Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Genererer en Murine Orthotopic metastatisk brystkræft kræft Model og udfører Murine radikale mastektomi

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Vi indføre en murine orthotopic bryst kræft model og radikal mastektomi model med bioluminescens teknologi at kvantificere tumor byrden for at efterligne menneskelige bryst kræft progression.

Abstract

In vivo musemodeller at vurdere bryst kræft progression er afgørende for kræftforskning, herunder prækliniske stof udvikling. Men fleste af de praktiske og tekniske detaljer er almindeligt udeladt i udgivne manuskripter, som derfor gør det udfordrende for at reproducere modeller, især når det drejer sig om kirurgiske teknikker. Bioluminescens teknologi giver mulighed for evaluering af små mængder af kræftceller, selv når en tumor ikke er håndgribelig. Udnytte luciferase-udtrykker kræftceller, etablere vi et bryst kræft orthotopic podning teknik med en høj tumordannelse sats. Lunge metastaser vurderes udnytter en ex vivo -teknik. Vi så, opstille en mastektomi model med en lav lokale tilbagefald sats at vurdere metastatisk tumor byrde. Heri, beskriver vi, i detaljer, de kirurgiske teknikker til orthotopic implantation og mastektomi for brystkræft med en høj tumordannelse sats og lave lokale gentagelse satser, henholdsvis, for at forbedre bryst kræft model effektivitet.

Introduction

Dyremodeller spille en nøglerolle i kræftforskning. Når en hypotese er vist in vitro, bør det blive testet in vivo til at vurdere klinisk relevans. Kræft progression og metastaser er ofte bedre fanget af dyremodeller i forhold til in vitro-modeller, og det er vigtigt at teste et nyt lægemiddel i en dyremodel som en prækliniske undersøgelse for drug udvikling1,2. Men de tekniske detaljer vedrørende dyreforsøg er ofte ikke godt beskrevet i offentliggjorte artikler, at gøre det udfordrende at gengive modellen med succes. Faktisk gik forfatterne som etableret disse orthotopic podning og mastektomi modeller igennem lange og stringente processer af trial and error. Succesraten for tumordannelse efter kræft celle podning er en af de vigtigste faktorer til at bestemme succesen og effektiviteten af et dyr undersøgelse3. Cellelinie og antallet af celler, der skal podes, webstedet podning og stamme af mus er alle vigtige faktorer. Det er velkendt, at der er store variationer i resultaterne af dyreforsøg på grund af individuelle forskelle, i forhold til in vitro-teknikker. Derfor, ved hjælp af en veletableret model med en standard teknik er vigtigt at opnå stabile resultater, at forbedre effektiviteten af dyreforsøg, og at undgå vildledende resultater.

Denne hvidbog indeholder veletablerede teknikker4 for at generere breast cancer orthotopic og mastektomi musemodeller. Formålet med disse metoder er 1) til at efterligne menneskelige bryst kræft progression og behandlingsforløb og 2) til at gennemføre in vivo forsøg med større effektivitet og højere succesrate i forhold til andre bryst kræft podning eller mastektomi teknikker. I orthotopic kræft celle podning, for at efterligne menneskelige bryst kræft progression, vælger vi #2 brystkirtler fedt pad som en podning site, som er placeret i brystet. I de fleste af undersøgelserne, podes brystkræftceller subkutant5. Denne teknik kræver ikke operation, og dermed, det er simpelt og ligetil. Men, den subkutane mikromiljø er helt forskellig fra mælkekirtlen mikromiljø, hvilket resulterer i forskellige kræft progression og endda molekylære profiler6,7. Nogle undersøgelser bruges mælkekirtlen #4, som er placeret i maven, som en podning site6. Men da #4 mælkekirtlerne er placeret i maven, den mest almindelige metastatisk mønster er peritoneal carcinomatosis7, som opstår i forekommer med mindre end 10% af metastatisk brystkræft kræft8. Brystkræft genereret af teknikken præsenteret her, i mælkekirtlen #2 metastaserer til lunge, som er en af de mest almindelige brystkræft kræft metastatisk websteder9.

Med denne teknik er målet også at opnå en højere tumordannelse med minimal tumor størrelse variation i forhold til andre bryst kræft podning teknikker. For at gøre det, podes kræftceller suspenderet i en gelatinøse protein blanding under direkte udsyn gennem en median forreste brystet væg snit. Denne teknik giver en høj tumordannelse sats med mindre variation i tumorstørrelse og form i forhold til subkutan eller ikke-kirurgiske injektion, som tidligere rapporteret3,7.

Vi introducerer også en mus radikale mastektomi teknik hvor orthotopic bryst tumor resektion med det omgivende væv og aksil lymfeknuder. I de kliniske omgivelser er standarden for pleje af brystkræftpatienter uden at fjerne metastase sygdom mastektomi10,11. Før en mastektomi, er axillær lymfeknude metastaser overvåget af imaging og sentinel lymfeknude biopsi. Hvis der er ingen tegn på axillær lymfeknude metastase, behandles patienten derefter med en hel eller delvis mastektomi, hvori axillær lymfeknude resektion er udeladt. Samlede mastektomi er en teknik til at resect brystkræft med hele brystvævet blokoverførslen, delvis mastektomi er at resect brystkræft med en margin af omkringliggende normalt brystvæv kun, dermed bevare den resterende normale brystvæv i den patienten. Patienter, der bevarer resterende normale brystvæv efter en delvis mastektomi kræver imidlertid postoperativ strålebehandling at undgå lokal recidiv10. Patienter, der har axillær lymfeknude metastase foretage radikale mastektomi, som fjerner brystkræft med alle normale bryst væv og aksil lymfeknuder og invaderede væv en blok10,11. I musemodel er overvågning af axillær lymfeknude metastase og/eller postoperativ stråling ikke rimeligt eller gennemførlig. Dermed, vi udnytte den radikale mastektomi teknik for at undgå lokal eller axillær lymfeknude metastase.

Kræft celle inokulation via hale vene er den mest almindelige lunge metastase musen model12, den såkaldte "eksperimentelle metastase". Denne model er let at oprette og kræver ikke kirurgi; det dog ikke efterligne menneskelige bryst kræft progression, hvilket kan resultere i forskellige metastatisk sygdom adfærd. For at efterligne den menneskelige bryst kræft behandlingsforløb hvor metastase ofte opstår efter mastektomi, er den primære tumor fjernet efter orthotopic kræft celle podning. Denne teknik producerer mindre lokalt recidiv i forhold til simple tumor resektion, som tidligere rapporteret13, og er nyttig for romanen therapeutics, prækliniske undersøgelser, og metastatisk brystkræft kræft forskningsundersøgelser. De teknikker, der er beskrevet her er gældende for de fleste breast cancer orthotopic model eksperimenter. Det er dog vigtigt at overveje at gelatinøse protein blandingen kan påvirke mikromiljø og kirurgi kan påvirke stress/immun svar14. Efterforskere studerer mikromiljø og/eller stress/immunrespons bør derfor klar over potentialet confounding faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkendelse fra Roswell Park omfattende Cancer Center institutionelle Animal Care og brug udvalget blev opnået for alle eksperimenter.

Bemærk: Ni til tolv uger gamle kvindelige BALB/c mus er opnået. 4T1-luc2 celler, en mus brystkirtler adenocarcinom cellelinie stammer fra BALB/c-mus der er blevet manipuleret til at udtrykke luciferase, der bruges. Disse celler er kulturperler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% føtal bovint serum (FBS).

1. forberedelse af instrumenter

  1. Tø en frossen gelatinøse protein blanding (f.eks. Matrigel) på is i vævskultur hætte.
  2. Ren og autoklave to sæt kirurgiske instrumenter (microdissection saks, Adson pincet og en nål holder) forud for operationen. Forberede steriliseret 5-0 silke suturer og tør sterilant (når seriel operationer planlægges).
  3. Klip den midterste brystet hår af musene bruger en clipper og markere mus til identifikation af stansning øre før operationstidspunktet.
  4. Forberede tabellen procedure, som umiddelbart kan anvendes til drift.
    1. Sprede en absorberende puden og lave hjørnerne med tape, lave anæstesi næse kegler med tape, sætte sterilant og desinfektionsmiddel (chlorhexidin, jod og 75% ethanol) ved siden af betjeningsplads og placere mus i drift orden.

2. forberedelse af celler (for 10 mus)

Bemærk: Cellerne skal være podet inden for 1 time efter at være løsrevet fra parabol til undgå nedsat cellernes levedygtighed. Specifikt, bør cellesuspension blandes i gelatinøse protein blandingen indenfor 15 min efter afmontering celler fra fad til at opretholde deres levedygtighed.

  1. Kultur 4T1-luc2 celler, en mus brystkirtler adenocarcinom cellelinie udtrykker luciferase, RPMI 1640 medier med 10% FBS i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 5% CO2.
  2. Vaske de vedhængende 4T1-luc2 celler i en 10-cm parabol med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved hjælp af 10 mL serologisk pipette. Der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin ved hjælp af en P1000 pipette, og derefter inkuberes prøve ved 37 ° C i 5 min. Derefter tilsættes 4 mL af vækst medier (RPMI-1640 med 10% FBS) ved hjælp af en 5 mL serologisk afpipetteres og overføre cellesuspension til en 15 mL konisk slange i vævskultur hætte. Der centrifugeres cellesuspension ved 180 x g i 5 min.
  3. Opsug supernatanten og resuspend celler i 2 mL PBS; derefter tælle de celler ved hjælp af hemocytometer.
  4. Suspendere 2 x 106 4T1-luc2 celler i 40 μl koldt PBS (pH 7,4, 4 ° C) i vævskultur hætte.
  5. Bland 40-μL cellesuspension med 360 μL af geléagtige protein blandingen i en 1,5 mL microcentrifuge tube på is i vævskultur hætte.
    Bemærk: Den endelige koncentration er 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: gelatinøse protein blanding). For orthotopic modellen (ingen mastektomi), blev 1 x 104/20 μL af endelige koncentration brugt, at undgå at nå eutanasi kriterier (tumor størrelse > 2 cm) inden for to uger.

3. kræft celle podning

  1. At sætte mus i anæstesi induktion kammer med 2-4% isofluran og 0,2 L/min ilt flow indtil musene trække vejret roligt (2-3 min).
  2. Tag fat med musen og injicere 0,05 mg/kg buprenorphin i sin skulder subkutant.
  3. Bekræft passende anæstesi ved manglen reaktion på en tå knivspids. Indsæt den mus næse ind i boringen på musen maske, som tillader slimhindeirritation anæstesi med 2-4% isofluran og 2 L/min ilt flow knyttet til en trækul canister enhed.
  4. Dy musens lemmer ved hjælp af lab tape og sterilisere sin hud ved hjælp af klorhexidin, jod, og 75% ethanol, ved hjælp af bomuld svaberprøver.
  5. Gøre en 5 mm hud indsnit i midten af den forreste brystvæg udnytte sterile microdissection saks, lift til højre huden ved siden af snit og frigøre hud fra brystvæggen ved hjælp af saks, og derefter invertere huden til at udsætte højre #2 brystkirtler fedt pad.
  6. Omhyggeligt indsprøjtes 20 μL af kræft cellesuspension ved hjælp af en 1 mL insulin sprøjte med en 28,5 G kanyle ind i fedt pad under direkte udsyn gennem såret.
    Bemærk: Nålen går gennem sår, ikke huden. Holde holde nålen i den fedt pad for 5 s forudgående at trække det ud, som giver tid til gelatinøse protein blanding til at størkne.
  7. Luk hud indsnit ved syning, ved hjælp af steril 5-0 ikke-resorberbare suturer.
  8. Efter kirurgi, returnere dyr til et rent bur og overvåge dem, indtil de har tilbagebetalt og bevæger sig frit (efter ~ 1-2 min). Hvis et dyr ikke synes at være i godt helbred inden for 24 timer af kirurgi, administrere buprenorphin (0,2 mg/kg).
  9. Fjerne suturer under bedøvelse (Se trin 3.1) 7 d efter operationen.

4. mastektomi

Bemærk: Timingen af mastektomi er meget vigtigt. Hvis det sker for tidligt, forekommer ikke lunge metastaser. Hvis det sker for sent, har den primære tumor invaderet store blodkar, som gør en komplet oncologic resektion udfordrende. Således blev flere tidspunkter testet for mastektomi at bestemme hvilket tidspunkt produceret en passende balance i venter metastase før resektion blev også udfordrende. Efter gør det i over 50 mus eksperimenter, blev det påvist, at mastektomi 8 dage efter kræft celle podning (eller når tumorstørrelse når 5 mm) var ideelt gang punkt til at opnå, at afbalancere13.

  1. Bedøver en mus med 2-4% inhaleret isofluran og injicere buprenorphin (Se trin 3.1 og 3.2).
  2. Dy musen og sterilisere sin hud (Se trin 3,4).
  3. Gøre en 5 mm hud indsnit 2 mm til venstre fra kirurgisk arret, der blev gjort i den oprindelige kræft celle podning, ved hjælp af microdissection saks. Udvide indsnittet mod roden af forelimb at fjerne tumoren, huden herunder kirurgisk arret og læsion i kontakt med tumoren, samt axillær lymfeknude-bassinet, hvor det meste af tiden ingen synlige lymfeknude findes på tidspunktet for mastect Søren13. Sørg for ikke at skade den aksillær vene.
  4. Luk overfladefejl ved syning, ved hjælp af steril 5-0 ikke-resorberbare suturer i form af et "Y".
  5. Den samme som i trin 3.8, returnere musen til et rent bur og en skærm, indtil de har tilbagebetalt.
  6. Fjerne suturer under bedøvelse (Se trin 3.1) 7 dage efter operationen.

5. en bioluminescerende kvantificering af primær Tumor (Orthotopic podning uden mastektomi) eller lunge metastaser (mastektomi Model)

Bemærk: For primær tumor byrde kvantificering er bioluminescens målte 2 x en uge fra dag efter orthotopic podning. For lunge metastase kvantificering er bioluminescens målte 2 x en uge fra dag efter en mastektomi.

  1. Opløse D-luciferin i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) til en endelig koncentration på 15 mg/mL i en vævskultur hætte. Alikvot det ind i lyset-skærmet 1,5 mL microcentrifuge rør. Gemme den fortyndede opløsning ved-80 ° C.
    Bemærk: For en 20 g mus er 200 µL fortyndede D-luciferin påkrævet.
  2. Åbn imaging software og klik på Initialiser.
    Bemærk: Det tager ca 15 min til at køle beregning - sammen enhed (CCD). Når CCD når den indstillede temperatur, skifter farven på bar, temperatur fra rød til grøn.
  3. Bedøver mus med 2-4% isofluran i et dedikeret induktion kammer inden imaging (Se trin 3.1).
  4. Veje mus.
  5. Injicere 150 mg/kg D-luciferin intraperitoneal på midten maven, ved hjælp af en 28,5 G nål.
  6. Passe hver mus med en næse kegle inde billedbehandlingssystem i den liggende stilling (sted et maksimalt fem mus på samme tid). Opretholde anesthesia på 1-3% isofluran (i 100% ilt) gennem næsen kegler under imaging.
  7. Hent en afbildning hvert 5 min til at opdage peak bioluminescens for 50 min (eller op til bekræftede peak bioluminescens).
    1. Vælg Luminescence som Auto, Binning som Medium, og synsfelt som D.
    2. Klik på erhverve for at fange billedet.
  8. Returnere mus til deres cage(s) og overvåge dem, indtil de har tilbagebetalt (Se trin 3.8).

6. lunge metastase Tumor byrde kvantificering af Ex Vivo billeddannelse

Bemærk: Lunge metastase kvantificering er gældende for orthotopic podning både med og uden mastektomi modeller. I modellen mastektomi er ex vivo billeddannelse eller overlevelse observation valgt, afhængigt af formålet. I orthotopic podning (uden mastektomi) modellen producere de fleste tilfælde primær tumor størrelse eutanasi kriterier (> 2 cm) omkring 21 dage efter podning.

  1. Kvantificere lunge metastatisk læsioner 21 dage efter kræft celle podning af ex vivo billeddannelse.
  2. Bedøver mus med 2-4% isofluran i et dedikeret induktion kammer (Se trin 3.1).
  3. Veje mus.
  4. Injicere 150 mg/kg D-luciferin intraperitoneal (Se trin 5.6).
  5. Aflive mus af cervikal dislokation, 15 min efter injektioner.
  6. Åbn maven ved at skære huden og bughinde på midten maven, bruger buet Mayo saks. Udvide indsnittet til både højre og venstre. Trække ud leveren med pincet, indtil blænden er visualiseret; derefter skæres mellemgulvet.
  7. Ved hjælp af buede Mayo saks, klippe de bilaterale ribben fra caudad (12 ribben) til cephalad (1st ribben) at udsætte lungerne ved at vende den forreste thorax væggen.
  8. Identificere Bryst-spiserøret, som ligner en ledning, der forbinder lungerne på rygsøjlen, ved at løfte lungerne med pincet, og derefter skære spiserøret ved hjælp af microdissection saks.
  9. Løft bilaterale lungerne og hjertet ved hjælp af pincet (anvender trækkraft trækker ned, i retning af cephalad til caudad), og derefter skar luftrøret og større fartøjer til lunge apex på den cephalad, ved hjælp af microdissection saks.
    Bemærk: Dette giver mulighed for dyrkning af lunge- og hjerte fra kroppen.
  10. Fjern hjertet fra lungerne ved hjælp af microdissection saks.
  11. Sætte lungerne i en 10 cm petriskål.
  12. Fange bioluminescens billede (Se trin 5.7.1 og 5.7.2) 5 min efter eutanasi (20 min efter luciferin injektion).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med orthotopic modellen er at efterligne menneskelige kræft progression (dvs., væksten af den primære tumor efterfulgt af lymfeknude metastase og derefter fjerne lunge metastase)15. Efter kræft celle podning, bioluminescens er kvantificeret regelmæssigt (to til tre gange / uge) (figur 1A). Bioluminescens i lungerne er dybere og mindre end den primære læsion. Bioluminescens afspejler hovedsagelig den primære tumor byrde i levende mus3 (figur 1B og 1 C). Tumorstørrelse blev også målt ved caliper måling. Tumor volumen blev anslået ved hjælp af følgende ligning: volumen = (længde) x (bredden)2/2 (figur 1 d). Kvantificering af tumor byrde af bioluminescens og caliper måling viste lignende tendenser i de repræsentative resultater (figur 1B og 1 D); Vi stødte dog undertiden uoverensstemmelser. Vi antager, at kvantificere den primære tumor byrde udnytte bioluminescens er mere præcis i forhold til måling af tumor størrelsen af caliper når tumorstørrelse er mindre end 1,5 cm. Fordi det afspejler levedygtige kan kræftceller, selv et lille antal celler kan påvises ved bioluminescens, og kun kræftceller blive opdaget inde i tumor, ikke herunder infiltrerer immunceller eller omkring stromale celler3. Denne model er nyttig ved vurdering effekten af tumorregression medieret af anticancer narkotika og immunrespons3,7,16. Tumor byrden af lungemetastaser kan også kvantificeres af ex vivo billeddannelse i denne model (figur 1E); dog er begrænsningen, at musene skal aflives for at kvantificere metastatisk tumor byrden.

Formålet med mastektomi model er at 1) gengive standard for behandling af human brystkræft, som er kirurgisk fjernelse af primær tumor17, og 2) tillader den serielle kvantificering af metastatisk tumor byrde in vivo. Denne model er især nyttig i prækliniske studier af udviklingen af roman therapeutics13. Som tidligere udgivne, en Src hæmmer, AZD0530, som viste effektivitet i prækliniske mus model, men mislykkedes i et klinisk forsøg for brystkræftbehandling viste effektivitet i den primære læsion udnytter orthotopic podning uden mastektomi, men ikke i lunge metastase udnytte mastektomi model præsenteres her. Selvom anti-cancer medicin (f.eks. anthracyclines) er undertiden bruges hos mennesker som neoadjuverende behandling til behandling af primær brystkræft tumorer, bruges størstedelen af narkotika som adjuverende behandling hvor narkotika får efter operationen til at reducere risikoen for recidiv af behandling af klinisk målbart kræft eller som palliativ behandling af metastatisk kræft1,7,18. Således, denne mastektomi model blev etableret, som efterligner human behandling proces11.

Otte dage efter kræft celle podning, den primære tumor er kirurgisk fjernet (figur 2). Hvis du vil afprøve nogen af stof efficacies for metastatisk læsioner, bør det være administreres efter en mastektomi. Denne model giver mulighed for lunge metastatisk læsion kvantificering, såvel som hele kroppen metastatisk læsion kvantificering, så længe metastatisk tumor byrden har en påviselig bioluminescens udnytte in vivo billeddannelse. Forreste brystet væg lokalt recidiv rate er ganske lav. Vores erfaring var den lokale tilbagefald sats mindre end 5% i over 50 mus eksperimenter. Men hvis postoperative dag 1 bioluminescens overstiger 1.00E + 06 fotoner (10 x større end andre personer), der er en høj mulighed for en lokal resterende tumor13. Hvis der er rest kræftceller til stede, vises en håndgribelig tumor inden for to uger. Når der er en lokal resterende tumor, afspejler bioluminescens hovedsagelig at lokale gentagelse snarere end nogen metastatisk læsioner. Lokale resterende tumorer er kendt for at opfører sig meget anderledes end fjernt metastaser19; således, disse dyr med lokal recidiv (< 5% i vores erfaring) udelukkes fra enhver yderligere analyse. Denne mastektomi model giver også mulighed for serielle metastatisk tumor byrde overvågning uden at skulle aflive dyrene. Desuden, sådan en bioluminescerende overvågning kan bekræftes af ex vivo lunge metastase kvantificering. I stedet for at kvantificere lungemetastaser af ex vivo billeddannelse, således med til at aflive dyr, mus overlevelse efter kirurgisk behandling kan også blive overvåget som en oversætbare kliniske slutpunkt (figur 2D). Da der ingen primære læsion, mus ikke kan opfylde eutanasi tumor kriterier, der kan generelt defineres som en tumorstørrelse af > 2 cm eller sårdannelse af den primære tumor. I denne 4T1 mastektomi model døde alle mus inden for 60 dage efter kræft celle podning på grund af metastaser.

Figure 1
Figur 1: oversigt over orthotopic modellen uden mastektomi. (A) dette panel viser et tidsforløb af orthotopic model udnytte 4T1 syngeneic model. (B) dette panel viser hele kroppen bioluminescens af en orthotopic model, som hovedsagelig afspejler den primære tumor. Fejllinje angiver standardafvigelsen på middelværdien (n = 10). (C) dette panel viser serie billeder af hele kroppen bioluminescens (af den samme mus). Skalalinjen angiver 1 cm. (D) dette panel viser den faktiske tumorstørrelse af panelet B, målt ved calipre. Fejllinje angiver standardafvigelsen på middelværdien (n = 10). (E) dette panel viser lunge ex vivo bioluminescens billeder af 10 orthotopic modelmus (n = 10). Skalalinjen angiver 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: oversigt over modellens mastektomi. (A) dette panel viser et tidsforløb af at mastektomi model efter 4T1 orthotopic syngeneic implantation. Skalalinjen angiver 1 cm. (B) dette panel viser hele kroppen bioluminescens mastektomi model, som hovedsagelig afspejler metastatisk læsion. Fejllinje angiver standardafvigelsen på middelværdien (n = 10). (C) dette panel viser serie billeder af hele kroppen bioluminescens (af den samme mus). Udnytte ex vivo billeddannelse, blev det bekræftet at signalerne fra lunge metastase, og ingen lokale gentagelse blev bekræftet af hele kroppen imaging efter lunge fjernelse. Skalalinjen = 1 cm. (D) dette panel viser Kaplan-Meier overlevelse kurven for modellens mastektomi uden nogen narkotikabehandling. Mus blev aflivet da de nåede eutanasi kriterier med nogen sygelig tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For det sidste årti, har vi oprettelse af flere murine kræftmodeller, herunder breast cancer modeller3,7,13,16,20,21. Tidligere var vist vi at bryst kræft celle orthotopic podning i mælkekirtlen vævet under direkte udsyn produceret en større tumor med mindre størrelse variation i forhold til at indsprøjte celler omkring brystvorten uden et kirurgisk snit7 . Denne model er blevet forbedret ved at udnytte en cellesuspension i en gelatinøse protein blanding. Figurer af tumor genereret af geléagtige protein blanding-suspenderet celler var runde med mindre variabilitet, mens dem, der genereres af PBS-suspenderet celler blev spredt i mælkekirtlen3.

Vi yderligere bekræftet, at tumorer genereret af metoden kirurgisk orthotopic implantation præsenteres her meget udtrykte gener hvis interaktion netværk er vigtigt i kræft progression i forhold til dem, der genereres af ikke-kirurgiske eller subkutan injektion7. Disse resultater betyder, at denne model efterligner human brystkræft bedre sammenlignet med ikke-kirurgiske orthotopic eller subkutan implantation7. Vi viste også, at denne model er velegnet til at vurdere den immun-medieret regression af brystkræft ved hjælp af allogen afvisning3. Hud indsnit kan også forårsage betændelse omkring tumor14. Afhængigt af den hypotese, testet af investigator, er det derfor vigtigt at overveje betændelse som et muligt konfunderende faktor.

End den neoadjuverende indstilling, administreres størstedelen af systemiske behandlinger efter den primære bryst tumor er kirurgisk fjernet11. Til dato, evaluere størstedelen af prækliniske undersøgelser for udvikling af nye lægemidler drug svar i den primære tumor, men ikke i metastatisk læsioner1,18. Denne uoverensstemmelse mellem dyremodeller og menneskelige behandling er vigtig, fordi profilen gen af metastatisk læsioner er væsentligt forskellige fra dem af den primære læsion22, som har stor betydning for kræft biologi og behandling , især i æra af målrettede terapi22. Effekten af stof til adjuverende behandling bør derfor vurderes i metastatisk læsioner, ikke blot i den primære tumor. Vi kontrolleret timingen af lymfeknude og lunge metastase dannelsen efter orthotopic podning, udnytter 4T1 bryst kræft orthotopic model16. Vi viste også, at en resektion af den primære tumor forbedret overlevelse i den metastatisk brystkræft udnytte mastektomi model23. Dermed, vi forsøgte at etablere en mastektomi model efter orthotopic kræft celle implantation. Imidlertid blev lang tid brugt til at etablere denne lave lokale gentagelse model. Fordi kræftceller injiceres gennem kirurgisk snit, migrere kræftceller nemt ind i såret. Derudover invadere kræftceller væv i direkte kontakt med tumor, som de omkringliggende brystet væg muskel og hud. Kræftceller også metastaserer til aksil lymfeknuder uden at danne en synlig aksillær masse på tidspunktet for mastektomi. Mens at fjerne tumor kan være en lettere teknik, er gør så ikke oversættes til mastektomi bryst kræft behandling som det forårsager lokale gentagelse13. Således, denne "radikal mastektomi model" blev etableret for at fjerne alle kræftceller fra forreste brystvæg og axillær lymfeknude bassinet, som beskrevet i figur 2. Vi bekræftede lunge metastase af histologi og lunge ex vivo billeddannelse, og der var ingen lysende læsion stede af hele kroppen imaging efter lunge fjernelse. I denne 4T1 orthotopic model metastaserer kræftceller til sidst til lungerne, i alle tilfælde senest 21 dage. Men timingen af metastaser afhænger af den primære tumorstørrelse; således, mindre primær tumorstørrelse variation er vigtigt, at overvågning ikke blot den primære tumor, men også metastatisk tumor byrde. Ved hjælp af det gelatinøse protein blanding, kan tumor størrelse variation minimeres. Gelatinøse protein blandingen kan også påvirke tumor mikromiljø. Derfor, bør potentialet confounding faktorer forbundet med gelatinøse protein blandingen brug betragtes, afhængigt af hypotesen af investigator.

Udnytte disse teknikker og luciferase-udtrykker kræftceller mulighed for tumor byrde kvantificering med mindre måleusikkerhed, selv i ikke-håndgribelig tumorer. Der er to reporter systemer, en bioluminescerende og fluorescerende, at visualisere signaler med levende dyr. Mens det er blevet rapporteret, at signalet fra både bioluminescens og fluorescens kan være lys nok for kvantificering, når målet signal er meget lav, er baggrund signal af fluorescens højere, hvilket reducerer nøjagtigheden af analysen. Derimod er bioluminescens registreret med større nøjagtighed i et lavere signal med mindre baggrund indblanding24. Derfor, de fleste efterforskere foretrækker at bruge bioluminescens reporter systemer i levende dyr eksperimenter24,25. Tumor byrde kvantificering af bioluminescens har dog sine begrænsninger. Luciferase-udtrykker celler skinne når luciferin når kræftcellerne ved hjerte-kar-perfusion26. Hvis læsion har et område med hypoxi og/eller hypoperfusion, luciferin er ikke leveret til cellerne og bioluminescens værdi kunne, derefter målt til at være lavere end den faktiske tumor byrde. Faktisk har vi oplevet upassende bioluminescens kvantificering, når tumorstørrelse nåede mere end 1,5 cm. Vi antager, at det er på grund af den beskrevne hypoksiske og/eller hypoperfused tilstand. Således, når svulsten når en håndgribelig størrelse, tumor byrde er kvantificeret ved både bioluminescens og caliper måling. En vigtig begrænsning af bioluminescens kvantificering til at overveje, er den sorte pels af mus. Selv efter skind er fjernet, er der pigmentering på huden27. Mens bioluminescens kan påvises og kvantificeres i mus med sort pels, det er faldet, og derfor er det vigtigt at sammenligne mus i samme pels farve til hinanden for at nedbringe de forstyrrende virkninger af pels farve på en bioluminescerende kvantificering. Brugen af luciferase-udtrykker celler indeholder nogle unikke modaliteter for undersøgelse. For eksempel, kan secretable luciferase bruges til tumor byrde kvantificering af måle blod eller urin bioluminescens28. I modellen præsenteres her, direkte tumor byrde kvantificering af levedygtige kræftceller med levende dyr med ikke-secretable luciferase er enkle og ligetil, som ikke kræver indsamling af blod eller urin prøver.

Svarende til de modeller, som blev indført her, produktionen af en mere effektiv animalske eksperiment ved at producere en højere succesrate af tumordannelse med mindre variabilitet er nøglen til at vise resultaterne. I den nuværende model, når en investigator har lært teknikken, er det let at opnå en 100% tumordannelse sats. Vi opnåede også højere tumordannelse priser end de modeller, vi har indført; Plus, har vi etableret et kolon kræft orthotopic model udnytte cellesuspension i en gelatinøse protein blanding, sammen med bioluminescens teknologi at kvantificere tumor byrde21. Afslutningsvis giver dyremodel præsenteres her et passende murine model for at gennemføre kræft undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH grant R01CA160688 og Susan G. Komen Foundation Investigator indledt forskning tilskud (IIR12222224) til K.T. mus bioluminescens billeder blev erhvervet af delte ressource translationel Imaging delt ressource på Roswell Park Comprehensive Cancer Center, som blev støttet af kræft Center støtte Grant (P30CA01656) og delte Instrumentation grant (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
  2. Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
  3. Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
  4. Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
  5. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
  6. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  7. Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
  8. Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
  9. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  10. Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
  11. National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
  12. Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
  13. Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
  14. Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
  15. Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
  16. Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
  17. Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
  18. Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
  19. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
  20. Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
  21. Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
  22. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  23. Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
  24. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
  25. Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
  26. Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
  28. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  29. Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).

Tags

Medicin sag 141 mus brystkræft kræft model orthotopic syngeneic mastektomi metastase bioluminescens IVIS
Genererer en Murine Orthotopic metastatisk brystkræft kræft Model og udfører Murine radikale mastektomi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O.… More

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter