Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Genererer en Murine Orthotopic metastatisk brystkreft Cancer modell og utføre Murine radikale mastektomi

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Introduserer vi en murine orthotopic bryst kreft modell og radikale mastektomi modell med bioluminescens teknologi å kvantifisere svulst byrden å etterligne menneskelig bryst kreft progresjon.

Abstract

In vivo musen modeller for å vurdere bryst kreft progresjon er avgjørende for kreftforskning, inkludert prekliniske stoff utviklingen. Men utelates flertallet av praktisk-teknisk detaljene vanligvis i publiserte manuskripter som, derfor gjør det utfordrende for å reprodusere modellene, spesielt når det innebærer kirurgiske teknikker. Bioluminescens teknologi tillater for vurdering av små mengder kreftceller selv når en svulst ikke er håndgripelig. Bruker luciferase-uttrykke kreftceller, etablere vi en bryst kreft orthotopic inoculation teknikk med en høy tumorigenesis rate. Lunge metastasering vurderes utnytte en ex vivo teknikk. Vi deretter opprette en mastektomi modell med en lav lokale tilbakefall å vurdere metastatisk svulst byrden. Her beskriver vi, i detalj, kirurgiske teknikker for orthotopic implantasjon og mastektomi for brystkreft med en høy tumorigenesis hastighet og lav lokale gjentakelse priser, henholdsvis for å forbedre bryst kreft modell effektivitet.

Introduction

Dyremodeller spille en nøkkelrolle i kreftforskning. Når en hypotese er bevist i vitro, bør det bli testet i vivo å vurdere sin kliniske relevans. Kreft progresjon og metastasering er ofte bedre fanget av dyremodeller sammenlignet med i vitro modeller, og det er viktig å teste et nytt legemiddel i en dyremodell som en prekliniske studie for narkotika utvikling1,2. Men er de tekniske detaljene for dyreforsøk ofte ikke godt beskrevet i publiserte artikler, noe som gjør det utfordrende å reprodusere modellen vellykket. Faktisk gikk forfatterne som etablerte modellene orthotopic inokuleringen og mastektomi gjennom lang og grundig prosesser prøving og feiling. Suksessrate på tumorigenesis etter kreft cellen vaksinering er en av de viktigste faktorene å avgjøre suksess og effektiviteten av et dyr studere3. Cellen linjen og antall celler å vaksinere, vaksinering området og belastningen av mus er alle viktige faktorer. Det er velkjent at det er store variasjoner i resultatene av dyreforsøk på grunn av individuelle forskjeller, sammenlignet med i vitro teknikker. Derfor er bruker en veletablert modell med en standard teknikk viktig å få stabile resultater, forbedre effektiviteten i dyreforsøk og unngå villedende resultater.

Dette dokumentet gir veletablerte teknikker4 for å generere bryst kreft orthotopic og mastektomi musen modeller. Målet for disse metodene er 1) for å etterligne menneskelige bryst kreft progresjon og behandling kurs og 2) for å utføre i vivo eksperimenter med større effektivitet og høyere suksessrate sammenlignet med andre bryst kreft inoculation eller mastektomi teknikker. I orthotopic kreft cellen inoculation, for å etterligne menneskelige bryst kreft progresjon, velger vi #2 mammary fett puten som en inoculation site, som ligger i brystet. I de fleste studiene, brystkreft celler er inokulert subcutaneously5. Denne teknikken krever ikke kirurgi, og dermed er det enkel og grei. Subkutan microenvironment er imidlertid ganske ulik melkekjertlene microenvironment, som resulterer i forskjellige kreft progresjon og selv molekylær profiler6,7. Noen studier bruker melkekjertlene #4, som ligger i magen, som en inoculation området6. Siden #4 brystkjertlene ligger i magen, er imidlertid de vanligste metastatisk mønster peritoneal carcinomatosis7, som oppstår med mindre enn 10% av metastatisk brystkreft kreft8. Brystkreft generert av teknikken presentert her i melkekjertlene #2 metastasizes til lungene, som er en av de vanligste bryst kreft metastatisk nettsteder9.

Med denne teknikken er målet også å oppnå en høyere tumorigenesis rate med minimal tumor størrelse variasjon i forhold til andre bryst kreft inoculation teknikker. Gjør er kreftceller suspendert i en geléaktige proteinet blanding inokulert under direkte visjon gjennom en median fremre brystet veggen snitt. Denne teknikken gir en høy tumorigenesis rate med mindre variasjon i tumor størrelse og form i forhold til subkutan eller ikke-kirurgisk injeksjon, tidligere rapportert3,7.

Vi introduserer også en mus radikale mastektomi teknikk der orthotopic brystet svulsten resected med omkringliggende vev og axillaris lymfeknuter. I klinisk setting er standarden på omsorg for brystkreftpasienter uten fjernt metastasering sykdom mastektomi10,11. Før en mastektomi, er axillaris lymph node metastasering undersøkt av bildebehandling og sentinel lymfeknute biopsi. Hvis det er ingen bevis for axillary lymph node metastasering, behandles deretter pasienten med en total eller delvis mastektomi, der axillaris lymfeknute reseksjon er utelatt. Totalt mastektomi er en teknikk for å resect brystkreft med hele brystvev en bloc mens delvis mastektomi til resect brystkreft med en margin på rundt normal brystvevet, dermed spare gjenværende normal brystvevet i den pasient. Pasienter som bevare igjen vanlige brystvevet etter en delvis mastektomi krever imidlertid postoperativ strålebehandling å unngå lokale gjentakelse10. Pasienter som har axillaris lymph node metastasering gjennomføre radikale mastektomi som fjerner brystkreft med alle normal bryst vev og aksillær lymfeknuter og invaderte vev en blokk10,11. I musemodell er overvåking for axillary lymph node metastasering og/eller post-operativ stråling ikke fornuftig eller gjennomførbart. Dermed kan bruke vi radikale mastektomi teknikken for å unngå lokale eller axillaris lymph node metastasering.

Kreft cellen inoculation via hale venen er den vanligste lunge metastasering mus modell12, såkalte "eksperimentelle metastasering". Denne modellen er lett å generere og krever ikke operasjonen. men det ikke etterligne menneskelig bryst kreft progresjon som kan resultere i forskjellige metastaser atferd. For å etterligne menneskelige bryst kreft behandling kurset der metastasering skjer ofte etter mastektomi, fjernes den primære svulsten etter orthotopic kreft cellen vaksinering. Denne teknikken gir mindre lokale gjentakelse sammenlignet med vanlig svulst resection, som tidligere rapportert13, og er nyttig for romanen therapeutics, preklinisk studier, og for metastatisk brystkreft kreft forskningsstudier. Teknikkene som beskrives her gjelder for de fleste bryst kreft orthotopic modell eksperimenter. Det er imidlertid viktig å tenke at geléaktige protein blandingen kan påvirke microenvironment og kirurgi kan påvirke stress/immun respons14. Derfor bør etterforskere studere i microenvironment og/eller stress/immunrespons være klar over potensielle confounding faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenning fra Roswell Park omfattende Cancer Center institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ble oppnådd for alle eksperimenter.

Merk: Ni til tolv uker gamle kvinnelige BALB/c mus er oppnådd. 4T1-luc2 celler, en mus mammary adenocarcinoma cellen linje fra BALB/c mus som er konstruert for å uttrykke luciferase, brukes. Disse cellene er kultivert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS).

1. forberedelse av instrumenter

  1. Tine en frossen gelatin proteinet blanding (f.eks Matrigel) på is i vev kultur hette.
  2. Rengjør og autoklav to sett av kirurgiske instrumenter (microdissection saks, Adson tang og en nål holder) før kirurgi. Forberede sterilisert 5-0 silke suturer og tørr sterilisering (når føljetong operasjoner planlegges).
  3. Hefte håret i midten bryst av mus med en clipper og merke mus for identifikasjon av punching øret før kirurgi.
  4. Klargjør tabellen prosedyren, som kan bli brukt for operasjonen.
    1. Spre en absorberende puten og fikse hjørnene med tape, fikse anestesi nesen kjegle med tape, sette sterilisering og desinfeksjonsmidler (chlorhexidine, jod og 75% etanol) ved drift plass og plassere mus for operasjonen.

2. utarbeidelse av celler (for 10 mus)

Merk: Cellene skal være inokulert innen 1 time etter blir løsrevet fra retten å unngå redusert celle levedyktighet. Spesielt skal celle suspensjon blandes inn i geléaktige protein blandingen innen 15 min etter frakobling cellene fra retten å opprettholde sin levedyktighet.

  1. Kultur 4T1-luc2 celler, en mus mammary adenocarcinoma cellen linje uttrykke luciferase, i RPMI 1640 medier med 10% FBS i en fuktet inkubator på 37 ° C i 5% CO2.
  2. Vask tilhenger 4T1-luc2 cellene i en 10 cm rett med fosfat-bufret saltvann (PBS) bruker en 10 mL serologisk pipette. Legg 1 mL av 0,25% trypsin bruker en P1000 pipette og deretter ruge prøven ved 37 ° C i 5 minutter. Legg deretter til 4 mL vekst medier (RPMI-1640 med 10% FBS) bruker en 5 mL serologisk Pipetter og overføre celle suspensjon til et 15-mL konisk rør i vev kultur hette. Sentrifuge celle suspensjon 180 x g i 5 min.
  3. Sug opp nedbryting og resuspend cellene i 2 mL PBS; deretter telle celler ved hjelp av hemocytometer.
  4. Avbryte 2 x 106 4T1-luc2 celler i 40 μL kaldt PBS (pH 7.4, 4 ° C) vev kultur panseret.
  5. Bland 40-μL celle suspensjon med 360 μL geléaktige protein blandingen i en 1,5 mL microcentrifuge rør på is i vev kultur panseret.
    Merk: Siste konsentrasjonen er 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: geléaktige proteinet blanding). For den orthotopic modellen (ingen mastektomi), ble 1 x 104/20 μL av siste konsentrasjonen brukt, unngå nå euthanasia kriterier (tumor størrelse > 2 cm) innen to uker.

3. kreft cellen vaksinering

  1. Plassere musene i anestesi induksjon kammeret med 2-4% isoflurane og 0.2 L/min oksygen flyt til mus puste rolig (2-3 min).
  2. Hold musen og injisere 0,05 mg/kg buprenorfin i sin skulder subcutaneously.
  3. Bekreft tilstrekkelig anestesi ved mangel på reaksjon på tå knipe. Sett inn musen er nesen i hullet musen masken, som lar inhalasjon-anestesimiddel anestesi med 2-4% isoflurane og 2 L/min oksygen knyttet til en trekull canister enhet.
  4. Holde musen er lemmer med lab tape og sterilisere huden chlorhexidine, jod og 75% etanol, bruke bomull vattpinner.
  5. Gjøre en 5 mm huden snitt i fremre brystveggen utnytte sterilt microdissection saks, løft høyre-hud ved innsnitt løsner huden fra brystveggen ved hjelp av saks og deretter Inverter huden til å eksponere til høyre #2 mammary fett pad.
  6. Nøye injisere 20 μL kreft cellen hjuloppheng med en 1 mL insulinsprøyte med en 28,5 G nål inn i fett pute under direkte visjon gjennom såret.
    Merk: Nålen går gjennom såret, ikke huden. Hold holde nålen i fett puten for 5 s før trekke det ut, som gir tid til geléaktige proteinet blanding for å stivne.
  7. Lukke snittene huden av stitching, bruker sterilt 5-0 ikke-absorberbare suturer.
  8. Etter operasjonen tilbake dyrene til en ren bur og overvåke dem før de har gjenopprettet og flytter fritt (etter ~ 1-2 min). Hvis et dyr ikke synes å være i god helse innen 24 timer av kirurgi, administrere buprenorfin (0,2 mg/kg).
  9. Fjerne bildet under anestesi (se trinn 3.1) 7 d etter operasjonen.

4. mastektomi

Merk: Tidspunktet for mastektomi er svært viktig. Hvis det gjøres for tidlig, oppstår ikke lunge metastasering. Hvis det er gjort for sent, har den primære svulsten invadert store blodkar, noe som gjør en komplett oncologic resection utfordrende. Dermed ble flere tidspunkt testet for mastektomi å avgjøre hvilke punkt produsert den riktige balansen i venter metastasering før resection ble for utfordrende. Etter dermed over 50 musen eksperimenter ble det vist at mastektomi på 8 dager etter kreft cellen inoculation (eller når tumor størrelse når 5 mm) var ideelt tid punkt å oppnå som balanse13.

  1. Bedøve en mus med 2-4% inhalert isoflurane og injisere buprenorfin (se trinn 3.1 og 3.2).
  2. Holde musen og sterilisere huden (se trinn 3.4).
  3. Gjør en 5 mm huden snitt 2 mm til venstre fra kirurgisk arr som ble gjort på første kreft cellen inoculation, ved hjelp av microdissection saks. Utvide innsnitt mot roten av forlemen å fjerne svulsten, huden inkludert kirurgisk arr og lesjonen kontakt med svulsten, samt axillaris lymfeknute bassenget der mesteparten av tiden ingen synlige lymfeknute finnes ved mastect omy13. Sørg for ikke å skade axillaris venen.
  4. Lukke hud defekter ved søm, bruker sterilt 5-0 ikke-absorberbare suturene i form av en "Y".
  5. Det samme som i trinn 3.8, returnerer musen til en ren bur og skjermen før de har gjenopprettet.
  6. Fjerne bildet under anestesi (se trinn 3.1) 7 dager etter operasjonen.

5. bioluminescent kvantifisering av den primære svulsten (Orthotopic Inoculation uten mastektomi) eller lunge metastasering (mastektomi modell)

Merk: For primære svulst byrden kvantifisering er bioluminesens målt 2 x en uke fra dagen etter orthotopic inoculation. For lunge metastasering kvantifisering er bioluminesens målt 2 x en uke fra dagen etter mastektomi.

  1. Oppløse D-luciferin i Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) til en siste konsentrasjon av 15 mg/mL i vev kultur hette. Aliquot det til lys skjermede 1,5 mL microcentrifuge rør. Lagre utvannet løsningen på-80 ° C.
    Merk: 20 g mus er 200 µL av utvannet D-luciferin nødvendig.
  2. Åpne tenkelig programvare og klikk initialisere.
    Merk: Det tar ca 15 min avkjøles kostnad - sammen enhet (CCD). Når med CCD når innstilte, endres fargen på baren temperatur fra rød til grønn.
  3. Bedøve mus med 2-4% isoflurane i en dedikert induksjon kammer før imaging (se trinn 3.1).
  4. Veie musene.
  5. Injisere 150 mg/kg D-luciferin intraperitoneally på midten av magen, bruker en 28,5 G nål.
  6. Passe hver mus med en forpart inne tenkelig systemet i supine posisjon (stedet maksimalt fem mus samtidig). Opprettholde anestesi på 1% - 3% isoflurane (i 100% oksygen) gjennom nesen koner under bildebehandling.
  7. Ta et bilde hvert 5 minutt for å oppdage peak bioluminesens i 50 minutter (eller til bekreftet peak bioluminesens).
    1. Velg Luminescence som Auto, Binning som Mediumog synsfelt som.
    2. Klikk Hent for å lagre avbildningen.
  8. Overvåke dem før de har gjenopprettet (se trinn 3.8) hjem mus til deres cage(s).

6. lunge metastasering svulst byrden kvantifisering av Ex Vivo tenkelig

Merk: Lunge metastasering kvantifisering gjelder orthotopic inoculation både med og uten mastektomi modeller. I mastektomi modellen, er ex vivo imaging eller overlevelse observasjon valgt, avhengig av formålet. Orthotopic vaksinasjon (uten mastektomi) modell produsere de fleste tilfeller primære svulst størrelse euthanasia kriterier (> 2 cm) ca 21 dager etter vaksinasjon.

  1. Kvantifisere lunge metastatisk lesjoner 21 dager etter kreft cellen inoculation av ex vivo bildebehandling.
  2. Bedøve mus med 2-4% isoflurane i en dedikert induksjon kammer (se trinn 3.1).
  3. Veie musene.
  4. Injisere 150 mg/kg D-luciferin intraperitoneally (se trinn 5.6).
  5. Euthanize musene av cervical forvridning, 15 min etter injeksjoner.
  6. Åpne magen ved å kutte huden og peritoneum på midten av magen, med buet Mayo saks. Utvide snittet til både høyre og venstre. Trekk ut leveren med tang til membranen er visualisert; deretter klippet mellomgulvet.
  7. Ved hjelp av buet Mayo saks, kuttet bilaterale ribbeina fra caudad (12 ribbeina) til cephalad (1 ribbeina) å avsløre lungene ved å bla fremre thorax veggen.
  8. Identifisere thorax esophagus, som ser ut som en ledning som kobler lungene til ryggraden, ved å løfte lungene ved hjelp av pinsett og deretter klippet esophagus ved hjelp av microdissection saks.
  9. Løft bilaterale lungene og hjertet ved hjelp av pinsett (bruker trekkraft trekke ned, i retning av cephalad til caudad), og deretter kutte trachea og store fartøy til lunge toppen på den cephalad, med microdissection saks.
    Merk: Dette gir isolasjon av lungene og hjertet fra kroppen.
  10. Fjerne hjertet fra lungene med microdissection saks.
  11. Innlegge en 10 cm Petriskål lungene.
  12. Lagre bioluminescens avbildningen (se trinn 5.7.1 og 5.7.2) 5 min etter euthanasia (20 min etter luciferin injeksjon).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med den orthotopic modellen er å etterligne menneskelige kreft progresjon (dvs., veksten av den primære svulsten etterfulgt av lymph node metastasering og deretter fjerne lunge metastasering)15. Etter kreft cellen inoculation, bioluminesens er kvantifisert regelmessig (to til tre ganger / uke) (figur 1A). Bioluminesens i lungene er dypere og mindre enn primære lesjonen. Bioluminesens gjenspeiler hovedsakelig primære svulst byrden i levende mus3 (figur 1B og 1 C). Tumor størrelse ble også målt ved caliper måling. Svulst volumet ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: volum = (lengde) x (bredde)2/2 (figur 1 d). Kvantifisering av svulst byrden av bioluminescens og caliper målingen viste lignende trender i representant resultatene (figur 1B og 1 D); men oppdaget vi noen ganger avvik. Vi antar at kvantifisere primære svulst byrden utnytte bioluminescens er mer nøyaktig i forhold til måle svulst størrelsen av caliper når svulst er mindre enn 1,5 cm. Fordi det gjenspeiler levedyktig kan kreftceller, selv et lite antall celler kan oppdages av bioluminescens, og bare kreftceller oppdages i svulsten, ikke inkludert infiltrere immunceller eller omkringliggende stromal celler3. Denne modellen er nyttig i å vurdere effekten av tumor regresjon formidlet av anti-kreft narkotika og immunreaksjoner3,7,16. Svulst byrden av lunge metastaser kan også være kvantifisert ved ex vivo imaging i denne modellen (figur 1E); begrensningen er imidlertid at mus må være euthanized for å kvantifisere metastatisk svulst byrden.

Formålet med mastektomi modellen er 1) reprodusere standard behandling av menneskelige brystkreft, som er kirurgisk fjerning av den primære svulsten17, og 2) tillate den serielle kvantifiseringen av metastatisk svulst byrden i vivo. Denne modellen er spesielt nyttig i preklinisk studiet av utviklingen av romanen therapeutics13. Som er publisert tidligere, viste en Src inhibitor, AZD0530, som viste effekt i preklinisk mus modell, men mislyktes i en klinisk studie for brystkreft behandling effekt i primære lesjonen utnytte orthotopic inoculation uten mastektomi, men ikke i lunge metastasering utnytte mastektomi modellen presentert her. Selv om anti-kreft narkotika (f.eks antracykliner) brukes noen ganger mennesker som neoadjuvant terapi for å behandle primære brystkreft svulster, brukes de aller fleste av narkotika som adjuvant behandling der narkotika gis etter operasjonen for å redusere risikoen for tilbakefall av behandling av klinisk undetectable kreft eller som palliativ behandling for metastatisk kreft1,7,18. Derfor ble denne mastektomi modellen etablert, som etterligner menneskelig behandling prosess11.

Åtte dager etter kreft cellen inoculation, den primære svulsten er kirurgisk fjernet (figur 2). For å teste noen av stoffet efficacies for metastatisk lesjoner, bør det være administreres etter mastektomi. Denne modellen tillater lunge metastatisk lesjon kvantifisering, samt hele kroppen metastatisk lesjon kvantifisering, så lenge metastatisk svulst byrden har en synlig bioluminescens utnytte i vivo bildebehandling. Fremre brystet veggen lokale tilbakefall er ganske lav. I vår erfaring var lokale tilbakefall mindre enn 5% over 50 mus eksperimenter. Men hvis postoperativ dag 1 bioluminesens overskrider 1.00E + 06 fotoner (10 x større enn andre personer), er det en stor mulighet for en lokal gjenværende svulst13. Hvis det er rest kreftceller, vises en håndgripelig svulst innen to uker. Når det er en lokal gjenværende svulst, gjenspeiler bioluminesens hovedsakelig den lokale gjentakelsen i stedet for noen metastatisk lesjoner. Lokale gjenværende svulster er kjent for å oppføre seg meget annerledes enn fjernmetastaser19; dermed disse dyrene med lokale gjentakelse (< 5% i vår erfaring) skal ekskluderes fra noen ytterligere analyse. Denne mastektomi modellen kan også seriell metastatisk svulst byrden overvåking uten å avlive dyrene. Videre kan slik bioluminescent overvåking bekreftes av ex vivo lunge metastasering kvantifisering. I stedet for kvantifisere lunge metastaser av ex vivo bildebehandling, dermed har å avlive dyrene, mus overlevelse etter kirurgisk behandling kan også bli overvåket som en oversettbare klinisk endepunkt (figur 2D). Siden det er ingen primære lesjon, mus kan ikke møte euthanasia svulst kriterier som er generelt definert som en svulst størrelse > 2 cm eller sår på den primære svulsten. I dette 4T1 mastektomi modell døde alle mus innen 60 dager etter kreft cellen inoculation på grunn av metastasering.

Figure 1
Figur 1: oversikt over orthotopic modellen uten mastektomi. (A) dette panelet viser en gang løpet av orthotopic modellen bruker 4T1 syngeneic modellen. (B) dette panelet viser hele kroppen bioluminesens av en orthotopic modell som hovedsakelig gjenspeiler den primære svulsten. Feilen baren angir standard feil av gjsnitt (n = 10). (C) dette panelet viser serielle bilder av hele kroppen bioluminesens (av samme musen). Baren skala angir 1 cm. (D) dette panelet viser den faktiske svulst størrelsen på panelet B, målt ved calipers. Feilen baren angir standard feil av gjsnitt (n = 10). (E) dette panelet viser lunge ex vivo bioluminescens bilder 10 orthotopic modell mus (n = 10). Baren skala angir 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: oversikt over mastektomi modellen. (A) dette panelet viser en gang løpet av mastektomi modell etter 4T1 orthotopic syngeneic implantasjon. Baren skala angir 1 cm. (B) dette panelet viser hele kroppen bioluminesens av mastektomi modellen, som hovedsakelig gjenspeiler metastatisk lesjon. Feilen baren angir standard feil av gjsnitt (n = 10). (C) dette panelet viser serielle bilder av hele kroppen bioluminesens (av samme musen). Utnytte ex vivo bildebehandling, ble det bekreftet at signalene var fra lunge metastasering, og ingen lokale gjentakelse ble bekreftet av hele kroppen avbildning etter lunge fjerning. Skala bar = 1 cm. (D) dette panelet viser Kaplan-Meier overlevelse kurven av mastektomi modellen uten noen behandling. Mus var euthanized da de nådde euthanasia kriterier med noen sykelig tilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For det siste tiåret, har vi vært å etablere flere murine kreft modeller, inkludert bryst kreft modeller3,7,13,16,20,21. Tidligere har vist vi at bryst kreft celle orthotopic inoculation inn i melkekjertlene vevet under direkte visjon produsert en større svulst med mindre størrelse variasjon i forhold til injisere cellene rundt brystvorten uten en kirurgisk snitt7 . Denne modellen har blitt forbedret på ved å bruke en celle suspensjon i en geléaktige protein blanding. Former av svulsten generert av geléaktige protein blanding-suspendert cellene var runde med mindre variasjon, mens de generert av PBS-suspendert celler ble spredt i melkekjertlene3.

Vi ytterligere bekreftet at svulstene generert av kirurgisk orthotopic implantasjon metoden presenteres her svært uttrykt gener som samhandling er viktig i kreft progresjon sammenlignet med de generert av ikke-kirurgisk eller subkutan injeksjon7. Disse funnene bety at denne modellen etterligner menneskelige brystkreft bedre sammenlignet med ikke-kirurgisk orthotopic eller subkutan implantasjon7. Vi har også vist at denne modellen er egnet til å evaluere immun-mediert regresjon av brystkreft med allogenic avvisning3. Men kan huden snitt også forårsake betennelse rundt tumor14. Derfor, avhengig av hypotesen testet av etterforskeren er det viktig å vurdere betennelse som en mulig forvirrende faktor.

Enn i neoadjuvant innstilling, administreres det store flertallet av systemiske terapi etter primære brystet svulsten er kirurgisk fjernet11. Dags dato, evaluere flertallet av prekliniske studier for utvikling av nye medisiner narkotika-respons i den primære svulsten, men ikke i metastatisk lesjoner1,18. Dette avviket mellom dyremodeller og menneskelig behandling er viktig fordi genet profilen av metastatisk lesjonene er signifikant forskjellig fra de av av primære lesjon22, som har viktige implikasjoner for kreft biologi og behandling , spesielt i tid med målrettet terapi22. Derfor bør effekten av stoffet for adjuvant behandling vurderes i metastatisk lesjoner, ikke bare i den primære svulsten. Vi bekreftet tidspunktet for lymfeknute og lunge metastasering dannelsen etter orthotopic inoculation, utnytte 4T1 bryst kreft orthotopic modell16. Vi har også vist at en fjerning av den primære svulsten bedre overlevelse i metastatisk brystkreft utnytte mastektomi model23. Derfor prøvde vi å etablere en mastektomi modell etter orthotopic kreft cellen implantasjon. Imidlertid ble lenge brukt til å etablere denne lav lokale gjentakelse modellen. Fordi kreftceller er injisert gjennom kirurgisk snitt, migrere lett kreftceller i såret. I tillegg invadere kreftceller vev i direkte kontakt med svulsten, som omkringliggende brystmuskel og hud. Kreftceller også metastase å axillaris lymfeknuter uten danner en synlig axillaris masse ved mastektomi. Fjerne svulsten kan være en enklere teknikk, er gjør så ikke oversettbare til mastektomi i brystkreft behandling som det skaper lokale gjentakelse13. Derfor ble denne "radikale mastektomi modell" etablert for å fjerne alle kreftcellene fra fremre brystveggen og axillaris lymfeknute bassenget, som beskrevet i figur 2. Vi bekreftet lunge metastasering histology og lunge ex vivo bildebehandling, og det var ingen skinnende lesjon stede av hele kroppen tenkelig etter lunge fjerning. I denne 4T1 orthotopic modellen metastase kreftceller til slutt å lungene, i alle tilfeller innen 21 dager. Men avhenger tidspunktet for metastasering av den primære svulsten størrelsen; dermed mindre primære tumor størrelse er variasjon viktig for overvåking ikke bare den primære svulsten, men også metastatisk svulst byrden. Ved å bruke geléaktige protein blandingen, kan tumor størrelse variasjon minimeres. Imidlertid kan geléaktige protein blandingen også påvirke svulst microenvironment. Derfor anses potensialet confounding faktorer forbundet med geléaktige protein blanding bruk, avhengig av hypotesen om etterforskeren.

Utnytte disse teknikker og luciferase-uttrykke kreftceller tillater svulst byrden kvantifisering med mindre måling feil, selv i ikke-opplagt svulster. Det er to reporter systemer, bioluminescent og lysstoffrør, visualisere signalene i levende dyr. Mens det har blitt rapportert at signalet bioluminescens og fluorescens kan være lys nok for kvantifisering, når målet signalet er svært lav, er bakgrunn signal om fluorescens høyere, noe som reduserer nøyaktigheten av analysen. Derimot registreres bioluminescens med større nøyaktighet på et svakere signal med mindre bakgrunnen forstyrrelser24. Følgelig de fleste etterforskere foretrekker å bruke bioluminescens reporter systemer i levende dyr eksperimenter24,25. Men har svulst byrden kvantifisering av bioluminescens sine begrensninger. Luciferase-uttrykke celler skinne når luciferin når kreftceller av hjerte perfusjon26. Hvis lesjonen har et område av hypoksi og/eller hypoperfusion, luciferin blir ikke levert til cellene og bioluminesens verdien kan deretter bli målt for å være lavere enn den faktiske svulst byrden. Faktisk har vi opplevd upassende bioluminescens kvantifisering når tumor størrelse nådd mer enn 1,5 cm. Vi antar at det er på grunn av beskrevet hypoxic og/eller hypoperfused tilstand. Dermed når svulsten når en håndgripelig størrelse, er svulst byrden kvantifisert både bioluminescens og caliper måling. En viktig ANSVARSBEGRENSNING bioluminescens kvantifisering vurdere er svart pelsen av mus. Selv etter pelsen er fjernet, er det pigmentering i huden27. Mens bioluminescens kan oppdages og kvantifisert i mus med sort pels, det er redusert, og det er derfor viktig å sammenligne mus med samme pels farge til hverandre for å redusere forvirrende effekten av fur fargen på bioluminescent kvantifisering. Bruk av luciferase-uttrykke celler inneholder noen unike modaliteter for studier. Secretable luciferase kan for eksempel brukes for svulst byrden kvantifisering av måle blod og urin bioluminescens28. I modellen presentert direkte svulst byrden kvantifisering av levedyktig kreftceller i levende dyr med ikke-secretable luciferase er her enkel og grei, som ikke krever å samle blod eller urin.

Ligner modellene som introduserte her, produksjon av en mer effektiv dyr eksperimentet ved å produsere en høyere suksessrate på tumorigenesis med mindre variasjon er nøkkel å bevise funnene. I den nåværende modellen, når en etterforsker har lært teknikken, er det lett å oppnå en 100% tumorigenesis rate. Vi har også oppnådd høyere tumorigenesis priser enn modellene har vi innført; i tillegg har vi etablert en kolon kreft orthotopic modell utnytte celle suspensjon i en geléaktige proteinet blanding, sammen med bioluminescens teknologi å kvantifisere svulst byrden21. Avslutningsvis gir dyr modellen presentert her en passende murine modell for å gjennomføre kreft studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R01CA160688 og Susan G. Komen Foundation etterforsker igangsatt forskning tilskudd (IIR12222224) å K.T. mus bioluminescens bilder ble kjøpt opp av delt ressurs translasjonsforskning Imaging delt ressurs på Roswell Park Comprehensive Cancer Center, som ble støttet av Cancer Center støtte Grant (P30CA01656) og delte instrumentering grant (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
  2. Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
  3. Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
  4. Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
  5. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
  6. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  7. Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
  8. Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
  9. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  10. Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
  11. National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
  12. Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
  13. Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
  14. Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
  15. Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
  16. Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
  17. Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
  18. Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
  19. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
  20. Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
  21. Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
  22. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  23. Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
  24. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
  25. Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
  26. Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
  28. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  29. Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).

Tags

Medisin problemet 141 mus bryst kreft modell orthotopic syngeneic mastektomi metastasering bioluminescens IVIS
Genererer en Murine Orthotopic metastatisk brystkreft Cancer modell og utføre Murine radikale mastektomi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O.… More

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter