Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Abstract

Maya 2-hibrid tahlil kullanarak protein-protein etkileşimleri için tarama uzun etkili bir araç olmuştur ama kullanımı büyük ölçüde son derece etkileşen adaylar Kütüphanesi'ndeki zenginleştirilmiş yüksek benzeşme interactors keşfi için sınırlı olmuştur. Geleneksel bir biçimde düşük benzeşme interactors bulunduğu düşük sıkılık yürütülen çözümlemek için çok fazla kolonileri Maya 2-hibrid tahlil yol açabilir. Ayrıca, farklı yem plazmid karşı aynı Kütüphanesi bir kapsamlı ve eksiksiz sorgulama karşılaştırmalı bir analiz elde edilemez. Her ne kadar bazı bu sorunları dizilmiş av kütüphaneleri kullanarak ele alınabileceği böyle ekranlar çalışması için gereken altyapı ve maliyetini engelleyici olabilir. Alternatif olarak, aynı anda geçici düzinelerce ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması ve bir strateji kullanarak tek bir ekran içinde statik protein etkileşimler olarak adlandırdığı DEEPN (dinamik zenginleştirme değerlendirme Protein ağları için), hangi yüksek işlem hacmi DNA sıralama ve hesaplama etkileşen ortakları kodlamak plazmid nüfusu evrimi takip içerir. Burada, özelleştirilmiş reaktifler ve kolayca ve uygun maliyetli yürütülecek bir DEEPN ekran izin iletişim kurallarını açıklar.

Introduction

Hücre biyolojik süreçlerin tam bir anlayış moleküler mekanizmaları altında yatan protein etkileşim ağları bulmaya dayanır. Protein etkileşimleri tanımlamak için bir yaklaşım iki protein etki alanı ilgi bir başkasına1bind sonra işleyen chimeric transkripsiyon faktörü birleştirerek çalışır Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Tipik bir Y2H ekran etkileşen proteinler transkripsiyon harekete geçirmek için erimiş kodlama plazmidler her iki bir kütüphane evler Maya nın nüfusu oluşturularak gerçekleştirilir (Örn., 'füzyon protein av') ve protein oluşan bir verilen 'yem' plazmid bir DNA bağlayıcı etki alanına (Örneğin, Gal4 ters yönde aktive dizisine bağlar Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı) ilgi erimiş. Y2H yaklaşım ana avantajlarından biri nispeten kolay ve ucuz tipik bir laboratuarda yapmak rutin moleküler biyolojik iş2için donatılmış olmasıdır. Ancak, geleneksel olarak gerçekleştirildiğinde, bir kullanıcı seçimi olumlu Y2H etkileşimi için üzerine ortaya çıkan bireysel kolonileri örnekler. Bu ciddi bir şekilde anket Kütüphane 'av' klonlar sayısını sınırlar. Belirli bir etkileşen av bolluğu diğerleri düşük bereket av plazmid müdahalesini algılama şansı azalan göre çok yüksek olduğunda bu sorunu bileşik olduğunu.

Proteom kapsamlı kapsama Y2H ilkesini kullanarak için bir çözüm neyin bilinen tek tek av plazmid içeren bir dizi dijital olarak sorguya bir matris biçimli yaklaşım kullanımıdır. Ancak, böyle bir yaklaşım proteinler veya etki alanları3az sayıda interactome tanımlamada ilgilenen bireysel araştırmacılar için kolayca erişilebilir veya maliyet-etkin değil bir altyapı gerektirir. Ayrıca, birden çok parçaya etkileşen proteinlerin kodlamak çok karmaşık av kitaplıkları için pratik boyutları böyle matris dizileri boyutunu artıracağı. Deneyleri karmaşık kütüphaneler ile toplu olarak gerçekleştirmek ve etkileşen klon massive paralel yüksek üretilen iş sıralama4kullanan olup olmadığını değerlendirmek için bir alternatiftir. Bu tipik bir kullanarak birden çok koloniler halinde ortaya av plazmidlerin varlığı tahlil uygulanabilir Y2H biçimlendirilmiş hangi Maya hücreleri füzyon protein etkileşen bir çifti konut üzerinde plaka5,6büyümeye izin yaklaşım. Bu genel bir fikir sorgu her iki birden fazla yem artırmak ve bileşenleri aynı saat7,8av vurgulu.

Yine de, birçok araştırmalar daha kolay bir henüz daha fazla çaba sadece birkaç protein 'yemler üzerinde' odaklı gerektirir ve daha ayrıntılı ve yarı kantitatif sorgusu, bir tek karmaşık av kütüphane tarafından yararlanabilir. Biz geliştirdik ve geniş ölçekli protein etkileşim çalışmaları toplu biçimi4' te bir Y2H ilkesini kullanarak gerçekleştirmek için bir yaklaşım doğrulanmış. Bu belirli av plazmid genişleme hızı Y2H etkileşim9göreli gücü için bir proxy sunucu olarak kullanır. Bir nüfus içinde tüm plazmid derin sıralama için normal büyüme tabi veya seçici büyüme koşulları üreten güçlü ve zayıf Y2H etkileşimleri verim klonların tam bir harita. İnteractors repertuar elde edilen ve doğrudan birden fazla yem plazmid karşılaştırılır. DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı elde edilen iş akışı böylece fark interactomes proteinler, vs. başka bir protein arasında karşılaştırma izin tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlamak için kullanılabilir.

Burada, biz DEEPN göstermek ve hangi Şekil 1' de özetlenen onun kullanımını kolaylaştırmak laboratuvar yöntemleri gelişmeler tanıtmak. Önemli iyileştirmeler şunlardır:

Av Maya nüfus nesil. Bir DEEPN anahtar gereksinimleri Maya plazmid av kütüphanelerin aynı dağıtım var farklı yem Plasmid'ler ile nüfus oluşturuyor. Av plazmid Kütüphane eşdeğer taban çizgisi nüfus farklı yemler interactomes arasında doğru karşılaştırmaları yapmak için gereklidir. Bu en iyi zaman bir kütüphane plazmid zaten haploit Maya nüfus içinde yer alan ve verilen yem plazmid nüfus hareketli bir diploid üretmek için çiftleşme tarafından elde elde edilir. Burada, nasıl böyle nüfus haploit Maya yer alan ticari kitaplıklarını kullanma yapmak bir net rehber sağlamak. Her ne kadar diploitler yüksek bir sayı üretmek yöntemleri bulduk, bu ticari kitaplığı içeren maya suşları genel çiftleşme verimliliğini düşüktü. Bu nedenle, biz tepki çiftleşme başına çok daha fazla diploitler verimleri av kitaplıkları ev yeni bir yük inşa.

Yeni yem plazmidler ayarla. Oluşan 'yem' füzyon protein faiz ve DNA'ya bağlanıcı etki alanı protein Hızlı birçok geçerli plazmid 2µ onları onların kopya sayısını yükseltmek için izin, tabanlıdır. Bu kopya sayısı oldukça değişken nüfus ve değişkenlik Y2H transkripsiyon yanıt yol. Bu sırayla yetenek seçimi altında hücre büyüme yanıtı dayalı bir verilen protein etkileşimin gücünü ölçmek için çarpık. Bu kısmen bazıları daha önce piyasada bulunan pDEST3210gibi tarif var bir düşük kopya plazmid kullanarak adres olabilir. Biz Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon proteinler de yem parçaları her iki akıntıya karşı klonlama sağlar Kanr direnç geni taşıyan bir TRP1 düşük kopya şeması tabanlı plazmid içinde üreten yeni bir yem plazmid (pTEF-GBD) inşa ve Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanının aşağı akım.

Yeni yüksek yoğunluklu Y2H parçasını kitaplık. Biz ev Y2H av kitaplıklara yeni bir plazmid inşa ve rastgele yamultulmuş genomik DNA parçaları Saccharomyces cerevisiaeyapılan son derece karmaşık bir Y2H kütüphane oluşturmak için kullanılır. Dizi analizi bu kitaplığın 1 milyondan fazla farklı elemanları, yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H plazmid kitaplıkları11çok daha karmaşık olduğunu göstermiştir. Bu yeni kütüphane ile DEEPN iş akışı karmaşık kütüphaneleri güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde pek çok farklı Plasmid'ler ile karşılamak için güçlü olduğunu göstermek başardık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması medya ve plakaları

Not: Tüm plakaları en az 2 gün protokol başlamadan önce yapılması gerekir. Medya herhangi bir noktada yapılabilir. Ancak, arabelleğe alınmış maya ekstresi pepton dekstroz adenin (bYPDA) hangisinin kullanılacağı gün yapılması gerekir. Bazı medya ne genellikle kullanılan daha büyük olan adenin düzeyini içeren bir ek karışımı kullanılarak yapılır. En az medya takviyeleri 10 mg/L adenin belirtin. Etiketli takviyeleri '+ 40Ade' 40 mg/L adenin toplam belirtin.

  1. Glikoz çözüm hazırlamak (% 50 w/v). İçin 1 L, D-(+) 500 g çözülür-800 mL distile su bir 1000 mL ölçek glikoz. Bir mezun silindir ve filtre bir steril 1000 mL medya depolama şişe içine bir 0.2 µm steril filtreden kullanmanın 1000 ml ses düzeyini ayarlayın.
  2. Maya özü pepton Dekstroz (YPD) tabak hazırlamak. İçin 1 L, 20 g pepton ve 10 g Maya Extract 800 ml distile su bir 1000 mL ölçek geçiyoruz. Mezun silindir içine dökün, 960 mL distile su ile doldurun. 2000 mL Erlenmeyer şişe dökün ve agar 15 g ekleyin. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 40 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  3. Tam sentetik en az medya (CSM) hazırlamak-Trp plakaları. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 6,7 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 960 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve Trp - 0.7 g ekleyin-çıkarma mix, metiyonin 20 mg ve agar 15 g bir araya geldi. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 40 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  4. CSM-Leu araya geldi tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün ve ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 1.005 g - Leu ekleyin-çıkarma mix ve agar 15 g bir araya geldi. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  5. CSM-Leu-Trp tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 1.005 g - Trp ekleyin-Leu + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  6. CSM-Leu-Trp-O'nun tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 0.975 g - Trp ekleyin-Leu-onun + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  7. CSM-Leu-Trp-His-3AT tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 0.975 g - Trp ekleyin-Leu-onun + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. 3-amino-1,2,4 triazole (3AT) 1 M steril stokunun 100 µL içinde dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  8. LB-Kanr tabak hazırlamak. Erime 10 g Tryptone, Maya 5 g için 1 L, hulâsa ve NaCl 10 g 800 ml distile su bir 1000 mL ölçek. Mezun silindir içine dökün, en fazla 1000 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve agar 15 g ekleyin. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda 50 mg sefaloridin ve dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  9. YPD, CSM-Leu-bir araya geldi, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp ve CSM-Leu-Trp-O'nun ortam hazırlamak. Dışında bir Erlenmeyer şişesi dökme yerine, medya depolama şişe içine dökün ve agar ihmal plakalar için yukarıdaki yordamı kullanın.
  10. BYPDA (arabelleğe alınmış YPDA) hazırlayın. Steril YPD medya alıp 200 mg/L adenin steril distile su ekleyin. 3.7 için pH HCl. filtresiyle 0.2 µm steril filtre bir steril şişe içine ayarlayın.
  11. Dönüştürme arabelleği hazırlayın: 2 M sorbitol, 1 M Lityum asetat dihydrate, 10 mM Tris pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0.2 mM kalsiyum klorür distile su içinde. 0.2 µm steril filtreden bir steril şişe içine filtre.
  12. PEG çözüm hazırlamak: % 70 w/v Polietilen glikol 3350 distile su içinde. Otoklav tarafından sterilize.
  13. Dön hazırlayın: 8 M üre, % 4 w/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, % 10 v/v gliserol, distile su %0.02 w/v bromophenol olarak steril mavi.
  14. STE (güçlü TE) hazırlamak: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 distile su içinde. 0.2 µm steril filtreden bir steril şişe içine filtre.
  15. Zymolase hisse senedi çözüm hazırlamak: 10 mg/mL Zymolase 100T 50 mM potasyum fosfat dibasic pH 7.5, % 50 v/v gliserol arabellekte steril distile su (-20 ° C'de depolanan).

2. klonlama ve yem plazmid doğrulanması

Not: Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı plazmid inşaatı. Şu anda piyasada bulunan ve akademik olarak kullanılabilir Y2H sistemleri çeşitli vardır. DEEPN protein DNA'ya bağlanıcı etki alanına erimiş ilgi ifade yem plazmid içinde TRP1koşuluyla bunların çoğu karşılamak-plazmid içeren. Diğer aşağı akım gereksinimleri olan sıra hemen akıntıya karşı av Kütüphanesi Ekle bilinir ve bu olumlu Y2H etkileşim His3 üretimini bırakmak için seçim histidin eksik medya tarafından attı. Burada biz yeni Y2H yem plazmid (pTEF-GBD, Şekil 2) nasıl kullanılacağını açıklar, ancak, pGBKT7 de dahil olmak üzere diğer Y2H yem plazmid de kullanılabilir. İnşaat ve yem plazmid değerlendirilmesi için pTEF-GBD kullanımı anlatacağız. Genel bir not olarak, iyi ifade ve klonlama ile kolaylığı sağlamak için Maya kodon önyargı'nin bir açık okuma çerçevesi üretmek için gen sentez öneririz. Klonlama düzeni Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı ile çerçeve ve 3' siteye klonlama zaman bir kodonu yem kodlama bölge izleyen olmak için yem sağlar emin olun.

  1. Plazmid vektör hazırlayın. Plazmid pTEF-GBD sağlar ilgi protein kodlama bir parçası klonlama için 5' ya da 3' bir hızlı derleme yöntemiyle Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı kodlama bölgesi. Ekleme 5' sitesinde, pTEF-GBD NarI ve EcoRI ile 3 µg sindirmek veya 3' sitesinde sokmak için BamHI ile sindirmek ve XhoI için 2-4 h. Electrophorese örnek % 1 DNA özel jel içeren 0,2 - 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür (EtBr) 100 tüketim kesim 5,630 bp TEF-GBD ve üreticinin yönergelerine uygun olarak bir DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak ve 260 absorbans tarafından DNA ölçmek spektrofotometre12nm.
    Not: Nesil yem kodlama ekler. Kodlama proteinler DNA parçaları veya protein parçaları ilgi gen sentezi kullanılarak yapılmış ve uncloned parçaları olarak kullanılabilir olabilir. Bu kodon Saccharomyces cerevisiae ifade için en iyileştirilmiş ve çevrimiçi araçlar kodon optimizasyonu için malzeme listesinde bulunan önerilir.
  2. 5' için ekleme, ATG başlama kodonu 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 tarafından kodlama DNA parçası kanattan 've 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', anılan sıraya göre. 3' Gal4 DNA bağlayıcı etki ile çerçeve için ekleme, kodlama parçası 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa tarafından -3 kanat 've 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Plazmid İnşaat için hızlı montaj üreticisinin yönergelerini belirtildiği gibi klonlama parçaları için kesilmiş pTEF GBD uymalısınız.
    1. Tüm E. coli LB-Kanr levhalar değiştirdi ve 16-20 h 37 ° C'de için kuluçkaya plaka PTEF-GBD istenen eklemek ile konut koloniler tarafından PCR güçlendirme oligonucleotides kullanarak belirlenebilir: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' ve 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' ekleme ve 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' ve 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' 3' eklemek için. Bu oligonucleotides de ekleme sıralama için astar olarak hizmet verebilir.
    2. Planı hazırlanması üzerinde > her pTEF-GBD türev ve rahat sıralama ve Maya dönüşümleri malzeme sağlamak için pTEF-GBD 10 µg.
    3. Aşağıdaki PCR koşullar kullanın: 3 dk 98 ° C'de 30 25 döngüsü tarafından takip 98 ° c, 30 s s 55 ° c ve 2 dk 72 ° C'de takip 2.5 mM MgCl2 içeren bir arabellek kullanarak 72 ° C'de 5 min tarafından , 0.5 U/100 µL DNA polimeraz ve özel tampon.

3. ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı Fusion proteinlerin

  1. Yetkili Maya olun.
    1. Çizgi PJ69-4A Maya YPD plaka üzerine dışarı 1 mm3 -80 ° c kazıma steril bir ahşap aplikatör alarak stok ve yavaşça YPD plaka arasında sürtünme donmuş. Ahşap aplikatör her geçişte medya yüzey el değmemiş bir parçası arasında gider plaka taşıyın. YPD plaka 30 ° C'de 2 gün veya tek kolonileri görünür hale gelene kadar kuluçkaya. Donmuş hisse senedi PJ69-4A Maya Maya su veya büyüme medyada askıya alma, DMSO ile % 7 ilave ve-80 ° C'de depolayarak olun
    2. Bir koloni 5 ml steril bir ahşap aplikatör kullanarak bir 20 x 150 mm Kültür tüp YPD kültürünün aşılamak ve gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 30 ° C'de büyür.
    3. YPD 50 mL steril Erlenmeyer şişesi bir 250 ml PJ69-4A Maya zorlanma gecede kültür 4 mL ile aşılamak. 30 ° C arasında için bir optik yoğunluk (OD600) 200 d/d, titreyen bir kuluçka standart 1 cm ışık yolu ile spectrophotometry tarafından belirlenen yaklaşık 1,2, büyümek. Büyüme genellikle 5-7 saat sürer.
    4. Maya sedimantasyon konik tüp 4696 x g benchtop santrifüj oda sıcaklığında 5 min için de bir 50 ml tarafından izole et. Süpernatant sıvı atık damping tarafından atmak. Bir pipet kullanarak, Pelet dönüştürme arabelleği ve transfer konik tüp 15 mL 5 ml resuspend. Süpernatant atmak ve dönüştürme arabelleği 1000 µL pipet ile son Hacim 1 ml Maya resuspend için Resediment.
    5. 200 devir / dakikada sallayarak süre Maya hücreleri 30 ° C'de 60 dk için kuluçkaya ve buz 30-90 dakika yerleştirin.
  2. Maya plazmid dönüşümü.
    1. 1.5 mL steril microcentrifuge Tüp, pTEF-GBD tabanlı plazmid 1 µg ve 5 µL 10 mg/mL somon sperm taşıyıcı DNA çözüm ekleyin. Ayrıca yalnızca somon sperm taşıyıcı DNA negatif dönüşümü kontrol olarak içeren bir tüp içerir. Buz gibi Maya hücre süspansiyon 100 µL pipet tarafından her tüp için ekleyin. %70 100 µL eklemek bir 1000 µL pipet ve karışımı yavaşça tarafından tüp 5 - 10 kat (yapmak değil girdap) flicking PEG çözümle.
    2. 200 devirde titreyen bir kuluçka için 45 dk 30 ° C'de kuluçkaya.
    3. 15 dakika 42 ° C'de Isı şok.
    4. Tortu 845 x g 3 dakika oda sıcaklığında, microcentrifuge içinde kapalı pipet ve süpernatant atmak, Pelet steril su 150 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve bir CSM-Trp plaka yüzey üzerine yayıldı.
    5. 30 ° C kuluçka makinesine plakaları sağ tarafında yukarı yerleştirin ve 2-3 kolonileri görünür hale gelene kadar gün kuluçkaya. Tabak baş aşağı kuluçka için 6-12 h 30 ° C'de sonra plaka yüzeyinde yoğunlaşma önlemek için açık olabilir.
    6. Steril bir kürdan kullanarak CSM-Trp plaka üzerine bir yama olarak dönüştürme ve çizgi başına 2-3 kolonileri alın. 30 ° C'de 24 h için büyümeye izin
  3. Lysates protein ifade için yapmak.
    1. CSM-Trp sıvı medya 3 mL maç kafa boyutlu Maya yama ile aşılamak ve gecede bir 20 x 150 mm Kültür tüp 30 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak süre büyür. İki gecede kültür boş pTEF-GBD vektör başı yem olun.
    2. 1 mL YPD CSM-Trp gecede kültür için her 3 mL ekleyin. 30 ° C'de 1 h için 200 devir / dakikada sallayarak süre büyümek. Hücre OD spektrofotometre tarafından kontrol edin.
    3. Tortu OD göre normalize hücreleri, aynı sayıda. Steril 1.5 mL microcentrifuge tüplerinin 2,348 x g bir microcentrifuge oda sıcaklığında bir 5 dk spin ile kullanın. Bir pipet süpernatant iptal etmek için kullanın. Son stok 2.1 OD minimumda karşılık gelir.
      Not: eşdeğer hücre sayısı hesaplanırken, farklı birimlerde her gecede kültür en az 2.1 OD elde etmek için gerekli olabilir oluşabilir.
    4. Pelet 0.2 M NaOH 450 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Hücreler için 2 dk 2,348 x g oda sıcaklığında, recentrifuge ve süpernatant pipet tarafından atın.
    5. Pelet 50 µL dönüş arabelleği ile yukarı ve aşağı dikkatle kabarcıklar yapmak değil gibi pipetting tarafından resuspend. 70 ° C'de 5 min için ısı örnek
  4. Protein ifade SDS-sayfa tarafından kontrol edin.
    1. Kullanım bir degrade jel moleküler ağırlık geniş bir ürün yelpazesi sağlamak için % 4-20 çözülebilir. Yük eşit miktarda (aynı OD) örnekleri bir SDS-sayfa içine jel ve değiştirilmemiş pTEF-GBD vektör13,14,15içeren en az bir örnek eklemeyi unutmayın.
    2. Elektroforetik ayrılıktan sonra nitroselüloz ve anti-myc monoklonal veya poliklonal antikorlar ve ECL algılama çözüm (Şekil 3) kullanan immunoblot jel aktarın.

4. kendi kendine harekete geçirmek Test

  1. Steril bir ahşap aplikatör alarak, Maya az miktarda şişeyi dışarı kazıma ve YPD plaka üzerinde çizgiler faiz YPD plaka üzerine av Kütüphanesi konut zorlanma karşılık gelen-80 ° C stoktan çizgi MATalpha Maya dışarı. YPD plaka 30 ° C'de 2 gün veya tek kolonileri görünür hale gelene kadar kuluçkaya. YPD plaka üzerine bir kaç tek kolonileri yama ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
    Not: bazı uyumlu piyasada bulunan Y2H kütüphaneler Y187 içinde saklanır, ancak burada ev av kitaplığına geliştirilen yeni yük PLY5725 olduğunu.
  2. 3.3.1 - bölümündeki yordamları izleyin PLY5725 LEU2ile dönüştürmek için 3.3.4-plazmid istenen av kitaplığı barındırmak için kullanılan dayalı. Burada geliştirilen kitaplıkları için karşılık gelen plazmid pGal4AD olduğunu (pPL6343). Maya transformants, CSM-Leu araya geldi tabak tabağa kurtarmak için. Koloniler sonra ortaya çıkan, CSM-Leu araya geldi plaka üzerine yamalar olarak çizgi ve 30 ° C'de 24 h için kuluçkaya
  3. Anti boş vektör pPL6343 kullanarak ifade onaylamak için 3,4 protokolünde izleyin-HA monoklonal veya poliklonal antikorlar ve ECL algılama çözüm.
  4. Her PLY5725 ile çapraz desende dönüştürülmüş PJ69-4A Maya oluşturur çizgi YPD tabakta Protokolü Bölüm 3.4 ve 4.3 protein ifade etmek ve 30 ° C'de gecede kuluçkaya doğrulandı. Burada iki suşlar birlikte büyüdü ve üzerine yama hücre almak 1 mm3 ayrı CSM-Leu-bir araya geldi, CSM-Trp ve CSM-Trp-Leu plakaları ve 24 h büyümek.
    Not: İstenen diploitler CSM-Trp-Leu tabaklarda büyüyecek. CSM Leu met büyüme ve CSM-Trp tabak maya büyüme için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
  5. CSM-Trp-Leu medya gecede 30 ° C'de 1 ml diploitler büyümek 2,348 x g, bir microcentrifuge oda sıcaklığında 3 dk de tortu 500 µL hücreleri microcentrifuge 1,5 ml tüp. Süpernatant pipet tarafından atmak. 1 mL steril su hücrelerde resuspend ve sedimantasyon ve resuspension tekrarlayın. Hücre OD600 denetleyin.
  6. 1:10 bir dizi çoğu başlangıç ile steril su kullanarak her hücre süspansiyon, seri dilutions yapmak konsantre her 0,5 aşırı doz, çözüm. Her seyreltme CSM-Leu-Trp plaka, CSM-Leu-Trp-O'nun bir tabak ve bir CSM üzerine 5 µL spot-Leu-Trp-onun + 3AT plaka. 30 ° C'de kuluçkaya ve büyüme için incelemek günlük 3 gün içinde (Şekil 4).
    Not: 1:10 için seri seyreltme, tüpün içine su 90 µL aşırı doz 0,5 içeren 10 µL pipet ve mix yukarı ve aşağı pipetting. Toplam altı farklı konsantrasyonlarda noktaya kadar seri dilutions 1:10 yapmaya devam.

5. yem ve av Kütüphane ile Maya nüfus oluşturma

Not: ticari av Kütüphane plazmid evler Y187 zorlanma iyi dostum değil. Bu nedenle, aşağıdaki en iyi duruma getirilmiş koşullar Kütüphane karmaşıklığı korumaları gerekmektedir. PLY5725 strain içeren Y2H av kitaplıkları arkadaşları daha iyi ve aynı çiftleşme prosedür-ebilmek var olmak kullanılmış bu türe (Şekil 5).

  1. Her biri çeşitli TRP1taşıyan PJ69-4A transformants kültürleri 3 mL aşılamak-pTEF-GBD yem plazmid CSM-Trp medya bir kültür tüp içeren. Yalnız yordam denetimi olarak hizmet etmek için pTEF-GBD vektör plazmid içeren iki ayrı kültür içerir. Kültürler 30 ° c, 200 rpm 6 h için kuluçkaya ve 25 mL steril bir Erlenmeyer şişesi gecede büyüme için kültür içine oranında seyreltin.
  2. LEU2içeren MATalpha hücreler dondurulmuş (-80 ° C) şişe tezcan-"av" Kütüphane, oda sıcaklığında taşıyor. CSM-Leu araya geldi medya ile tamamen çözülmüş flakon steril bir Erlenmeyer şişesi 125 mL aşılamak. Tüm kültürler gecede 30 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile büyümek.
    Not: Bir gecede kültür OD600 1.0-1.5 sonraki adımlara geçmeden önce arasındaki aralığı gerekiyor.
  3. 21 OD karşılıkları her 4696 x g oda sıcaklığında bir 5 dk spin ile PJ69-4A transformant kültürlerin santrifüj kapasitesi. Her 10 reaksiyonlar çiftleşme için istenen, Pelet 39 OD600 eşdeğerleri büyük kütüphane plazmid konik tüpler ayrı 50 mL taşıyan MATalpha yük.
    1. 10 mL steril su hücrelerde ve yeniden cips yeni 50 ml konik tüp 4696 x g 5 dk benchtop santrifüj oda sıcaklığında resuspend. Bir pipet kullanarak, yavaşça süpernatant pelleted hücreleri aksatmadan çıkarın.
    2. Granül 4 mL PJ69-4A hücreleri ve PLY5725 hücre bYPDA (pH 3.7) 10 ml resuspend.
  4. Set-up çiftleşme reaksiyonlar, ekleyin 1 mL PJ69-4A hücreleri, MATalpha kitaplığı içeren hücre 1 mL ve 1 mL konik tüp yeni 50 ml bYPDA pH 3.7 dönüştürdü. Nazik yörünge ajitasyon (100-130 devir/dakika) 90 dk ile 30 ° C'de kuluçkaya.
    1. Hücreler için bir benchtop santrifüj oda sıcaklığında 4696 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından kaldırmak ve Pelet 2 mL 1:1 bYPDA:YPD resuspend. 100 mm YPD levha üzerine tüm 2 mL pipet tarafından plaka ve yaklaşık 20 h 30 ° C'de kuluçkaya.
  5. Hücreleri 2-3 mL CSM-Leu-Trp medya çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak YPD plakaları hücrelerden hasat. 50 mL konik tüpün yerinden pipet hücrelere. 4 - 5 kere ile 2-3 mL CSM-Leu-Trp medya tabak 1000 µL kullanarak ortamın pipet yukarı pipetting ve yavaşça YPD plaka yüzeyi boyunca ortam çıkarma tarafından durulayın.
    1. Hücreler için bir benchtop santrifüj oda sıcaklığında 4696 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından atın ve 40 mL CSM-Leu-Trp medya hücrelerde (yapmak değil girdap yukarı ve aşağı) pipetting tarafından resuspend.
  6. Oluşan diploit hücre sayısını tahmin etmek için 200 µL ve 2000 µL CSM-Trp-Leu medya diploit karışımı 4 µL sulandırmak. Her seyreltme CSM-Leu-Trp plaka üzerine 200 µL plaka.
    Not: 1:10,000 ve 1:100,000 kat seyreltme hasat ve beklenen ~ 9.000-27.000 koloniler 1:10,000 seyreltme plaka üzerinde 36-40 h. için 30 ° C'de kuluçka sonra onay plakaları adımdan sonra 5,7 verimli diploitler stokunun iki tabak temsil ediyor. 200 koloniler 1:10,000 seyreltme plaka üzerinde en az sayıda adım 5,8 devam etmek için gerekli
  7. Hemen her 40 mL cep resuspension de geri kalanını al ve Erlenmeyer şişe 500 mL CSM-Leu-Trp medya içeren bir 1000 mL aşılamak. Bir ilk OD600al. Doygunluk (~2.0 OD/mL) ulaşana kadar 180 rpm'de sallayarak ile bu şişeler 30 ° C'de kuluçkaya. Bu genellikle yaklaşık 36-40 h. monitör büyüme 24 h sonra tekrar 36 h OD600tarafından alır.
  8. Bir pipet kullanarak her kültür ve innoculate Erlenmeyer şişeler, bir içeren 750 mL CSM-Leu-Trp medya ve ikinci içeren 750 mL CSM-Leu-Trp-O'nun 3AT en düşük düzeyi olan 2000 mL doymuş 500 mL aliquots 20 mL kaldırmak bu arka plan (daha önce belirlenen Bölüm 4.5) ortadan kaldırır. Yeni kültürler (770 mL) de dönen tarafından mix ve bir ilk OD600al.
  9. 30 ° C'de kültürler genellikle seçili olmayan CSM-Leu-Trp kültür için 24 saat içinde ortaya çıkar ve 70 h altında seçim Y2H etkileşimleri için kültürler için üzerinden alabilir doygunluk erişene dek 180 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.
  10. Kültürler Doygunluk (OD ~ 2.0) alabilirseniz, 11 mL pipet, tortu 4696 x g oda sıcaklığında bir 5 dk spin hücrelerle kaldırmak, süpernatant pipet, atmak ve -20 ° C'de dondurmak veya DNA ekstraksiyon devam. Seçili ve seçili olmayan örnekleri her ikisi de derin sıralama için kullanılır.

6. numune hazırlama DEEPN derin sıralama için

  1. DNA ekstraksiyon.
    1. Hücre çökeltilerini Protokolü Bölüm 5,7 500 µL sTE arabellek ve transfer microcentrifuge tüp 1.5 mL resuspend için bir pipet kullanın. Betamercaptoethanol 3 µL ve Zymolase stokunun 10 µL ekleyin. Mix iyi ve 24-36 h 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
    2. İki kez 500 µL fenol/kloroform/izoamil alkol ile örnek bir duman hood16kullanırken ayıklayın.
    3. 4 M NaCl 7 µL, buz gibi % 100 etanol (alkol), mix INVERSION tarafından ve her iki donma sıcaklığı-20 ° C 900 µL ekleyin veya tortu DNA iplik 21,130 x g bir microcentrifuge oda sıcaklığında 10 dakika için de tarafından devam edin.
    4. Süpernatant pipet tarafından atmak. Pelet 900 µL % 70 ile üç kez yıkayın alkol.
    5. Tortu 21,130 x g 2 min için cips ve artık alkol yıkama tarafından pipet kaldırın. 7 dk. 42 ° C'de için kuru Pelet
    6. 0.1 x sTE için 90 dk 37 ° C su banyosunda 120 µL Pelet resuspend, her 30 dakikada karıştırmak için tüpler hafifçe vur.
    7. Ayıklanan DNA'ın 60 µL microcentrifuge tüp steril bir 1,5 mL pipet. STE, 3,5 µL RNase A stok, mix ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya flick 120 µL ekleyin.
    8. Daha önce bölümü 6.1.3 - 6.1.5, yaptığımız etanol çökelti ama 4 M NaCl yerine 5 M amonyum asetat 7 µL kullanın.
    9. 0.1 x sTE için 90 dk 37 ° C su banyosunda 55 µL RNase A tedavi DNA resuspend, 260 absorbans tarafından her 30 dk. miktarını DNA karıştırmak için tüpler fiske nm bir spektrofotometre üzerinde.
  2. PCR cDNA ekler.
    1. İki DNA örneği başına 50 µL PCR reaksiyonları gerçekleştirin. Her reaksiyon 25 pmol av-Kütüphane plazmid eşleşen her ileriye ve geriye doğru astar içerir (malzemeleri görmek). Reaksiyonlar da High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, DNA örneği, 5 µg 25 µL içerir ve en fazla 50 µL. genişletme reaksiyonlar uzantısı kez 3 dk 72 ° c, anneal sıcaklık 30 55 ° c ile 25 devir için su s ve 10 s. Precede için 98 ° C'de denaturing Bisiklete binme bir 30 s denatürasyon 98 ° C ve takip ile 72 ° C'de 5 dk kuluçka tarafından
    2. 4 analiz µL % 1 DNA özel jel elektroforez ile DNA özel tarafından her PCR reaksiyon jel içeren 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr17. DNA örneği tarafından UV transillumination gözünün önüne getir. Örnekleri DNA yaklaşık 1-3 kb, bantlama deseni örnekleri için Y2H etkileşim neredeydi bulunduğu bir smear (Şekil 6) seçili gösterir.
    3. Yinelenen PCR örnekleri birleştirmek ve üreticinin yönergelerine uygun olarak PCR arıtma seti kullanarak arındırmak ve 260 absorbans tarafından DNA ölçmek nm bir spektrofotometre üzerinde.

7. derin sıralama

Not: Numune hazırlama ve sıralamanın bir derin sıralama platformda genellikle ticari ve akademik DNA sıralama çekirdek tesislerde kullanılabilir.

  1. Yamultma 600 ng bir ortalama uzunluğu ~ 300 fragments vermek için bir yüksek performanslı ultra-sonicator kullanarak PCR ürününün bp.
  2. Barkodlar, kodlama bağlayıcı siteleri, priming ekler derin sıralama için bir hazırlık seti kullanarak Dizin oluşturulmuş sıralama kitaplıkları oluşturmak ve dizileri asimetrik olarak DNA parçalarının uçlarını yakalamak.
  3. Kütüphane hazırlık üretici yönergelerine göre gerçekleştirin. Havuzu kütüphaneler ve dizi uzun eşleştirilmiş uç okuma bir derin sıralama platformda (Örneğin, 2 x 150 bp PE okuma) olarak dizine. 10 ve daha fazla okuma genellikle daha karmaşık seçili olmayan nüfus için istenen ile 40 milyon arasında istenen okuma sayısı, her örnek için hedef olduğunu. Seçili olmayan nüfus için en az 20 milyon veya daha fazla okuma öneririz.

8. Bioinformatic işleme ve doğrulama

  1. Tek başına yazılım programları (1) sıra eşlemek için inşa dosyaları bir evrensel SAM biçiminde (2) ölçmek okumak bir dizi ile fastq formundaki verileri sıralama işlemi DNA gen zenginleştirme arasında veri (3) verileri istatistiksel analizi gerçekleştirmek hangi aday gen sıralaması için sipariş Y2H etkileşim () 4 olumlu) ne region(s) ve ne translasyonel çerçevesinde her av cDNA gen başına bu parçaları oluşur etkileşimler vardır olumlu Y2H verim bilgi ve (5) sağlamak sağlamak sadece 5' aynı zamanda onların yeniden yapılanma ve doğrulama geleneksel bir Y2H biçimde izin etkileşen parçaları 3' sonunda yeniden oluşturmak için araçlar. Bu programların çalışması eşlik eden çalışmada detaylı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Y2H tahlil protein: protein etkileşimleri bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır ve çeşitli uyarlamalar ve sistemleri geliştirilmiştir. Çoğunlukla, bu önceki yaklaşımlar ile başarı sağlamak aynı konuları DEEPN için önemlidir. Bazı önemli kriterler şunlardır: Füzyon protein, sahte düşük bir arka plan onun + ilgi bir boş av plazmid, yem yüksek bir çiftleşme verimliliği ile yem içeren diploitler artış sağlanması ifade DNA'ya bağlanıcı etki alanının sağlanması MATA Maya ile Kütüphane içeren içeren MATalpha Maya ve son olarak, birçok olumlu Y2H reaksiyonlar için seçin koşullar altında büyümeye nüfus izin düşük-sıkılık koşullar hatta olanlar o üretmek düşük seviyelerde His3 etkinliği ve zayıf bir Y2H transkripsiyon yanıt.

DEEPN kritik yönlerini tekrarlanarak Y2H Kütüphane farklı yem plazmid içeren suşları tanıtmak ve güvenilir bir şekilde bu nüfus için olumlu Y2H etkileşim oluşturduğunuzda bu kütüphane plazmid seçmek için biridir. Farklı başlangıç popülasyonlar arasında yeterli tüm kitaplığı transferini sağlamak daha zor olduğundan Y2H Kütüphane karmaşıklığını artırır daha zor olur. Buna ek olarak, seçimi koşulları ve sıralama derinliği altında büyümeye seçilen nüfus büyüklüğü güvenilir gerçek pozitif Y2H etkileşimleri tanımlamak için Y2H plazmid bileşiminde tekrarlanabilir değişiklikleri gözlemlemek için yeterli büyüklükte olması gerekecek. Önceki çalışmalarda piyasada bulunan Y2H cDNA kitaplıkları kullanılır. Biz Y2H Kütüphane dağıtım aynı yem plazmid taşıyan ayrı nüfus arasında değişkenlik seçimden önce iki ilk nüfus arasında bir overdispersion ile düşük bulundu < 0,01 genellikle ve 0,35 - 0,55 ayrı nüfus sonra seçimi4. Ancak, bazı bu piyasada bulunan Y2H kütüphanelerin karmaşıklığı oldukça düşüktür (Şekil 7). Buna ek olarak, çoğu (~ %60) içinde klonların tamamen 3' daha da onların yeni sınırlar kodlama bölgesi olan cDNA parçaları yapılır. Yukarıdaki yöntemler daha karmaşık Y2H kütüphaneler accomodating yeteneğine sahip olduğu, biz yeni Y2H oluşturulan bir kütüphane akıcı 'av' plazmid vektörde göstermek için (pGal4AD) içeren Saccaromyces cerevisiae (zorlanma dan genomik DNA'ın parçaları PLY5725). Genomik DNA SacCer_TAB Y2H kitaplığı (Şekil 8) oluşturmak için adaptörler ile değiştirilmiş ve pGal4AD eklenen 600-1500 BP, aralıklar için seçilen kesme, boyutu tarafından parçalanmış. Kütüphanede sonra yalnız pTEF-GBD plazmid taşıyan PJ69-4A MATA örnekleri ayırmak için şeklindeki bir Maya nüfus üretilen PLY5725 dönüştü. Yinelenen diploit nüfus non-selektif ve seçici koşullar altında yetiştirilmiştir. Y2H plazmid kitaplığı ekler derin sıralama tarafından analiz edildi. Ne zaman 100 kapsayan genomik DNA eşlenen kan basıncı upstream ve downstream bölge (tüm genom % 84) desteği her protein bulduk > Maya ~1.35 milyon farklı kütüphanede bir tahmini toplam boyutu için kütüphanede 1.1 milyon farklı plazmid Plazmid. Bir karşılaştırma, biz de bir yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H Kütüphane11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H Kütüphane)'MATalpha Maya değiştirdi ve yukarıdaki gibi aynı analiz tabi. Rasgele parçası Maya Y2H Kütüphane karmaşıklığı çok daha yüksek ve çok daha fazla plazmidler her gen daha önceden yayınlanmış Kütüphane (Şekil 9) çerçeve parçaları kodlama vardı bulduk. Önemlisi, ilk Kütüphane diploit nüfus içeren nesil bir overdispersion çok tekrarlanabilir < 0,01 (Şekil 10). Ayrıca, iki ayrı Maya nüfus sahip tekrarlanabilirlik üretmek plazmid benzer yapılan sonra olumlu Y2H etkileşimleri için seçme 0,3 bir overdispersion verimli çok iyi oldu. Böylece, yöntemleri burada daha büyük Y2H kütüphaneler daha önce kullanılan daha yüksek karmaşıklık karşılamak.

DEEPN kolaylığı artırmak açısından, biz yapmak gen sentez kullanarak faiz yem protein için kodlama ekler tercih ederim. Bu Kodlayıcı bölgeler protein etki alanları, chimeras ve kolayca Y2H yem plazmid dahil olacak mutantlar için verir, ancak aynı zamanda onların kodon S. cerevisiaeifade için optimize sağlar. İki farklı Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon protein ifadesi Şekil 3' te gösterilmiştir. İki yem füzyon protein birini ifade iki farklı Maya transformants kurumlara ve SDS-sayfa ve anti-myc antikorlar ile immunoblotting tabi. Not ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı boş vektör yalnız göre yem proteinlerin seviyeleri. Bulduk sadece yem füzyon proteinin ifade doğrulamak için aynı zamanda ifade genişletmek ve av kitaplığı içeren Maya için dostum için kullanılan tam MATA Maya transformant koloni doğrulamak için önemlidir. Bir kez bir transformant tespit etti, aşağı dondur ve daha sonra kullanmak üzere saklamak mümkündür.

Şekil 4 nerede bir seri seyreltme diploit hücrelerinin kaplama CSM-Leu-Trp (+ onun), kendi kendine harekete geçirmek için bir test gösterir CSM-Trp-Leu-O'nun (-onun) ve CSM-Trp-Leu-onun + 3AT (-onun + 3AT) tabaklar ve 30 ° C'de 3 gün boyunca büyümeye izin. İstenilen sonuç büyüme gözlemlemektir varlığı ancak histidin bakılmaksızın yokluğu 3AT olduğunu. Bu CSM-Trp-Leu-O'nun için Maya olumlu Maya 2-hibrid etkileşim ile seçmek için kullanımına izin verir. CSM-Leu-Trp-O'nun plakalar üzerinde büyüme ise, o zaman bir Y2H seçim hala büyüme engeller 3AT en düşük konsantrasyon kullanılarak elde edilebilir. Biz büyüme CSM-Trp-Leu-O'nun + 0.1 mM 3AT bloke edilebilir, sonra DEEPN tahlil Y2H etkileşimleri için seçmek için bu durum kullanarak devam edebilirsiniz olduğunu bulmak. Ancak, pGal4AD veya diğer boş av plazmid ve pTEF GBD yem füzyon plazmid içeren diploitler büyüme inhibisyonu 3AT daha yüksek konsantrasyonlarda gerektiriyorsa, DEEPN yordam ve farklı yem plazmid performansını uzlaşma olacak alınmalı. Onun + büyüme pozitif Y2H etkileşimi için tek seçim olduğuna dikkat edin. Biz bu Y2H etkileşimleri toplu iş iş iş için zenginleştirmek için yeterli bulduk.

DEEPN iş akışı içinde en önemli yordamlardan birini Y2H av Kütüphane taşıyan MATalpha Maya ile yem plazmid taşıyan MATA Maya yüksek verim çiftleşme ulaşmaktır. Biz piyasada bulunan cDNA kitaplıkları konut bazı suşları (Örneğin, Y187)18, bulundu, nispeten yoksul çiftleşme verimlilik. Bu nedenle, biz Y2H kitaplıklar taşımak büyük bir yük mühendislik. Bu zorlanma BY4742, S288c bir türevi dayanmaktadır. Bu zorlanma GAL4, GAL80, TRP1, LEU2ve HIS3yoksun. Bir hibrid Gal4 protein ne de (Örneğin, LexA-VP16) farklı bir melez duyarlı yok gazetecilere içerir. Bunun yerine, Y2H kaynaklı His3 üretim kaynak belirli yem plazmid taşıyacak MATA zorlanma içinde yer alır. Bu sistem basitleştirir ve bir daha fazla esneklik aynı kitaplığı içeren MATalpha hücreler LexA-yem füzyon proteini ve LexA(UAS) -HIS3 muhabir veya Gal4-DBD-yem füzyon protein ve bir Gal4 ifade bir gerilme ile çiftleşmek için kullanabilirsiniz sağlar (UAS)-HIS3 muhabir.

Bir kez bir yem plazmid ve Kütüphane taşıyan diploit nüfus oluşturulur, onlar seyreltilmiş ve adil seçme koşullar altında her iki plazmid (Örneğin, CSM-Trp-Leu) veya plazmit ve olumlu Y2H etkileşim için büyümeye izin bu His3 üretim sürücüler (Örneğin, CSM-Leu-Trp-O'nun). İle başlayan bir evrimsel 'Bu darboğaz' önlemek için başlangıç nüfusun büyük miktarda pozitif Y2H etkileşimi için seçimden sonra sonuç nüfus çarpık önemlidir. Böylece, bizim yordamı 750 mL taze CSM-Leu-Trp-O'nun medya bu sorunu önlemek için yetiştirilmeye 500 mL diploit nüfus kültürünün dışında 20 mL kullanarak belirtir. PTEF-GBD ile yem plazmid olarak, biz bir turu seyreltme ve büyüme bilgilendirici bir popülasyon gelişmeye için yeterli olduğunu ortaya koymuştur. Daha önce farklı yem plazmid kullanarak, seyreltme ve büyüme, 750 mL, içine bir ilk 20 mL iki tur kullandık ve 75 mL sulandırılmış kültür bundan 2 mL doymuş. Şekil 6 Kütüphane ekler seçici olmayan koşullar altında yanı sıra birinci ve ikinci ardışık yuvarlak seyreltme ve büyüme seçici durumu için iki farklı yetiştirilen diploit nüfus için PCR güçlendirme sonuçlarını gösterir Plazmid yem. Seçim ile orada PCR ürünlerinin genelleştirilmiş bir smear parçaları karmaşık ve nispeten iyi normalleştirilmiş karışımı gösterge açıktır. Seçim, bu modeli, tek tek grup ayırt edilebilir böylece büyük ölçüde zenginleştirici bazı türler ile değiştirir. Bantlama bir ölçüde başarılı denemeleri defa yapılan normaldir, henüz bir karalama desen bir bantlama deseni yerine veya ek olarak av ekler karmaşık bir karışımı göstergesidir ve bir aday sayısı en üst düzeye çıkarmak istiyorsa arzu edilir DEEPN algılar. PCR ürünün en bulunduğu 1-3 bantlarında, çok güçlü bantlama deseni sıralama veri çoğunu yalnızca 1-3 av ekler tarafından hakim olacağını gösterir. Biri bunun için kısmen bu örnekten daha fazla okuma ithaf tarafından telafi edebilirsiniz. Bir nüfus seyreltilmiş ve daha fazla (bkz. Şekil 5' seçilen d2') yetiştirilen, bantlama deseni daha belirgin, belirli bir kaç av ise zayıf ama otantik Y2H etkileşimleri veriyor plazmid azalır bu av gösteren görebilirsiniz Plazmid onların bereket artmaktadır. Art arda gelen seyreltme ve büyüme bu aşırı düzeye ters potansiyel adaylar ve bu nedenle burada protokolü ile en büyük sayı yakalamak amacı için kabul, biz tavsiye seyreltme ve büyüme bir tur var olmak kullanılmış.

Figure 1
Şekil 1: iş akışının DEEPN şematik. Laboratuvar işlemleri genel hatları ile birlikte ilgili görevi tamamlamak için gereken yaklaşık zaman soldaki gösterilmiştir. Sağ tarafta, DEEPN ve Stat_Maker yazılım paketleri kullanarak Biyoinformatik akışıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: pTEF-GBD şematik. TRP1-düşük kopya Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon protein ifade plazmid içeren gösterilir. O şekil bir bünye TEF1 organizatörü, myc epitope etiketi, Gal4 DNA bağlayıcı etki T7 RNA polimeraz bağlama sitesi, polylinker ve PRM9 Sonlandırıcı bir şeması (CEN) içinde takip-plazmid dayalı. Bu plazmid da sefaloridin direnç ve çoğaltma ColE1 bakteriyel kökenli taşır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: ifade Gal4-yem füzyon proteinlerin. Lysates pTEF-GBD içinde ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanına erimiş farklı yem proteinler ifade Maya dan SDS-sayfa ve anti-myc antikorlar ile immunoblotting tabi tutuldu. pTEF-GBD sadece Gal4-DNA-bindng alan'ın yalnız ifade eder; pTEF-GBD-bait1 bir RhoA C-terminal prenilasyon sitesinde eksik ve bir mutasyon GTP bağlı uyum kilitleyerek konut için erimiş Gal4-DNA-bindng etki alanı ifade eder; pTEF-GBD-bait2 bir RhoA C-terminal prenilasyon sitesinde eksik ve bir GSYİH bağlı uyum kilitleyerek bir mutasyon konut için erimiş Gal4-DNA-bindng etki alanı ifade eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: kendi kendine harekete geçirmek test Belirtilen yem plazmid taşıyan PJ69-4A hücreleri ve PLY5725 hücreleri belirtilen av plazmid taşıyan yapılmış diploitler seri olarak seyreltilmiş ve CSM-Leu-Trp tabaklar, CSM-Leu-Trp-O'nun plakaları ve CSM benekli-Leu-Trp-onun + 3AT plakaları ve 3 gün için yetiştirilen 30 ° C Çiftleşme için kullanılan PJ69-4A transformants Şekil 3' te gösterilen her çifti ilk edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Y187 vs PLY5725 verimliliğini çiftleşme. PJ69-4A bir TRP1içeren arasında çiftleşme tepki-yem vektör ve Y187 veya PLY5725 taşıma av plazmid içeren gerçekleştirilen. 1:10,000 dilutions diploitler için seçmek için CSM-Trp-Leu üzerine kaplama. PLY5725 gerilme Y187 gerilme ~ 10 kat daha fazla kolonileri üretilen ile daha yüksek bir çiftleşme verimliliği gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: PCR av kitaplığı ekler. DNA diploit Maya seçici olmayan koşullarda (CSM-Leu-Trp medya) büyüdü bir av kitaplığı içeren yalıtılmış veya koşulları için bir olumlu Y2H etkileşim (CSM-Leu-Trp-O'nun medya) seçerek. PCR Kütüphane arasında seçili ekler repertuar farklılıkları ortaya ekler. İki tur seçime bağlı büyüme kullanılmıştır. Seçici CSM-Leu-Trp medya 750 mL ve seçici büyüme (d1) bir ilk turu için CSM-Leu-Trp-O'nun medya 750 mL içine başka bir 20 mL içine diploit kültür 500 mL 20 mL sulandrarak yapılan büyüme ilk turunda. Bu büyüme (d2) d1 kültür 2 mL alarak ve seçmeli medya 75 mL sulandrarak yapılan ek bir tur izledi CSM-Leu-Trp-O'nun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: karmaşıklık Y2H cDNA Kütüphanesi. Ticari olarak mevcut fare cDNA Y2H av kitaplıkları içerik analizi: cDNA fare beyin ve birden çok fare doku birinden bir kütüphaneden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: Y2H Maya genomik parça Kütüphanesi nesil. A. Maya genomik parçası Kütüphane şematik açıklayan derleme içine pGal4AD. Genomik DNA zorlanma PLY5725 rastgele nın yaşadığı belirtilen Y-adaptörler ile bakmaksızın ve SFII kesimli pGal4AD bakmaksızın. D verim 2.2 x 106 bağımsız kolonileri kombine ve onların plazmid DNA SacCer_TAB Y2H Kütüphane oluşturan yalıtım önce yetiştirilen bakterilere dönüştürülmüştür. B. LEU2-transkripsiyon harekete geçirmek etki alanı gösterilir Gal4 konut plazmid (pGal4AD) içeren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: Y2H Maya genomik Kütüphanesi karmaşıklığını. SacCer_TAB genomik Kütüphanesi PLY5725 MATalpha zorlanma ve PJ_C1, C2, C3 Maya genomik Kütüphanesi Υ187 ΜΑΤalpha süzün dönüştürülmüş oldu içine dönüştü. Bu nüfusun diploitler PJY69-4A zorlanma için çiftleşme tarafından yapılmıştır. Nüfus 10 nesiller için yetiştirilen ve PCR güçlendirilmiş av parçaları yüksek üretilen iş sıralama ve analiz için tabi tutuldu. A. okuma Maya genom sıralama tarafından bulundu gen başına bölünen Y2H kütüphanelerde okuma her gen başına rütbe sırasını gösterir. Her gen eşdeğer bolluğu göz önüne alındığında, her Gen 1 değeri olurdu. B. bölge (ORF) desteği protein ve uygun translasyonel okuma çerçevesi içinde bir parça encode benzersiz plazmid gen başına sayısını gösteren çubuk grafik. C. karşılaştırma Maya genler kodlamak farklı plazmidler her kütüphane sayısı ve oranı bu ve doğru translasyonel okuma çerçevesi içinde değildir veya geriye doğru eklenir. ö gösteren pozisyonları ve bereket için plazmidler her kitaplıkta bulunan örnek genler (VPS8 ve VPS16) eşleştirmek kavşak çizer. Plazmid doğru translasyonel okuma çerçevesi olan gen füzyon ile mavi atanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10: tekrarlanabilirlik karmaşık Y2H Maya genomik kütüphanesi ile DEEPN. A. dört farklı Maya diploit nüfus PLY5725 içinde yer alan, seçici olmayan koşullar altında yetiştirilen ve sıralı SacCer_TAB Y2H Kütüphane ile çiftleşme tarafından oluşturuldu. Okuma başına gen her nüfus için ayrı ayrı karşıdan karşıya tüm örneğin alınma olasılığını ortalama sipariş rütbe değeri bir fonksiyonu olarak çizilir. B. okuma gen olumlu Y2H etkileşimler için seçimden sonra iki örnek arasında başı gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada bir rehber en iyi duruma getirilmiş yöntemleri kullanarak toplu iş iş işlemde Y2H deneyleri gerçekleştirmeye ilişkin sağlamak. Halkın seçimi altında gelebileceğini söyledi Maya başlangıç Kütüphane temsilcisidir ve yeterli başlangıç Maya nüfusun bu değişkenliği sınırlamak için seçim geçmesi için kullanılan emin olmak için yordamda birkaç kritik adım vardır . Önemlisi, bu kriterler geleneksel bir Y2H yöntemi, böylece bu yaklaşım çoğu laboratuvarlar için standart moleküler biyoloji donatılmış erişilebilir yapmak için malzeme ve Yöntemler adapte yanı sıra elde nispeten kolaydır. DEEPN aynı av Kütüphane popülasyondan farklı yem plazmid kullanırken seçimi sağlar. Bu nedenle, bir yem vs. başka bir Y2H etkileşim üretmek etkileşen adayları kümesini doğrudan karşılaştırılabilir. Derin sıralama kullanıldığından, bir başlangıç Kütüphane kompozisyon her yem özel Maya nüfus için doğrulamak ve her aday av gen kütüphanede zenginleştirme bağımsız olarak izleyin. Toplu iş işleme aynı kitaplığa farklı yemler karşı bir istatistiksel sıralaması4hesaplamak sağlar yarı nicel bir şekilde sorgulama sağlar.

Bu protokol başarı için kritik olan birkaç adım vardır. Biri çok sayıda diploitler yeterli Y2H av Kütüphane gösterimi faiz her yem plazmid ile karıştırılır sağlamak için alınması gerekir. Burada açıklanan çiftleşme yordam parametreleri çeşitli değişen tarafından optimize edilmiştir. Kötü genel olarak, ancak ev ticari Y2H kütüphaneler dostum bazı suşları, 2 x 106- izlendiğinde, 2 x 107 diploitler burada anlatılan çiftleşme yordam oluşturabilirsiniz Y2H yeterli ve tekrarlanabilir transferini sağlayan bulduk nüfus kütüphaneye. Başka bir önemli bir özelliği, yordamı yem plazmid ilgi olumlu Y2H etkileşim, kendi oluşturmak değil veya boş Gal4 harekete geçirmek etki alanı ile plazmid av sağlamaktır. Y2H etkileşim seçme Yöntem onda olumlu Y2H etkileşim indükler hücreleri izin vermek için HIS3 , transkripsiyon histidin yokluğunda büyüme talep ediyor onun +. Geleneksel Y2H deneyleri arka plan büyüme azaltmak veya diğer gazetecilere3 , zayıf Y2H etkileşimleri içeren hücreleri büyüyebilir ne zaman en iyi bu yordamı çalışır ve böylece sıkılık büyüme için artan rekabet inhibitörü 3AT rutin ekleyebileceğiniz ve sadece güçlü Y2H etkileşimleri içeren hücreler için seçme belirlenebilir av plazmid repertuar sınırlar. Başka bir önemli bir özelliği başlangıç diploit nüfus büyük miktarda hata4 örnekleme evrimsel performans sorunlarını önlemek için seçici ve selektif olmayan koşullar altında büyümek için kullanılan emin olmaktır. Kültür birimleri ve hücre aşağıdaki numaraları burada belirtilen tekrarlanabilirlik sağlamak ve gürültü azaltmak yardımcı olacaktır.

DEEPN yaklaşım güçlü olmasının nedenlerinden kapsamlı bir şekilde onların yetenek faiz yem ile etkileşim için verilen AV kitaplığındaki tüm plazmid takip edebilirsiniz biri. Böylece, DEEPN sınırlamalar kullanılan kitaplık karmaşıklığı biridir. Biz kullanılan burada olanlar gibi ticari kütüphanelerin bazıları için iyi niyetli Gal4 harekete geçirmek etki alanı aynı okuma çerçevede olan ORF's 3-6 x 10 arasında cDNA parçaları kodlamak plazmid sayısını bulduk4 temsil ~ 6000 - 8,00 0 farklı genler. Biz yaklaşık %75 Bu kütüphanelerin yalnızca 3' kodlama DNA dizisi (CD/ORF) olduğunu cDNA bölgelere karşılık gelen parçaları içerdiği bulundu. Ayrıca, neredeyse üçte biri kütüphanede parçaları vardı genler bu bölgelere ORF veya ORF, ters yönde denk yoktu.

DEEPN yöntemine üç başka değişiklikler yapmış. Yeni bir MATalpha gerginlik, 'TRP1 plazmid ve o arkadaşları Y187 gibi bazı ticari olarak mevcut kütüphane içeren suşları daha iyi içinde yer alan kütüphaneler av' taşıyabilir biri. Bu ilgi her yem için Kütüphane nüfusun tam transferi sağlar. Ayrıca yeni bir 'değişken kopya 2µ tabanlı omurga10kullanın yukarıda açıklanan plazmid farklı ifade plazmid yem' yaptı. Burada biz bir düşük-kopya CEN plazmid (pTEF-GBD) tarif ve tek bir yuvarlak seçici büyüme bulmak için etkileşen av plazmid zenginleştirmek için yeterli. Son olarak, biz bir aerodinamik 'av' Kütüphane vektör inşa ve yüksek yoğunluklu parçası rasgele genomik Y2H Kütüphane Saccharomces cerevisiaeiçin hangi-meli var olmak içinde belgili tanımlık gelecek keşfetmek ve etkileşimleri amonst karakterize için yararlı üretmek için kullanılan maya proteinleri. Genel olarak, malzeme ve (eşlik eden çalışmalarında başlığı altında açıklanan) Biyoinformatik araçlarını gelişmeler, kapsamlı ve karşılaştırmalı Y2H ekranlar gerçekleştirme erişilebilir, uygun ve verimli bir şekilde yaklaşım DEEPN olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Biz personel içinde Enstitüsü, insan genetiği NGS Kütüphane hazırlık ve sıralama için teşekkür ederim. Einat Snir genomik Kütüphanesi parçaları burada yapılan Y2H plazmid Kütüphane için hazırlarken onun uzmanlık alanı için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir: NIH R21 EB021870-01A1 ve NSF araştırma projesi hibe: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

Biyokimya sayı: 136 Protein etkileşim yeni nesil DNA dizi analizi sıralama Maya 2-Hybrid
Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter