناً.
التعبير عن المؤتلف البروتينات في الخلايا المستزرعة نهجاً هاما في فئات متنوعة من الدراسات تجريبية. هنا، نحن نقدم مثالاً للتنميط بوليسومال من مرناس البروتين المؤتلف في مصدر آخر عينة، الخلايا البشرية المزروعة. تم transfected خلايا هيلا عابر مع والبلازميدات معربا عن المؤتلف التليف الكيسي transmembrane الموصلية منظم (CFTR)34 أو Norrie الأمراض البروتين (الحزب الوطني). طيف امتصاص لوجود بوليسومي من هذه الثقافات المستقلة اثنين من قمم متميزة جداً مماثلة والوارد المطابق مفارز ريبوسومال (40S و 60S)، مونوسوميس (80S)، وبوليسوميس (الشكل 3A). ويوضح التشابه في الأطياف من هذه التجارب إمكانية تكرار نتائج وجود التدرج. مثل في الدراسات ليشمانيا ، توزيع مرناس تحددها RT-قبكر في الكسور تمثل بريبوليسوميس، بوليسوميس الخفيفة والثقيلة polysomes (الشكل 3B). الكشف عن الحمض النووي الريبي فرعية صغيرة ريبوسومال 18S يرتبط بتوزيعها المقدرة في الأطياف. مرناس الحزب الوطني كانت في معظمها مرتبطة بكسور بوليسومال الخفيفة والثقيلة، بينما مرناس CFTR عثر على معظمها في الكسور بريبوليسومي، مما يوحي بأن الحزب الوطني هو ترجمة أكثر كفاءة. في حين أن الحزب الوطني بروتين صغير نسبيا، CFTR هو بروتين كبيرة جداً (مخلفات الأحماض الأمينية 1480) تتكون من العديد من المجالات، أن إضعاف بشكل مستقل أثناء الترجمة35. قد يعكس التعاقدات أقل من CFTR مرناً مع polysomes أبطأ الترجمة المطلوبة للطي كوترانسلاشونال في مجالات متميزة.
يمكن استخدام الكسور بوليسومي أيضا للكشف عن البروتينات. وقد أجرى الكشف عن البروتينات في كسور التدرج على سبيل المثال ريبوسومال البروتينات في خلايا هيلا (الشكل 4). وتركزت البروتينات بهطول الأمطار بنسبة 10% كلورفورم الميثيل من الكسور ولطخة غربية استخدمت للكشف عن البروتين ريبوسومال وحدة فرعية صغيرة RPS6 ووحدة فرعية كبيرة ريبوسومال البروتين RPL11 (الشكل 4، أعلى اللوحة). يرتبط توزيعها جيدا مع قمم متميزة على طيف امتصاص. هذه التجارب تثبت بوضوح أن الكسور بوليسومي يمكن استخدامها لتحليل البروتينات في نفوسهم.
واستخدمت العديد من السكروز مختلف التركيزات التدرجات (على سبيل المثال، 7-47%36, 5-50%7، 7-50%6 ، 10-50%37، 15-50%8، وغيرها) لوجود بوليسوميس. هنا، نحن مقارنة تدرجات بين 10 50 في المائة و 17-51% (الشكل 5). وعلى الرغم من 17-51% إلى نتائج مقبولة، الفصل في التدرج 10-50% كان عموما أفضل.
أنها موثقة جيدا أن وكلاء شيلاتينغ، مثل يدتا، تعطيل8،ريبوسوم و polysomes9. كما هو مبين في الشكل 6، يدتا معاملة هيلا قبل التحميل على التدرج يؤدي إلى اختفاء القمم، المقابلة مونوسوميس وبوليسوميس، وزيادة كبيرة في الوحدات الفرعية الريبوسوم إلى الذروة. هذه التجربة بمثابة عنصر تحكم، وأظهرت أن قمم لوحظت دون علاج يدتا ريبوسومال فعلا مونوسوميس وبوليسوميس.
يبين الشكل 7 النتائج وجود بوليسومي من الخصيتين الماوس. طيف امتصاص له أوجه التشابه مع تلك المأخوذة من خلايا ليشمانيا والحلة: قمم متميزة من مفارز ريبوسومال ومونوسوميس وبوليسوميس. الشكل، وتوزيع إنتاج مظهر توقيع، التي تجعل من السهل التعرف عليها على مختلف الأطياف بوليسومال. الكشف التام من تنقيته من الكسور وتم تحليل الكشف عن الكسور المحدد بالتفريد في [اغروس] هلام (الشكل 7، أعلى اللوحة). التفريد يبين التوزيع نموذجية للكشف الريباسي 18S و 28S. هذه العصابات حادة تشير إلى إينتاكتنيس العينات. الهلام قد تستعمل لكشف مرناس الفردية بوصمة عار شمال التالية أو يمكن استخدامه لتقييم نوعية العينات قبل تجارب أخرى في الجيش الملكي النيبالي أو البروتين التحليل-الكشف الريباسي تنتشر العصابات تشير إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي في العينات.
خلال دراساتنا، استخدمنا المانع رناسي والهيبارين كمثبطات رناسي في التدرجات ليساتيس والسكروز. بينما كل منهما تقدم نتائج مرضية، كان استخدام المانع رناسي المفضل لتحليل الحمض النووي الريبي نظراً لأنها لا تمنع كدنا وردود الفعل RT-قبكر. وهكذا، فإنه لا تتطلب الخطوات الإضافية من تنقية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا تقرر الباحثين استخدام الهيبارين أثناء إعداد بوليسومي، تكون على علم أن الهيبارين يحول دون تيار أسفل التطبيقات مثل RT-قبكر، وهناك حاجة إلى خطوة إضافية في تنقية الحمض النووي الريبي (انظر المادة 6 من البروتوكول).
الشكل 1 . التنميط polysome. (أ) نظام لإعداد التدرج، الشخصية تجزئة وامتصاص بوليسومي. (ب) نظام تحليل الكسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تحليل الشخصية بوليسومي ليشمانيا كبيرة الثقافة في مرحلة اللوغاريتمي للنمو. (أ) Cytoplasmic ليستي كان مجزأ في التدرج السكروز 10-50%. (ب) التوزيع النسبي للجيش الملكي النيبالي 18S، tubulin ومرناس شيرب (٪) في بريبوليسوميس، بوليسوميس الخفيفة والثقيلة من خلايا السجل تحليلها بواسطة RT-قبكر. الكسور التي تحتوي على 40S، تم دمج 60S ومونوسوميس بريبوليسوميس. تم الجمع بين الكسور مع ريبوسوم 2-4 ك polysomes الخفيفة، بينما شكلت الكسور مع ريبوسوم 5-8 بوليسوميس الثقيلة. الاصطناعية كولاي مرناً أومبا إضافة إلى استخراج الحمض النووي الريبي الكسور السابقة بمثابة عنصر تحكم تطبيع في الرايت qPCR. تم استخدام أسلوب31 جر (ΔΔCر) المقارن لحساب مستويات مرناً. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تجزئة بوليسومي وتحليل لرابطة مرناس CFTR والحزب المؤتلف مع ريبوسوم في خلايا هيلا transfected مع بلازميد المعينة. (أ) الشخصية بوليسومال في خلايا هيلا transfected مع البلازميدات CFTR والحزب الوطني. تم تطبيق التدرج السكروز 10%-50% لتحقيق الفصل بين بوليسوميس. يتم الإشارة إلى القمم للصغيرة (40S) ومفارز كبيرة (60S)، فضلا عن مونوسومي (80S). جنبا إلى جنب كما هو مبين على لوحة كسور والمستخدمة لمزيد من التحليل. (ب) توزيع مرناس CFTR والحزب الوطني في كسور مختلفة. كشف 18S ب RT qPCR كعنصر تحكم لتجزئة polysome. وتم تقييم مستويات الحمض النووي الريبي بتحليل RT-قبكر. تم تطبيع البيانات استخدام مرناً الاصطناعية. تم استخدام أسلوب31 جر (ΔΔCر) المقارن لحساب مستويات مرناً. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الكشف عن البروتينات ريبوسومال في هيلا الكسور بوليسومال. تعرض الخلية هيلا ليستي باستخدام الطرد المركزي التدرج السكروز 10%-50%. البروتينات في الكسور المحدد قد عجلت مع TCA وتحليلها من قبل التفريد في 12% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع بعد النشاف الغربية باستخدام الماوس RPS6 [مونوكلونل] وارنب [بولكلونل] RPL11 جسم كالأجسام المضادة الأولية و "الماعز بيروكسيداسيكونجوجاتيد" الأجسام المضادة الثانوية الماوس المضادة أو أرنب المضادة. تصور إشارات فعل الركيزة تشيميلومينيسسينت "سوبيرسيجنال الغربية بيكو زائد". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . مقارنة هيلا بوليسومال التنميط في 10-50% (أسود) أو تدرجات السكروز 17%-51% (رمادي)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . تأثير المعاملة يدتا على بوليسومال الشخصية في خلايا هيلا. وعولج خلية هيلا ليستي مع 10 ملم يدتا على الجليد لمدة 10 دقيقة مباشرة قبل السكروز التدرج الطرد المركزي. تمت الاستعاضة عن مجكل2 5 مم يدتا في حلول السكروز التدرج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 . بوليسومال الشخصية من أنسجة الخصية الماوس ليساتي. تعرضوا لاستخراج الحمض النووي الريبي مع كاشف تنقية الحمض النووي الريبي الكسور وتحليلها بواسطة التفريد في 1% [اغروس] هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المرحلة | الخطوة | الشرط |
| عقد | الخطوة 1 | زيادة درجة الحرارة من 25 إلى 50 درجة مئوية مع 1.6° C/s |
| احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقة 02:00 | ||
| الخطوة 2 | زيادة درجة الحرارة من 50 إلى 95 درجة مئوية مع 1.6° C/s | |
| احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 10:00 دقيقة | ||
| بكر | الخطوة 1 | احتضان عند 95 درجة مئوية 00:15 دقيقة |
| الخطوة 2 | انخفاض درجة الحرارة من 95 إلى 60 درجة مئوية مع 1.6 درجة مئوية/ | |
| احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة دقيقة 01:00 | ||
| عدد من دورات 40 | ||
| تذوب منحنى | الخطوة 1 | زيادة درجة الحرارة من 60 إلى 95 درجة مئوية مع 1.6° C/s |
| الخطوة 2 | انخفاض درجة الحرارة من 95 إلى 60 درجة مئوية مع 1.6° C/s | |
| احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة دقيقة 01:00 | ||
| الخطوة 3 (الانفصال) | زيادة درجة الحرارة من 60 إلى 95 درجة مئوية مع 0.05° C/s | |
| احتضان عند 95 درجة مئوية 00:15 دقيقة | ||
الجدول 1. شروط RT-قبكر
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تجزئة بوليسومي بالتدرج السكروز جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي، وتحليل البروتين الكسور وسيلة قوية لتحليل حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو ترانسلاتومي كله، فضلا عن أدوار العوامل البروتين تنظم متعدية الجنسيات إليه خلال حالة فيزيولوجية أو المرض العادي. التنميط بوليسومال وتقنية مناسبة خاصة لدراسة التنظيم متعدية الجنسيات في الكائنات الحية مثل تريبانوسوماتيدس بما في ذلك ليشمانيا فيها مراقبة النسخي غائبة إلى حد كبير وتنظيم تعبير الجينات غالباً ما يحدث أثناء الترجمة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول تجزئة polysome المستخدمة في النماذج الثلاثة: ليشمانيا الطفيليات واستزراع الخلايا البشرية والأنسجة الماوس. الخطوة تجزئة polysome أساسا هي نفسها بالنسبة للكائنات المختلفة المستخدمة في هذه الدراسة؛ ومع ذلك، قد إعداد ليستي بعض الاختلافات. ليشمانيا خلايا تنمو في ثقافة السائل ويتم جمعها بالطرد المركزي ويتم عد الخلايا قبل تحلل لضمان تساوي تحميل على التدرج. ويمكن غسلها الخلايا البشرية وتفكيك مباشرة على اللوحة. ويسيطر تحميل تساوي الكثافة البصرية. تتطلب أنسجة الماوس الخالطون دونسي لكفاءة تحلل بينما في حالة الليشمانيا والخلايا البشرية، أنها كافية لتمريرها من خلال إبرة عيار 23.
ينبغي أن تكون جميع الكواشف المستخدمة رناسي وحوزتي مجاناً. قارنا الهيبارين ومثبط رناسي كمثبطات للنشاط رناسي في ليساتيس هيولى. ووجدنا أن كلا الكواشف يمكن أن تعوق بشكل فعال رناسي. ومع ذلك، الهيبارين يؤثر على التطبيقات المصب مثل إعداد كدنا و RT-قبكر. كنتيجة لذلك، يتطلب إعداد الجيش الملكي النيبالي خطوة تنقية إضافية عندما يتم استخدام الهيبارين. وفي رأينا، مثبط رناسي هو الخيار أكثر ملاءمة ويمكن استخدامها بفعالية في polysome التنميط البروتوكول.
التنميط بوليسومال هو العمل المكثف، الذي يشكل قيداً رئيسيا للأسلوب. يمكن إعداد تصل إلى ستة التدرجات في نفس الوقت. فراكتيوناتور التدرج يولد 144 الكسور التي تحتاج إلى معالجتها في فترة قصيرة من الزمن. تحليل للكسور الفردية يمكن أن تكون مضيعة للوقت ومكلفة جداً. ولذلك، الجمع بين كسور الفردية في بوليسوميس السابقة، بوليسوميس الخفيفة والثقيلة يوفر طريقة سريعة وأقل مشقة لتقدير النشاط متعدية الجنسيات من مرناس الفردية. نتائجنا RT qPCR الكسور مجتمعة في مكنتنا من تحديد الاختلافات في طواعية مرناس مختلفة سواء في الليشمانيا وخلايا هيلا (الأرقام 2، 3). ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى قرار أكثر دقة، ثم الكسور الفردية يمكن إجراء تحليل.
الريبوسوم التنميط هو طريقة أخرى لدراسة حالة متعدية مرناً ويستند قياس إنتاج البروتين عن طريق التسلسل من شظايا مرناً يحميها الريبوسوم38. هذه التكنولوجيا توفر المعلومات الكمية ربط تسلسل مرناً مع كسور بوليسومال محددة تجري ترجمته في عينة، ويمكن أن توفر معلومات دقيقة عن حالة متعدية الجنسيات مرناس كودون دقة بالمقارنة مع polysome التنميط التكنولوجيا. ومع ذلك، polysome التنميط يمكن استخدامها لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتين، مما يوفر معلومات إضافية عن البروتين بوليسوميس وتحديد العوامل المساهمة في تنظيم الترجمة.
ولذلك، التنميط بوليسومال هو تقنية متعددة الاستخدامات التي يمكن استخدامها لتحليل حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية، دراسة البروتينات المرتبطة الريبوسوم ودراسة التنظيم متعدية الجنسيات في نموذج مختلف الكائنات تحت مختلف التجريبية شروط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون لي تشينغ للمساعدة في تسجيل الصوت. البحث تدعمها أموال بدء التشغيل من تكساس تكنولوجيا جامعة مركز علوم الصحة ومن مركز التميز "علم الأعصاب متعدية الجنسيات" والمداواة (كتنت) منح 2017 PN-كتنت-05 "أخرجدهو" A.L.K.؛ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI099380 هوفمان K.Z. جيمس جيم وباكا ر. كريستين العلماء سيسير (مركز "التكامل لوقف" التعليم والبحوث) وكانت مدعومة البرنامج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments: | |||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 | |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 | |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 | |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 | |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV | |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 | |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 | |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 | |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 | |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B | |
| Software | |||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | ||
| Materials: | |||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 | |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 | |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 | |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Chemicals: | |||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G | |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| Water | Sigma | W4502-1L | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 | |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML | |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G | |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 | |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 | |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L | |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G | |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 | |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 | |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL | |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG | |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG | |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S | |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN | |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A.
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
