代谢综合征心力衰竭模型大鼠心房心肌细胞的分离与保留射血分数的关系

在这里, 我们描述了一个优化的, Langendorff 的程序, 从一个大鼠模型的代谢综合征心力衰竭与保存的弹射分数分离的单细胞心房心肌细胞。对心脏腔腔内压进行人工调节, 以产生功能完整的心肌细胞, 适合于励磁收缩耦合研究。

这种方法可以帮助回答单个心肌细胞功能领域的关键问题，并允许研究激发-收缩-耦合。该技术的主要优点是可以分离出来自房性心肌病心脏的高产量活心房心肌细胞并用于后续实验。首先在 Langendorff 装置顶部放置一个去除长而锋利尖端的套管，然后开始流动。

打开加热模块并进行调整，使针尖的灌注缓冲液保持所需的灌注温度。温度校准完成后，将套管转移到装有冰冷插管缓冲液的 10 ml 注射器中。在套管上放置两个准备好的双反手结，以便快速随后的主动脉插管。

用镊子捏住心脏底部，然后轻轻地向下拉向动物的尾巴，从安乐死的肝素化大鼠中取出心脏。切开主动脉，同时保持对心脏的拉力，留下一段 5 毫米长的主动脉连接到心脏。将心脏快速转移到 50 ml 烧杯中的 50 ml 冰冷插管缓冲液中。

等待大约 10 秒，让心脏冷却并停止收缩。然后，将心脏转移到含有 50 ml 新鲜冰冷插管缓冲液的培养皿中，并使用镊子和剪刀小心地去除主动脉周围的脂肪组织。将改良的套管插入主动脉 3 毫米，而不会损坏主动脉瓣。

通过在套管尖端近端的凹痕处打两个插管结之一，将主动脉固定在套管上。在套管尖端远端的凹痕处打第二个插管结。使用连接到套管上的注射器，用 5 ml 冰冷的插管缓冲液轻轻冲洗主动脉，直到冠状动脉中看不到血液。

然后，用镊子轻轻按摩左心房，同时注射剩余的 5 ml 插管缓冲液以冲洗任何剩余的血液。从注射器中取出带有连接心脏的套管。使用合适的适配器将带有连接心脏的套管安装到 Langendorff 上。

启动 Langendorff 装置的蠕动泵以启动心脏组织的灌注。在心脏底部快速打一个双反手结，不包括主动脉。当左右心房和冠状窦充气时，用压力控制装置的蝶针刺穿心房，让心房放气。

通过调整连接到蝶针的软管的高度来纵心房的腔内压力。在手术的其余部分保持心房略微充气。迅速执行该步骤至关重要，因为心房长时间充气会导致心肌细胞死亡。

在左心房和左心室之间放置温度探头，以测量左心房的大致温度。相应地调整 Langendorff 加热模块的温度，目标是左心房的大约温度为 37 C。用灌注缓冲液灌注 3 分钟后，切换到消化缓冲液并灌注约 14-18 分钟。

当左心房结构塌陷并且组织获得乳白色质地时，使用镊子和轻微拉动动作捏住心房。用细剪刀去除左心房，将心房转移到含有 2 ml 终止缓冲液的大称量船中，将组织完全浸没。用细剪刀将心房组织切成大约 2 平方毫米的小块。

用移液管轻轻研磨组织约 5 分钟，直到可以观察到组织的宏观解离，从而分散组织。避免产生气泡，因为将细胞暴露在空气中会导致心肌细胞死亡。然后，将细胞悬液转移到 15 ml 锥形管中。

让组织块沉降 30 秒后，取出上清液并转移到另一个 15 ml 锥形管中。然后让细胞沉降 15 分钟。去除并丢弃上清液后，加入 2 ml Step 1 缓冲液，让心肌细胞沉降 10 分钟。

10 分钟后，取出并丢弃最终的上清液。加入 250 微升含有 1 mM 钙的普通 Tyrode。将 50 微升心房心肌细胞悬液转移到层粘连蛋白涂层的玻璃底培养皿上，让心肌细胞在室温下沉淀 10 分钟。

10 分钟后，向细胞中加入 500 微升含 1 mM 氯化钙的正常 Tyrode。在光学显微镜下评估细胞形态和活力。随机选择大约 100 个细胞，并将其分类为活细胞或不可活细胞，以估计细胞分离程序的活力。

活细胞的特征是对称的肌节结构，没有膜泡和杆状。将 10 微摩尔 Fluo-4-AM 添加到 500 微升正常 Tyrode 中，并用它来替换玻璃底培养皿中含有 1 mM 氯化钙的正常 Tyrode。20 分钟后，去除 Fluo-4-AM 溶液，并用 500 微升正常 Tyrode 洗涤细胞两次。

将培养皿转移到共聚焦显微镜上，并使用 40 倍放大倍率观察钙激发。然后，使用适当的超级融合装置，用加热至 37 C 的正常 Tyrode 灌注细胞。使用市售的安装在显微镜上的刺激器电极以 1 Hz 的频率和 24 Amps 的电流在电场中刺激心肌细胞。

等待 1 分钟让细胞达到钙离子处理的稳定状态后，通过重复扫描获取线扫描图像。该图显示了单个心肌细胞的横向线扫描。胞质钙浓度的变化通过激发钙敏感荧光染料 Fluo-4-AM 来显示。

箭头表示以 1 Hz 进行的电刺激，该图像显示了从该单个细胞得出的横向钙瞬变。一旦掌握，该技术可以在 3 小时内进行。在尝试此协议时，重要的是要记住隔离程序中某些步骤的时间敏感性。

在此程序之后，可以执行其他亚细胞成像方法，以回答有关心房心肌细胞重塑的其他问题。