Name: 代谢综合征心力衰竭模型大鼠心房心肌细胞的分离与保留射血分数的关系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学习使用Langendorff灌流技术分离代谢综合征心力衰竭模型大鼠心房心肌细胞的方法。该技术可获得高产量活性细胞，用于研究兴奋收缩耦联机制及心房心肌病。

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本研究得到了德国心血管研究中心（DZHK，D.B.）、Else-Kröner-Fresenius 基金会（EKFS，F.H.）以及德国联邦教育与研究部（BMBF）的支持，同时也获得了由柏林夏里特医学院（Charité - Universitätsmedizin Berlin）和柏林健康研究所（Berlin Institute of Health）资助的 BIH-Charité 临床科学家项目（F.H.）的支持。

所有实验均经当地伦理委员会批准（TVA T0060/15 和 T0003-15），并遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health, U.S.A.）颁布的《实验动物护理与使用指南》进行。
注意：该实验流程的简化流程图见图1。
1. 实验前准备
<ol>
	<li>根据表1准备缓冲液。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>溶液</td>
			<td>PB</td>
			<td>CB</td>
			<td>DB</td>
			<td>SB</td>
			<td>S1</td>
			<td>S2</td>
			<td>S3</td>
			<td>NT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂 (mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
			<td>135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 </td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td></td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛磺酸</td>
			<td></td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>0.01</td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150</td>
			<td>70</td>
			<td>70</td>
			<td>70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯化酶混合物（中等 Thermolysin）</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.195 Wünsch 单位/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 调整至</td>
			<td></td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 调整温度</td>
			<td></td>
			<td>37 °C</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>37 °C</td>
			<td>37 °C</td>
			<td>37 °C</td>
			<td>37 °C</td>
			<td>37 °C</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 调整使用</td>
			<td></td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：缓冲液列表。 PB：灌流缓冲液，可在4 °C保存3天（每只动物300 mL）。CB：插管缓冲液，可在4 °C保存3天（每只动物200 mL）。DB：消化缓冲液，必须在配制当天使用（每只动物40 mL）。SB：终止缓冲液，必须在配制当天使用（每只动物2 mL）。S1：第一步缓冲液，必须在配制当天使用（每只动物2 mL）。S2：第二步缓冲液，必须在配制当天使用（每只动物2 mL）。S3：第三步缓冲液，必须在配制当天使用（每只动物2 mL）。NT：正常台氏液，必须在配制当天使用（每只动物50 mL）。
<ol start="2">
	<li>准备 Langendorff 装置（图 2A）。
	<ol>
		<li>用 100 mL 70% 乙醇冲洗系统，随后用 100 mL 蒸馏水冲洗两次。向系统中加入 200 mL 灌流缓冲液（PB）。</li>
		<li>将蠕动泵的流速设置为 3 mL/min。</li>
		<li>校准从 Langendorff 装置流出的灌流缓冲液（PB）温度至 39 °C。
		<ol>
			<li>将定制的套管 [16 G，25 mm 长，尖端已去除（图 3A）] 放置在 Langendorff 装置上方并启动流体。打开加热模块，并调节加热模块的设定值，使套管尖端处的灌流缓冲液（PB）达到目标温度。温度校准完成后，将定制套管转移至用于插管的注射器上（图 2B）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 Langendorff 系统旁准备压力控制装置（图 3C）。将蝶形针固定在三脚架夹具上，并准备好 3 个阻断结。 
		注：胶原酶活性随温度变化。后续操作中需对左心房进行温度监测，并进行动态调节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据 图 2B 设置器官摘取和插管所需的设备。将烧杯、注射器和培养皿中装满冰冻的插管缓冲液（CB），并准备好插管结。</li>
	<li>按以下方法以每 100 g 大鼠体重 500 I.U. 肝素对大鼠进行肝素化处理。
	<ol>
		<li>在适用于啮齿类动物的麻醉诱导室中加入 2 mL 100% 异氟烷。将 21 周龄的 ZFS-1 肥胖大鼠从笼中转移至诱导室。使大鼠进入深度麻醉状态，表现为呼吸频率减慢至初始频率的一半。</li>
		<li>将大鼠从诱导室中取出。使用肝素注射器向腹腔内注射每 100 g 体重 500 I.U. 的肝素。</li>
		<li>将大鼠放回笼中，允许其苏醒。 
		注：步骤 1.4 期间无需保持无菌。在进行下一步前需等待 20 分钟。抗凝不完全可能导致血液凝固，引发微梗死，从而显著影响分离心肌细胞的质量和得率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 心脏制备
<ol>
	<li>在适用于啮齿类动物的麻醉诱导舱中加入 2 mL 100% 异氟烷。将 21 周龄的 ZFS-1 肥胖大鼠从笼中转移至麻醉诱导舱。待大鼠进入深麻醉状态，表现为呼吸频率减慢至初始频率的一半。</li>
	<li>使用适用于啮齿类动物的断头器处死动物。将大鼠的四肢固定在聚苯乙烯泡沫板表面。用手术剪提起并剪除覆盖剑突的皮肤。于两侧肋弓下方切开腹膜，暴露膈肌。</li>
	<li>沿前弓用精细剪刀做切口以打开膈肌。沿两侧肋骨剪开 锁骨中线 使用手术剪刀剪开至锁骨，以暴露纵隔 原位.</li>
	<li>用精细剪刀在肺门远端切除肺组织。剪除胸腺以暴露主动脉弓。</li>
	<li>用镊子夹住心脏基部，轻轻向动物尾部方向牵拉。在保持牵拉的同时横切主动脉，保留一段5 mm长的主动脉与心脏相连。迅速将心脏转移至50 mL烧杯中的冰冻CB溶液中（50 mL）图 2B). 
	注意：在步骤 2.5–3.3 期间，心脏实际上处于缺血状态。为避免损伤心肌细胞，这些步骤的总时间不应超过 3 min。</li>
</ol>
3. 插管
<ol>
	<li>等待约 10 秒，使心脏冷却并停止收缩。将心脏转移至含有 50 mL 新鲜冰冻 CB 液的培养皿中。使用镊子和剪刀小心去除主动脉周围的脂肪组织。</li>
	<li>将自制的套管（与步骤 1.2.3 中使用的相同），连接至装有冰冻 CB 液的 10 mL 注射器，插入主动脉内约 3 mm。通过在套管尖端近端的凹槽处打两个套管结中的第一个来固定主动脉（图 3B）。 
	注意：需小心操作，避免套管刺穿损伤主动脉瓣。</li>
	<li>使用连接在套管上的注射器，以 5 mL 冰冻 CB 液轻柔冲洗主动脉，直至冠状动脉中不再可见血液。用镊子轻柔按摩左心房，并注入剩余的 5 mL CB 液，使心腔内多余的血液排入培养皿中。</li>
	<li>在套管尖端远端的凹槽处打第二个套管结（缝线：USP 3/0，丝线）。将连接心脏的套管从注射器上取下，再通过合适的接头将其安装到兰格多夫（Langendorff）装置上。 
	注意：本方案在兰格多夫灌流装置中采用心室腔内升高的压力。额外的套管结可防止缓冲液经主动脉前向泄漏，从而维持该压力。</li>
</ol>
4. 压力调控与消化
<ol>
	<li>启动Langendorff装置的蠕动泵，开始用PB灌注心脏组织。在心脏基部（不包括主动脉）用缝线（USP 3/0，丝线）打一个双结。重复此步骤，直至观察到右心房、左心房以及冠状窦膨胀。</li>
	<li>使用压力控制装置的蝶形针头刺穿心房（图3D），使心房排气。通过调节蝶形管的高度来控制心房内腔压力。在整个后续操作过程中保持心房轻微膨胀状态，并持续监测和调整。 
	注意：此步骤需迅速完成，因为左心房长时间膨胀将导致心肌细胞死亡。</li>
	<li>将温度探针置于左心房与左心室之间，测量左心房的大致温度。相应调节Langendorff加热模块的温度，使左心房温度接近37 °C。</li>
	<li>用PB对心脏进行总共3分钟的灌注。</li>
	<li>将灌注液切换为消化缓冲液（DB），持续约14–18分钟。 
	注意：当左心房结构塌陷且组织呈现乳白色质地时，表明消化完成。</li>
	<li>用镊子夹住心房并轻轻牵拉。使用精细剪刀切除左心房，并将其转移至含有2 mL终止缓冲液（SB）的大号称量皿中，确保组织完全浸没。</li>
	<li>按照实验所在实验室的规定处理剩余的心脏组织。</li>
</ol>
5. 细胞处理与钙再适应
<ol>
	<li>使用精细剪刀将心房组织剪切成约 2 mm × 2 mm 的小块。</li>
	<li>用移液管轻柔地反复吸吹组织块，使组织分散。持续此操作约 5 分钟，直至肉眼可见组织明显解离。 
	注意：此步骤中应避免产生气泡，因为细胞接触空气会导致心肌细胞死亡。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。静置 30 秒，使组织块沉淀。将上清液转移至另一支 15 mL 圆锥形离心管中，静置 15 分钟使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。加入 2 mL 步骤 1 缓冲液（见表 1）。静置 10 分钟使心肌细胞沉淀。 
	注意：弃去的上清液中也含有成纤维细胞和内皮细胞。如需将这些细胞用于实验，请参考其他相关方案14,23。沉淀物主要为心房心肌细胞，可通过光学显微镜确认。心房心肌细胞的显微特征见步骤 6.1 中的描述。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。加入 2 mL 步骤 2 缓冲液。静置 10 分钟使心肌细胞沉淀。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。加入 2 mL 步骤 3 缓冲液。静置 10 分钟使心肌细胞沉淀。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。加入 250 µL 含 1 mM Ca2+ 的正常台氏液（NT）。</li>
	<li>取 50 µL 含心房心肌细胞的正常台氏液，滴加至已涂布 25% 层粘连蛋白（预先干燥）的玻璃底培养皿中。静置 10 分钟使心肌细胞贴壁。</li>
	<li>向玻璃底培养皿中加入 500 µL 含 1 mM CaCl2 的正常台氏液（NT）。</li>
</ol>
6. 兴奋-收缩耦联的功能评估
<ol>
	<li>使用20倍物镜在光学显微镜下评估细胞形态和活力（图4A 和 4B）。随机选择约100个细胞，将其分类为存活或非存活细胞，以评估细胞分离过程的存活率。 
	注意：存活细胞的特征为具有对称的肌节结构、无细胞膜出泡现象，并呈杆状。</li>
	<li>在完成步骤5.9后的20分钟内，用Ca2+敏感性荧光染料对细胞进行负载。
	<ol>
		<li>将10 µM Fluo4-AM加入500 µL的NT中。移除玻璃底培养皿中的上清液（来自步骤5.9）。将含有Fluo4-AM的NT加入玻璃底培养皿中，在室温下孵育20分钟。移除并弃去上清液，用500 µL NT洗涤样品2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤使用共聚焦显微镜观察Ca2+激发信号。
	<ol>
		<li>将玻璃底培养皿转移至共聚焦显微镜，使用40倍物镜观察Ca2+激发信号（激光强度设为5.8%，激发波长488 nm，发射波长515 nm）。</li>
		<li>使用适当的灌流装置，以加热至37 °C的NT对细胞进行灌流。或者，使用显微镜载物台加热培养箱保持细胞温度。</li>
		<li>使用 commercially available 的显微镜载物台电刺激电极，在1 Hz频率和24 A电流条件下对心肌细胞施加电场刺激。等待1分钟，使细胞达到Ca2+处理的稳态。</li>
		<li>在随机选择的一个宏观收缩细胞中，将扫描线置于细胞核与边缘之间、平行于横向轴的位置。通过重复扫描获取线扫描图像。</li>
		<li>使用免费的成像软件，估算整个细胞在电刺激前的荧光信号强度（F0）。绘制整个细胞在一个刺激周期内的信号强度变化曲线（F）。将（F）除以（F0），得到相应的Ca2+瞬变曲线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示高时间和低时间敏感器官制备的两步流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57953/57953fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：细胞分离流程的简化流程图。 该操作在完成心肌细胞的酶解之前具有极高的时间敏感性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57953/57953fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡示意图；光谱装置；显微镜；实验室设备布局。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57953/57953fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：分离前的设备准备。（A）本图显示自制的朗根多夫（Langendorff）装置：（1）含PB的夹套反应容器；（2）含CB的夹套反应容器；（3）三通旋塞；（4）注射器；（5）蠕动泵；（6）浸入式加热器；（7）夹套式气泡捕集器；以及（8）插管和心脏。（B）本图显示用于插管与器官摘除的优化工作流程装置：（1）含50 mL冰浴CB的100 mL烧杯；（2）含冰浴CB的10 mL注射器；（3）含冰浴CB的培养皿；（4）光源；（5）自制插管（含插管结，另见图 3A 和 3B）；（6）细弯镊；（7）组织镊；（8）45°角弯头精细镊；（9）腹部手术剪；（10）精细手术剪；（11）4根30 G针头；以及（12）15 G针头。（C）本图显示用于共聚焦成像的显微镜固定装置：（1）电刺激电极；（2）灌流笔；（3）含ACM的玻璃底培养皿；以及（4）浸入式铂金电刺激电极。（D）本图显示共聚焦成像的显微镜配置：（1）共聚焦显微镜；（2）灌流笔；（3）灌流缓冲液储液器；（4）灌流流速调节器；（5）灌流加热模块；（6）计算机工作站；以及（7）电刺激器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57953/57953fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="心脏解剖实验装置，采用缝合技术，重点关注张力调节与定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57953/57953fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：自制设备。（A）此图显示经改造的15 G套管针，带有鲁尔锁接口。箭头指示用于套管结扎的两个凹槽位置。（B）此图为套管结扎结，由两个双单结叠加而成，便于快速收紧。箭头指示结扎的部位及收紧顺序。（C）此图显示组装完成的压力控制装置。一根21 G蝶形针固定在三脚架夹具上，软管保持与针头相同高度，螺口处于打开状态。如箭头所示，可通过调节蝶形针软管的高度来改变左心房腔内压力。（D）使用压力控制装置穿刺左心房。此图显示左心房处于理想充盈状态。椭圆标记指示单结的位置。（E）使用压力控制装置穿刺左心房。此图显示左心房过度充盈，将导致可存活心肌细胞的得率降低。椭圆标记指示单结的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57953/57953fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Alberti, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonizing+the+metabolic+syndrome%3A+a+joint+interim+statement+of+the+International+Diabetes+Federation+Task+Force+on+Epidemiology+and+Prevention%3B+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute%3B+American+Heart+Association%3B+World+Heart+Federation%3B+International+Atherosclerosis+Society%3B+and+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity.</a> Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).</li>
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<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Ramanathan, T., Skinner, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/bjaed/article-abstract/5/2/61/422091">Coronary blood flow.</a> Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).</li>
<li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+individual+collagenases+from+Clostridium+histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li>
<li>Deel, E. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28485491">In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes.</a> The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).</li>
<li>Wuensch, E., Heidrich, H. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14058277">[On the Quantitative Determination of Collagenase].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).</li>
<li>Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Netherlands+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal models of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).</li>
<li>Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+diastolic+dysfunction+and+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction.</a> Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文首先描述了一种从表现为明显心房重构的代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）大鼠模型中分离单个心房心肌细胞（ACM）的实验方案22。该操作具有独特挑战性，因为过量的脂肪组织会使得手术准备以及主动脉插管变得愈发困难。表2中提供的故障排除指南针对了分离过程中最常见的问题。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>可能原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蝶形管无液体流过</td>
			<td>插管结扎导致主动脉闭合不充分</td>
			<td>结扎前去除脂肪组织</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		...

代谢综合征（MetS）是一组2型糖尿病和心血管疾病的危险因素集合，包括动脉血压升高、血脂异常（甘油三酯升高和高密度脂蛋白胆固醇降低）、空腹血糖升高以及中心性肥胖1。全球范围内MetS的患病率估计为25%–30%，且呈持续上升趋势2。射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）是一种具有异质性的临床综合征，常与MetS相关。在HFpEF及其前期阶段（即高血压性心脏病）中，心脏重构通常伴随心房的重构3。左心房收缩功能减退及结构改变与死亡率升高、心房颤动以及新发心力衰竭密切相关4。心房重构的特征包括离子通道功能改变、Ca2+稳态失调、心房结构变化、成纤维细胞活化以及组织纤维化5。MetS相关HFpEF中的左心房重构及其潜在病理机制目前仍不明确，亟需深入研究。动物模型已被证实是研究心房心肌病的重要工具，并推动了该领域的多项进展6,7,8,9。
采用分离的单细胞心肌细胞进行的研究常被用于验证和补充 体内 研究发现，心肌细胞的分离及可能的后续细胞培养，可用于研究信号通路、离子通道电流以及兴奋-收缩耦联。在生理条件下，心肌细胞不具有增殖能力。通过将心房利钠因子的转录调控序列与转基因小鼠中猴病毒40大T抗原融合，首次成功构建了永生化成人传导系统心肌细胞（AT-1）。10AT-1细胞的进一步发育产生了HL-1细胞，后者不仅可连续传代，还能自发收缩。11然而，与 freshly isolated 细胞相比，它们在结构和功能上存在差异，例如超微结构的有序性较低，且发育中的肌原纤维出现频率较高11以及一种超极化激活的内向电流12从多种模型的大鼠和小鼠中分离心室心肌细胞（VCM）的方法已十分成熟13,14,15,16,17,18,19通常，将离体心脏连接至兰格多夫装置，并以无钙溶液逆行灌注2+不含钙缓冲液中加入消化酶（如胶原酶和蛋白酶）。随后逐步重新引入钙离子，恢复至生理条件。然而，尽管已有专门用于分离心房心肌细胞（ACMs）的实验方案20,21由于纤维化增加以及与压力相关的差异，其在伴有心房重构的疾病模型中的应用受到限制。
本文中，我们建立了一种从呈现心房重构的动物中分离心房单细胞心肌细胞的实验方案即，特别是针对与代谢综合征相关的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的ZFS1大鼠模型）22现有的分离方案经过优化，并辅以一种简易的自制装置来调控和改变心腔内的管腔压力，从而获得更高产量的形态和功能完整的心肌细胞。以下方案为研究者提供了分步操作指南、自制设备的详细说明、溶液列表以及全面的故障排除指南。

<table><tbody><tr><td>ZSF-1 肥胖大鼠</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td></td><td>21 周龄</td></tr><tr><td>精细虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>微型敷料镊（弯曲，带齿）</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>组织镊（直型，1×2齿）</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>BD537R</td><td></td></tr><tr><td>打结镊（成角）</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>MA624R</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类与小型动物断头器</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>低成本诱导室 3.0 L</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>SOMNO-0730&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>蝶形带翼输液套管 21 G</td><td>Hospira, Inc.</td><td>181106101</td><td></td></tr><tr><td>Abbocath 16 G</td><td>Hospira, Inc.</td><td>0G7149702</td><td></td></tr><tr><td>微量兰斯皮下注射针头</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td>改装针头以制备套管</td></tr><tr><td>Braun Original Perfusor 注射器 50 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>Braun Inject Solo 注射器 10 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057926</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 烧杯</td><td>Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)</td><td>21 106 17</td><td></td></tr><tr><td>Duroplan 培养皿（100 × 20 mm）</td><td>Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Seraflex 缝合线 USP 3/0</td><td>SERAG-WIESSNER GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>IC208000</td><td></td></tr><tr><td>VWR 一次性方形称量舟 100 ml</td><td>VWR, Inc.</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>泡沫塑料表面</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙溶液（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche (Sigma-Aldrich, Inc.)</td><td>LIBTM-RO</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Rotexmedica GmbH</td><td>3862357</td><td></td></tr><tr><td>Forene（异氟烷）</td><td>Abbvie Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>10182054</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜来源层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>WillCo 玻璃底培养皿 500&amp;micro;l 0.005 mm</td><td>WillCo Wells B.V.</td><td>HBST-3522</td><td></td></tr><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>F14201</td><td>室温下 5&amp;micro;M 孵育 20 分钟</td></tr><tr><td>Di-8-ANNEPS</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>D3167</td><td>37&amp;deg;C 下 10&amp;micro;M 孵育 45 分钟&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mitotracker RED FM</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>M22425</td><td>37&amp;deg;C 下 20 nM 孵育 30 分钟</td></tr><tr><td>夹套式反应容器 500 ml</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>107024414</td><td></td></tr><tr><td>夹套式反应容器 1000 ml</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>107025414</td><td></td></tr><tr><td>夹套式气泡捕集器</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>134720001</td><td></td></tr><tr><td>ED 加热浸入式循环器</td><td>Julabo GmbH</td><td>9116000</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital MS-2/6 蠕动泵</td><td>Ismatec (Cole-Parmer Gmbh)</td><td>ISM 831</td><td></td></tr><tr><td>Voltcraft Thermometer 302 K/J 温度计</td><td>Conrad Electronic SE</td><td>030300546</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 成像软件</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>410135-1011-240&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>单通道加热控制器 TC-324B</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>8 通道灌流系统</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-0185</td><td></td></tr><tr><td>8 通道多管线串联溶液加热器</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-0105</td><td></td></tr></tbody></table>

从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

本文介绍了一种经过优化的、基于兰格多夫（Langendorff）系统的单细胞心房心肌细胞（ACMs）分离方法，用于从代谢综合征（MetS）相关射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的大鼠模型中获取细胞。MetS相关HFpEF的发病率正在上升，而与心房重构及心房颤动相关的心房心肌病在临床上具有重要意义，因为心房重构是死亡率的独立预测因子。针对分离的单个心肌细胞的研究常被用于验证和补充体内实验的结果。然而，循环血管稀疏化和间质组织纤维化可能成为从此类疾病动物模型中成功分离单个ACMs的潜在限制因素。
我们通过使用一种能够在分离过程中手动调节心腔内压力的装置，显著提高了形态和功能完整的心肌细胞的得率。所获得的细胞可用于多种不同的实验，例如细胞培养和功能性钙成像（即，兴奋-收缩耦联）。
我们为研究人员提供了一步一步的操作方案、优化试剂列表、准备必要设备的详细说明以及全面的故障排除指南。尽管该实验程序的初次实施可能较为困难，但成功掌握后，读者便可在与代谢综合征相关的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）大鼠模型中，开展多种实验所需的前沿心外膜脂肪组织（ACM）分离。

通过本方法，可在21周龄时从ZSF-1肥胖大鼠中分离出60–90%的有活力心外膜细胞（ACM）（活力评估方法见步骤6.1），且细胞经过钙再适应处理（步骤5.4–5.7）（图4A）。在大鼠中，与心室心肌细胞（VCM）相比，ACM具有不同且更为异质的表型24,25。图4B显示了一个单个ACM，其细胞膜和肌节结构均保持完整，两者均为功能完整细胞的有力指标。
所获得的心房心肌细胞（ACMs）可通过多种方式进行处理。如图5所示，可将细胞负载荧光染料，用于研究其形态和/或功能。例如，使用di-8-ANEPPS染料来显示大鼠心房细胞中肌管系统的结构（<strong clas...

本文介绍了一种经过优化的基于兰根多夫（Langendorff）系统的分离方法，用于从与代谢综合征相关且射血分数保留的心力衰竭大鼠模型中分离单个心房心肌细胞。通过手动调节心脏腔室的管腔内压力，可获得功能完整的肌细胞，适用于兴奋-收缩耦联研究。

本文中，我们描述了一种经过优化的基于兰格多夫（Langendorff）系统的单细胞心房心肌细胞（ACMs）分离方法，该方法用于从大鼠模型中分离心房心肌细胞。

该方法有助于解答心肌细胞个体功能领域的关键问题，并可用于研究兴奋-收缩耦联。此技术的主要优势在于，能够从患有心房心肌病的心脏中分离出大量具有活性的心房心肌细胞，并用于后续实验。首先，将去除了长而尖锐末端的导管置于朗根多夫装置上方，并启动灌流。打开加热模块并调节，使针尖处的灌注缓冲液维持在灌注所需的温度。温度校准完成后，将套管转移至装有10 ml冰冻套管缓冲液的注射器中。在套管上预先打两个双环结，以便后续快速进行主动脉插管。用镊子夹住已处死且经肝素化的实验大鼠心脏基部，轻轻向动物尾部方向牵拉，将心脏取出。在牵拉心脏的同时横断主动脉，保留一段长约 5 mm 的主动脉连接在心脏上。迅速将心脏转移至盛有 50 ml 冰冷灌流缓冲液的 50 ml 烧杯中。等待约 10 秒，使心脏冷却并停止收缩。然后将心脏转移至一个含有 50 ml 新鲜冰冻灌注缓冲液的培养皿中，使用镊子和剪刀小心去除主动脉周围脂肪组织。将改良的灌注管插入主动脉内 3 mm，注意不要损伤主动脉瓣。将主动脉固定在套管上，通过在套管尖端近端的凹槽处打两个插管结中的第一个结来完成。在套管尖端远端的凹槽处打第二个插管结。使用连接在套管上的注射器，以5 ml冰冷的插管缓冲液轻轻冲洗主动脉，直至冠状动脉中看不到血液。然后，用镊子轻轻按摩左心房，同时注入剩余的 5 ml 灌流缓冲液，以冲洗残留的血液。将连接心脏的套管从注射器上取下。使用合适的适配器，将连接心脏的套管安装到兰格多夫装置上。启动兰格多夫装置的蠕动泵，以开始对心脏组织进行灌注。迅速在心脏基部（不包括主动脉）打一个双半结。当右心房和左心房以及冠状窦膨胀时，用压力控制装置的蝶形针穿刺心房，使心房排气并回缩。通过调节连接在蝶形针上的软管高度来控制心房腔内压力。在后续操作过程中保持心房轻微膨胀。此步骤必须迅速完成，因为心房长时间膨胀将导致心肌细胞死亡。将温度探针置于左心房与左心室之间，以测量左心房的近似温度。根据该温度相应调节兰格多夫灌流装置的加热模块，使左心房温度接近 37 °C。用灌流缓冲液灌流 3 分钟后，切换为消化缓冲液，继续灌流约 14–18 分钟。当左心房结构塌陷且组织呈现乳白色质地时，用镊子夹住心房并轻轻牵拉。使用精细剪刀切除左心房，并将心房转移至含有 2 ml 终止缓冲液的大号称量皿中，确保组织完全浸没。用精细剪刀将心房组织剪切成约 2 平方毫米大小的小块。用移液管轻轻吹打组织约 5 分钟，直至肉眼可见组织解离。避免产生气泡，因为细胞接触空气会导致心肌细胞死亡。随后，将细胞悬液转移至 15 ml 锥形管中。静置组织块30秒使其沉降后，移除上清液并转移至另一支15 ml锥形管中。随后静置15分钟使细胞沉降。移除并弃去上清液后，加入2 ml第一步缓冲液，静置10分钟使心肌细胞沉降。10分钟后，移除并弃去上清液。加入250微升含1 mM钙的正常Tyrod

isolation-atrial-cardiomyocytes-from-rat-model-metabolic-syndrome

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

代谢综合征心力衰竭模型大鼠心房心肌细胞的分离与保留射血分数的关系

我们描述了一种可用于结合细胞内Ca2+浓度测量与电生理膜片钳研究的人类心房肌细胞的分离方法。...

人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

已开发并描述了多种从大鼠心脏中分离不同心肌细胞类型的方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），从而降低实验成本。...

从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&lt;50...

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本方案描述了对朗根多夫（Langendorff）方法的改进，包括主动脉插管的深度，以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞。...

对Langendorff法的改良以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室心肌细胞

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。...

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

学习使用Langendorff灌流技术分离代谢综合征心力衰竭模型大鼠心房心肌细胞的方法。该技术可获得高产量活性细胞，用于研究兴奋收缩耦联机制及心房心肌病。

从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

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