Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.
Abstract
Tornou-se cada vez mais claro que os astrócitos modulam função neuronal não só a nível sináptico e célula única, mas também no nível da rede. Astrócitos são fortemente ligados uns aos outros através de junções e acoplamento através destes cruzamentos é dinâmico e altamente regulamentado. Um conceito emergente é que funções hamartomas são especializadas e adaptadas para as funções do circuito neuronal com o qual eles estão associados. Portanto, métodos para medir vários parâmetros das redes hamartomas são necessários para melhor descrever as regras que regem a sua comunicação e acoplamento e a entender melhor as suas funções.
Aqui, usando o software de análise de imagem (ex., ImageJFIJI), descrevemos um método para analisar imagens confocal de redes hamartomas reveladas pela tintura-acoplamento. Estes métodos permitem 1) uma detecção automatizada e imparcial de pilhas etiquetadas, 2) cálculo do tamanho da rede, 3) cálculo da orientação preferencial da tintura espalhar dentro da rede e 4) reposicionamento da rede dentro da área de interesse .
Esta análise pode ser usada para caracterizar redes hamartomas de uma determinada área, comparar as redes de diferentes áreas associadas a diferentes funções ou comparar redes obtidas em condições diferentes que têm efeitos diferentes sobre o acoplamento. Estas observações podem levar a importantes considerações funcionais. Por exemplo, analisamos as redes hamartomas de um núcleo trigeminal, onde anteriormente mostramos que hamartomas acoplamento é essencial para a capacidade dos neurônios mudar seus padrões de fuzilamento de tónico para ruptura rítmica1. Ao medir o tamanho, confinamento e orientação preferencial das redes hamartomas esse núcleo, podemos construir hipóteses sobre domínios funcionais que eles delimitam. Vários estudos sugerem que várias outras áreas do cérebro, incluindo o córtex de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos e núcleos sensoriais no tálamo e no córtex visual, para citar alguns, podem beneficiar de uma análise semelhante.
Introduction
Muitos estudos têm descrito como o diálogo do neurônio-astrocyte em um nível celular sub ou sináptico pode ter implicações em funções neuronais e a transmissão sináptica. Está bem estabelecido que astrócitos são sensíveis ao redor de atividade neuronal; na verdade, eles possuem receptores para muitos neurotransmissores incluindo glutamato, GABA, acetilcolina e ATP (ver comentários publicados anteriormente2,3,4). Em troca, hamartomas processa sináptica elementos ensheath e influência de atividade neuronal ambos lá e em locais extrasynaptic regulação homeostase iónica extracelular e soltando vários fatores ou transmissores, tais como o glutamato, D-serina e ATP 5 , 6 , 7.
Surgiu a ideia de que astrócitos também podem modular a função neuronal no nível da rede, com evidências de que o acoplamento hamartomas espacialmente é regulamentado e corresponde à segmentação neuronal em áreas caracterizadas por uma clara anatômica compartimentação (como áreas com representações sensoriais), indicando que astrócitos combinar para outros astrócitos, servindo a mesma função, em vez de apenas aqueles que estão por perto. Na oliva superior lateral, por exemplo, redes mais hamartomas são orientadas ortogonalmente ao tonotopic eixo8, Considerando que em glomérulos barril córtex ou olfactoty, a comunicação entre os astrócitos é muito mais forte dentro de barris ou glomérulos e mais fraco entre adjacentes uns9,10. Em ambos os casos, as redes hamartomas são orientadas em direção ao centro do glomerule ou barril9,10.
Recentemente mostramos que a atividade hamartomas modula disparo neuronal, diminuindo a concentração de extracelular Ca2 + ([Ca2 +]e), presumivelmente através da liberação de S100β, uma Ca2 +-ligação proteína11. Este efeito, o que foi demonstrado em uma população de neurônios rhythmogenic trigeminal na parte dorsal das principais trigeminal sensorial núcleo (NVsnpr, pensado para desempenhar um papel importante na geração de movimentos de mastigação), resulta do fato de que fuzilamento rítmico nestes neurônios depende de um persistente at+ atual que é promovido por diminuições de [Ca2 +]11,e12. Fuzilamento rítmico nestes neurônios pode ser eliciado "fisiologicamente" estimulação de suas entradas ou diminuição artificial da [Ca2 +]e. Nós revelou ainda que hamartomas acoplamento foi necessário para acionamento rítmico neuronal1. Isso levantou a possibilidade que as redes hamartomas podem formar circunscritos domínios funcionais, onde a atividade neuronal pode ser sincronizada e coordenada. Para avaliar esta hipótese, precisamos primeiro desenvolver um método para documentar rigorosamente a organização destas redes dentro de NVsnpr.
Estudos anteriores sobre redes hamartomas principalmente descreveu a extensão do acoplamento em termos de número de célula e a densidade e a área coberta. As tentativas de avaliar a forma de redes hamartomas e a direção da tintura-acoplamento principalmente foram realizadas comparando o tamanho das redes ao longo de dois eixos (x e y) do barril córtex9, hipocampo13,14, 15, barreloid campos do tálamo16, oliva superior lateral8, glomérulos olfativos10e o córtex14. Os métodos descritos aqui permitem imparciais acusações de pilhas etiquetadas em uma rede e uma estimativa da área que eles cobrem. Também desenvolvemos ferramentas para definir a orientação preferencial do acoplamento dentro de uma rede e avaliar se a orientação preferencial é em direção ao centro do núcleo, ou em uma direção diferente. Em comparação com métodos utilizados anteriormente, este protocolo fornece um meio para descrever a organização e a orientação das redes hamartomas em estruturas como o núcleo sensorial principal trigeminal dorsal que não têm um conhecido clara anatômico compartimentalização. Nos estudos acima, a orientação de rede é descrita como uma relação com a forma da estrutura em si que já está documentada (ex., o barreloid no tálamo, barris no córtex, camadas no hipocampo e córtex, glomérulos em o bulbo olfatório, etc.). Além disso, análise vectorial permite comparações de orientações reveladas sob diferentes condições de acoplamento. Para analisar se estes parâmetros alterados de acordo com a posição da rede dentro do núcleo, nós também desenvolvemos um método para substituir cada rede em referência os limites do núcleo. Estas ferramentas podem ser facilmente adaptadas para outras áreas para investigar redes de células acopladas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos de morada pelas regras institutos canadenses de pesquisa em saúde e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados com animais da Universidade de Montreal.
1. preparação de fatias de cérebro de rato
- Prepare 1 L de uma solução baseada em sacarose (tabela 1) e 1 litro de líquido de cerebral-espinhal artificial padrão (aCSF) (tabela 2).
- Bolha a solução de sacarose com uma mistura de 95% O2 e 5% CO2 (carbogênio) por 30 min antes de colocá-lo em-80 ° C por cerca de 30 min, até que a solução é frio, mas não totalmente congelada. Use este sacarose gelada como o buffer de corte para o corte do cérebro. Mantê-lo no gelo, uma vez que ele é removido do freezer.
- Bolha a aCSF com carbogênio através de todo o experimento. Use esta solução para armazenamento de fatia e como o buffer perfusing em que o remendo-aperto e biocytin-enchimento de astrócitos serão executadas. Prepare uma fatia recuperação segurando a câmara para depositar as fatias do cérebro, tão logo eles são cortados.
Nota: A câmara de exploração de recuperação fatia poderia ser feitos sob medida e consiste essencialmente de um pequeno poço com uma malha na parte inferior suspendido em um bem maior que é preenchido com aCSF, no qual um tubo é inserido para trazer carbogen do fundo. - Use ratos Sprague-Dawley de 15 a 21 dias de idade sem qualquer preconceito de sexo ou estirpe específica. Anestesia o animal com isoflurano (1 mL de isoflurano em uma câmara de indução da anestesia). Verifique a profundidade da anestesia beliscando suavemente a pata posterior ou cauda do animal.
- Decapitar o rato usando uma guilhotina, corte seu crânio com uma tesoura e rapidamente Retire o cérebro o crânio com uma espátula plana.
- Mergulhe o cérebro na solução baseada em sacarose gelada para sobre 30 s e transferência-o (com a solução) para uma petri dish. Com uma lâmina de barbear, remover as partes que são anterior e posterior à área a ser seccionado, se corte fatias no plano transversal.
- Cole o bloco restante do tecido cerebral na parte rostral e inicie o corte fatias de cérebro (350 µm de espessura) no meio de sacarose-baseado usando um vibratome. Então, transfira as fatias coletadas em uma recuperação segurando câmara cheia de carbogenated aCSF à temperatura ambiente (RT) até que estejam prontos para serem usados (Aguarde pelo menos 1 hora para recuperação).
Nota: Desenvolvimentos recentes no campo permitem incubação prolongada até 24 h de fatias de cérebro no in vitro as condições de17.
2. sulforhodamina 101 (SR-101) rotulagem de astrócitos
- Pré-aquecer o banho de água a 34 ° C e coloque duas câmaras de incubação fatia nele. Preencher uma das câmaras de incubação de fatia com uma solução de aCSF contendo 1 μM SR-101 e preencher o outro apenas com aCSF.
- Incubar as fatias na câmara de incubação contendo a 1 µM SR-101 para 20 min e depois transferência-los para a segunda incubação de câmara de lavar SR-101 em excesso do tecido. Deixe incubar por 20 min ou mais a 34 ° C, então mantenha a câmara de incubação contendo as fatias no RT até que eles são necessários18.
3. astrocyte patches e enchimento de Biocytin
- Selecione uma fatia e colocá-lo na câmara de gravação do microscópio. Para patch astrócitos, usar eletrodos com uma resistência de 4-6MΩ, quando preenchido com uma solução de gluconato de potássio-base (ver quadro 3).
- Sob orientação visual e usando um micromanipulador, direcionar o eléctrodo de gravação para um astrocyte SR-101-rotulado como mostrado na Figura 1. Evite células localizadas na superfície da fatia, uma vez que eles são mais propensos a ser danificado ou perdido conexões às células vizinhas.
- Para evitar fugas de biocytin no tecido, minimizar a pressão positiva adicionada para a pipeta de remendo e aplicá-lo apenas quando está perto da astrocyte que será remendado (0,1-0,4 mL em uma seringa de 1 mL).
- Antes da aplicação de patches, ajuste o deslocamento da pipeta e da sua capacidade. Corrigir para potenciais de junção líquida, como precisas e comandos precisos de tensão são fundamentais para as experiências de19.
- Mova a pipeta perto o suficiente para o astrocyte para observar a depressão causada pela pressão positiva. Em seguida, retire a pressão positiva e lentamente aplicar alguma pressão negativa. Fixar o astrocyte de -70 mV quando o selo atinge 100 MΩ. Espere até que o selo atinge GΩ 1-3. Continue a aplicar pressão negativa até invadir a célula. Tenha cuidado ao aplicar pressão negativa, uma vez que os astrócitos são muito frágeis.
- Avalie as propriedades eletrofisiológicas da célula remendada. No modo de tensão-braçadeira, executar um protocolo de corrente-tensão de célula inteira com um comando de tensão de rampa de duração de 600 ms, variando de -120 a 110 mV. Em modo de corrente-braçadeira, execute um protocolo passo IV, em que a injeção de 1000 ms atual passos do pA 100 -1 para 1 nd, a taxa de amostragem de gravações a célula inteira é 10 kHz.
Nota: Astrócitos mostram um perfil linear de corrente-tensão sem qualquer tipo de retificação (como mostrado na figura 1B) e sem potencial de ação, atirando em cima de despolarização da membrana (Figura 1). O potencial de membrana de repouso (RMP) deve ser estável e não positivo a - 60mV. Em algumas áreas do cérebro, o RMP de astrócitos é mais hyperpolarized do que no NVsnpr. - Permitir que o biocytin difundir dentro do astrocyte por 30 min, durante a execução de um passo protocolo IV cada 5 min.
- Retraia e desanexar a pipeta de remendo cuidadosamente sem danificar o astrocyte remendado e imediatamente tomar nota do deslocamento da pipeta antes de tomá-lo fora da câmara de gravação. Subtrai esse valor das gravações de potenciais de membrana.
- Embora a fatia do cérebro descansar em câmara de gravação para um mínimo de 15 min (além de 30 min para injeção) para permitir a propagação do traçador do astrocyte remendado para toda a rede de células acopladas.
Nota: Para revelar uma rede de células acopladas, apenas uma única célula deve ser corrigida no núcleo de interesse. Se várias tentativas são necessárias para alcançar um sucesso patch, descartar o caso e tentar corrigir no lado contralateral, ou em outra fatia do cérebro. - Fazer uma marca ou incisão no tecido para identificar qual lado da fatia é virada para cima e transferir a fatia primeiro para uma placa de Petri contendo aCSF normal, então em uma solução de paraformaldeído 4% (PFA). Incube a fatia em 4 ° C durante a noite.
Cuidado: PFA é extremamente prejudicial. Use equipamento de proteção em uma campânula ventilada. Certifique-se de que todos os materiais (pincéis, tubos, etc.) que estiveram em contacto com o PFA não entre em contato com a recuperação, mantendo a câmara, câmara de incubação ou outros materiais utilizados para a gravação do tecido fresco.
4. Biocytin revelação
- Revelação com streptavidine fluorescente
- Lavar o cérebro fatias 2 x 10 min em soro de tampão de fosfato 0,1 M (PBS) no RT Em seguida, revelar o biocytin incubando-se as fatias de cérebro com streptavidine conjugada com um fluoróforo na diluição de 1/200 em PBS com detergente não-iônico de 4% para 4h no RT
- Lave as fatias de cérebro 3 x 10 min em PBS 0,1 M a RT e montar as seções em lâminas de vidro usando um meio de montagem aquoso. Coloque os lados que foram injetados para cima, lamela os slides e selá-los com verniz das unhas.
- Revelação com DAB
Nota: Revelação DAB (3,3-diaminobenzidina) pode ser usada quando a fluorescência não pode ser usada. Neste caso, apenas uma revelação método deve ser empregado para fazer comparações.- Lave as fatias de cérebro 3 x 10 min em PBS em RT incubam as fatias em PBS + H2O2 0,5% durante 1 hora a RT
- Lave as fatias 3 x 10 min em PBS em RT Em seguida, incubar as fatias em uma solução coloração complexo avidina-biotina, composto de PBS e 0,1% de detergente não-iônico + avidina-biotina peroxidase complexo padrão coloração reagentes em 1/100, durante 24 horas a RT
- Lave as fatias 3 x 10 min em PBS em RT, incube-os em uma solução de PBS + DAB 0.05% por 20 min na RT e transferi-los para uma solução de PBS + DAB 0.05% + H2O2 0,5%.
Cuidado: DAB é extremamente prejudicial. Use equipamento de proteção em uma campânula ventilada. A reação de cor é interrompida quando as fatias são transferidas em PBS. - Lave as fatias de 5 x 10 min em PBS em RT, as seções de montagem em lâminas de vidro (encarar os lados que foram injetados para cima) e deixe-os secar em um slide de secagem banco durante a noite a 34 ° C.
- Submergi as lâminas de vidro para 1 min em vários banhos de álcool no 70%, 95% e 100% e no final com um banho de xilol por 1 min.
- Monte as lâminas de vidro usando uma resina sintética baseada em tolueno, meio de montagem. Coloque as lâminas lamelas e selá-los com verniz das unhas.
5. rede Imaging
- Visualizar as redes hamartomas usando um microscópio confocal equipado com 20 X e 4 objectivos de X (ou um objectivo adequado para visualizar o núcleo inteiro onde se encontra a rede) e um laser para detectar o fluoróforo (neste caso, Alexa-594 é usado).
- Use a ampliação X 20 para fazer uma z-pilha da rede de pilhas etiquetadas. Usar uma resolução de 800 x 800 pixels e velocidade de 12,5 μs/pixel de digitalização.
Nota: Para toda a rede de imagem, pilhas múltiplas são geralmente necessárias, e o número de pilhas precisa ser ajustado para cada rede. A velocidade de resolução e varredura pode ser mudada, mas certifique-se de usar as mesmas configurações para todos os dados de imagem. - Use a ampliação de 4x para tirar imagens da rede e região de interesse.
Nota: A imagem de 4x é usado para determinar a posição de rede dentro do núcleo de interesse. Sempre o mesmo campo em contra-luz da imagem. Esta imagem será útil se você não pode determinar a fronteira do núcleo na imagem fluorescente confocal.
6. análise de imagens
- Preparação de dados
- Usar o software ImageJFIJI (download em https://fiji.sc/). Abra o arquivo e clique em Okey na janela "Opções de importação de Bio-formatos".
- Para redefinir um z-pilha que conterá somente as fatias ópticas necessárias para a z-pilha final (Figura 2A), clique no botão "Pilha" na barra de ferramentas (para encontrar, primeiro selecione o stk | Projeto de Z). Selecione "Max intensidade" no tipo de projeção configuração (Figura 2A). Salve o arquivo e nomeie-a "pilha de arquivo".
- Se o arquivo de imagem contém vários canais, dividi-lo para conservar apenas o canal com a imagem de rede hamartomas (imagem | Cor | Separação de canais).
- Verifique as configurações de pixel da imagem [imagem | Propriedades | Pixel (com "1" para a dimensão de pixel)].
- Use a ferramenta de plano de fundo de subtrair (processo | Subtrair o fundo) para remover o fundo de biocytin de rotulagem. Use a função preview para definir o raio de bola rolando, que geralmente é fixado em 50 pixels (Figura 2B).
- Use a ferramenta de outliers remover (processo | Ruído | Remover Outliers) se for necessário após a etapa de plano de fundo de subtrair. Selecione "Bright" no cenário "Que Outliers" (Figura 2). Use a função preview para definir o raio e limiar. Cuidado com esta ferramenta, já que ele pode borrar os dados, conforme mostrado na Figura 2D.
Nota: Esta ferramenta remove as pequenas manchas causadas por depósitos inespecíficos de streptavidine (como indicado pelas setas na Figura 2B e 2C brancas antes e após o tratamento, respectivamente). - Ajustar o limite (imagem | Ajustar | Limiar). Selecione o modo "Padrão" e "B & W" (Figura 2E). Clique em "Aplicar".
Nota: Ajuste automático pode ser usado, mas ajuste manual com as duas barras de controle deslizante é preferível. O objetivo desta etapa é reduzir o ruído ao máximo sem perder quaisquer pilhas etiquetadas. - Converter a imagem em uma imagem binária com a ferramenta de processo binário (processo | Binário | Faça binário) como mostrado na Figura 2F. Salve o arquivo como um arquivo TIFF e denomine "arquivo binário".
- Contagem de células
- Verifique a configuração da função de medida (Analyze | Conjunto de medição). Selecione a opção "Baricentro".
- Use a ferramenta "Analisar partículas" no arquivo"binário" (Figura 3A) produzidos na etapa anterior (Analyze | Analisar a partícula) (Figura 3 , à esquerda). Selecione "Contornos" no cenário do "Show" (Figura 3). Isso gera um novo arquivo que mostra o resultado da detecção (Figura 3B).
- Jogar com os parâmetros: tamanho (para detectar apenas células, usar valores entre 30 e 6000) e circularidade (para determinar um intervalo entre 0 e 1, em que "1" define um círculo perfeito e "0" uma forma aleatória) para refinar a deteção (Figura 3, deixada a porção). Execute a deteção clicando em "Okey".
Nota: Duas tabelas aparecerá após a detecção: 1) um quadro intitulado "Resumo" que fornece o número de células detectadas e 2) uma mesa intitulada "Resultados" (Figura 3, certa porção) que fornece as coordenadas x e y de cada célula. - Copiar os valores e colá-los em um aplicativo de planilha. Salve esta tabela sob a nome "deteção tabela". Um arquivo com uma trama de células detectadas também será exibido (Figura 3B). Salve este arquivo como um arquivo TIFF sob o nome "arquivo de detecção".
- Se um grupo de células de 2 ou mais rotulados na rede é detectado como uma única célula com a ferramenta de partículas de analisar porque eles são muito perto um do outro, use a ferramenta de bacias hidrográficas (processo | Binário | Bacia hidrográfica) sobre a imagem binária antes de aplicar as partículas de analisar a ferramenta e refazer os passos de partículas de analisar.
Nota: A ferramenta de bacia hidrográfica cria uma delimitação de 1 pixel de largura entre células extremamente estreita. Uma lata de plug-in de contador de célula ser usado quando a rotulagem é inequívoco e pode ser realizado manualmente.
- Área de rede hamartomas de medição
- Para medir a área de superfície das redes, use o arquivo de detecção usando imagem J.
- Use a ferramenta de seleção de polígono (à esquerda, clique no botão na barra de ferramentas para selecioná-lo) para rastrear um polígono que conecta todas as células localizado na periferia externa da rede (Figura 4A). Clique com o botão esquerdo para iniciar o rastreamento do polígono e clique com o botão direito para fechá-lo.
Nota: Este polígono será definido como uma região de interesse (ROI) e sua superfície será medida para determinar a área de superfície da rede. - Abra a janela de medição conjunto (Analyze | Conjunto de medição) e selecione a opção "Área". Abra o Gerenciador de ROI (analisar | Ferramentas | ROI Manager) (Figura 4B). Em seguida, adicionar o polígono rastreado no ROI Manager clicando em 'Adicionar ' (Figura 4B) e executar a medição clicando em ' medida ' no Gerenciador de ROI.
Nota: A medição de área será exibido em uma tabela e ser expressa em pixels. Não esqueça de converter esse valor com o fator de conversão para o microscópio usado para obter um valor em μm2.
- Determinação do vetor direção principal
- Determinação da célula remendada
- Abra o arquivo de pilha no ImageJFIJI e identificar a célula remendada no arquivo pilha com base em sua forte intensidade de rotulagem (Figura 4). Em seguida, abra o arquivo chamado "mesa da deteção" em um aplicativo de planilha e encontrar o número de associados para a célula remendada e suas coordenadas correspondentes.
- Se não for possível determinar com precisão a célula remendada, cercar a área onde o depósito de biocytin é mais denso na rede imagem de células acopladas, usando a ferramenta polígono em ImageJFIJI, e referir-se a esta posição como que da célula remendada (Figura 4).
- Use o Gerenciador de ROI (analisar | Ferramentas | ROI Manager). Em seguida, desenhe um ROI na localidade de célula remendado e adicioná-lo para o ROI Manager (veja Figura 4B).
- Definir uma medição (Analyze | Conjunto de medição) e selecione a opção "Baricentro".
- No Gerenciador de ROI, clique na "Medida" para obter as coordenadas do centroide da área rastreada. Use estas coordenadas como ponto de referência para esta rede específica.
- Tradução de referencial
- Calcule as coordenadas de cada célula em referência a remendado astrocyte usando a seguinte fórmula:
Com:
como as coordenadas para uma determinada célula; 
como as coordenadas da célula remendada (ou o ponto referencial da rede); e 
como as coordenadas para uma determinada célula no novo referencial.
Nota: Expressar as coordenadas de cada célula em referência a astrocyte remendado é um passo importante no cálculo de vetores da astrocyte remendado. Tenha cuidado ao usar o ImageJFIJI que o referencial para qualquer imagem está localizado no canto superior esquerdo da imagem.
- Calcule as coordenadas de cada célula em referência a remendado astrocyte usando a seguinte fórmula:
- Determinação do principal vetor de orientação preferencial
- Calcule as coordenadas do principal vetor de orientação preferencial com a seguinte fórmula:
Com: (
) como as coordenadas do principal vetor de orientação preferencial; e 
como as coordenadas de cada célula da rede obtida com o remendado de célula como referencial.
Nota: Para cada célula na rede, um vetor é determinado em relação às coordenadas do astrocyte remendado. O principal vetor de orientação preferencial da rede é a soma de todos estes vetores. - Divida o comprimento do vetor principal (fornecido pelas coordenadas obtidas usando a fórmula acima) pelo número de células na rede menos um (desde que as coordenadas da célula remendada não estão incluídas), para normalizar os valores e permitir comparações entre redes. Uma visão esquemática desta análise é apresentada na Figura 5.
- Calcule as coordenadas do principal vetor de orientação preferencial com a seguinte fórmula:
- Determinação da célula remendada
- Colocação das redes analisadas no núcleo de interesse
- Alinhamento de 20 X e 4 imagens X
- Para determinar a posição de cada rede no núcleo de interesse (NVsnpr), use a imagem de X 4. Abra a imagem de X 4 com um editor de imagens vetoriais.
- Selecione a imagem de X 4 e modificar seu tamanho, multiplicando-o por 5. A janela de dimensão está localizada na parte direita da barra de ferramentas horizontal superior. Por exemplo, para uma imagem X 4 que tem sido amostradas em 800 x 800 pixels, alterar a resolução de amostragem para 4000 x 4000 pixels (para definir a unidade de trabalho em pixels, vá para "Instalação do documento" sob a aba de arquivo: arquivo | ' Configurar documento '). Exporte o arquivo no formato TIFF e nome "redimensionado 4 X".
- Alinhe o canto superior esquerdo da imagem com o canto inferior esquerdo do documento Adobe Illustrator.
Nota: O software fornece as coordenadas de um ponto referencial do canto inferior esquerdo. - Abra a imagem de X 20 da rede. Use o ' arquivo binário ' ou ' arquivo de detecção ' porque eles são mais fáceis de alinhar. Então, jogar com a ferramenta de opacidade na 'arquivo binário ' da imagem X 20 para alinhá-lo com o re-tamanho 4 X imagem.
Nota: A ferramenta de opacidade é na barra de ferramentas horizontal superior. - Quando o alinhamento, selecione e segure a ferramenta de pipeta para a ferramenta ' medida ' aparece e selecione-o na barra de ferramentas à esquerda.
- Usar a ferramenta ' medida ' clique no canto superior esquerdo da imagem X 20 para obter as coordenadas do 20 X referencial aponte para o redimensionada 4 X imagem.
Nota: Estas coordenadas, que são referidas como os 20 X referencial (20XR na Figura 5), será útil para expressar a posição de cada rede em um desenho esquemático do núcleo.
- Normalização do núcleo de interesse
Nota: Para resumir os dados, é usada uma normalização do núcleo (NVsnpr) como um retângulo. Os passos são descritos abaixo.- Abra o arquivo redimensionado de 4x em ImageJFIJI e usar a ferramenta polígono para cercar o núcleo (NVsnpr). Usar a imagem com luz transmitida, se as bordas do núcleo não são capazes de ser visto; Nesse caso, lembre-se de redimensioná-la primeiro.
- Abra o Gerenciador de ROI e adicionar o ROI desenhado. Em "Conjunto de medição", selecione a opção ' retângulo delimitador '.
Nota: A opção "Bounding Rectangle" calcula o menor retângulo ao redor do núcleo desenhado. - Clique em "Medida".
Nota: Uma tabela é exibida com BX e BY, as coordenadas do canto superior esquerdo do retângulo: ' retângulo posição ' e fornece a largura e altura. BX e BY são as coordenadas do retângulo delimitador referencial que são referidas como
e 
.
- Expressão de cada posição de rede no núcleo normalizado
- Expressar as coordenadas de cada célula com o 4 X referencial (quadrado preto na Figura 5) usando a seguinte fórmula:
Onde:
são as coordenadas de célula com o 4 X referenciais; 
são as coordenadas da célula com o 20 X referencial (quadrado laranja na Figura 5); e 
são as coordenadas dos 20 X ponto referencial na imagem 4 X (20XR). - Expressar as coordenadas de célula no retângulo delimitador referencial (azul na Figura 5) usando a seguinte fórmula:
Onde:
são coordenadas de célula no retângulo delimitador referencial; 
são as coordenadas de célula no 4 X referenciais; e 
são as coordenadas do retângulo delimitador referencial na imagem X 4. - Transforme as coordenadas de célula no retângulo delimitador referencial para a porcentagem de largura e altura do retângulo delimitador usando a seguinte fórmula:
Onde:
são a célula coordena a porcentagem da largura e altura do retângulo delimitador; 
são coordenadas de célula no retângulo delimitador referencial; 
é a largura do retângulo delimitador medido acima no protocolo; e 
é a altura do retângulo delimitador medida acima no protocolo. - Para representar todas as redes na mesma figura, leve em conta a orientação da fatia (lado esquerdo ou direito). Para padronizar os dados, o referencial é aplicado no lado esquerdo da fatia. Transfira as coordenadas de rede do lado direito para o lado esquerdo, aplicando a fórmula a seguir somente a coordenadas x:
Onde:
é a coordenada x do lado direito da fatia; e 
é o novo x-coordenada expressado no referencial no lado esquerdo da fatia.
Nota: Como alternativa, a foto no ImageJFIJI antes da análise do espelho (imagem | Transformar | Inverta horizontalmente). - Para expressar as coordenadas do principal vetor de orientação preferencial, siga os mesmos passos com as coordenadas de célula (etapas 6.5.3.1 para 6.5.3.4).
Nota: A expressão das coordenadas em percentagens permite uma compilação dos dados como um enredo único, no qual o núcleo (NVsnpr) é projetado como um retângulo.
- Expressar as coordenadas de cada célula com o 4 X referencial (quadrado preto na Figura 5) usando a seguinte fórmula:
- Alinhamento de 20 X e 4 imagens X
- Estudo da diferença angular do principal vetor de direção preferencial
Nota: A diferença angular de uma rede de hamartomas é usada para determinar se sua orientação preferencial é em direção ao centro do núcleo de interesse. Para calcular a diferença angular (α na Figura 5), que é o ângulo entre o principal vetor de direção preferencial da rede (linha PD, vermelho na Figura 5) e a linha que conecta P c, aplicar o teorema de Al-Kashi no triângulo PDC (ver baixo-relevo de Métodos complementarese Figura 5 ).- Em primeiro lugar, calcule os comprimentos diferentes usando a aplicação do teorema de Pitágoras em um cartesiano referencial utilizando a seguinte equação:
Onde: as coordenadas de P e C são
e 
, respectivamente, no retângulo delimitador referencial (calculado acima). - Determine a diferença angular em radianos usando a seguinte fórmula:
- Converta a diferença angular em graus (por exemplo, com a função de graus no software Excel).
- Compilar todas as diferenças angulares traçando-os em gráficos de barras verticais (Figura 7 e 7D) e determinar se existe uma orientação preferencial de redes hamartomas.
- Em primeiro lugar, calcule os comprimentos diferentes usando a aplicação do teorema de Pitágoras em um cartesiano referencial utilizando a seguinte equação:
como as coordenadas para uma determinada célula; 
como as coordenadas da célula remendada (ou o ponto referencial da rede); e 
como as coordenadas para uma determinada célula no novo referencial.
) como as coordenadas do principal vetor de orientação preferencial; e 
como as coordenadas de cada célula da rede obtida com o remendado de célula como referencial.
e 
.
são as coordenadas de célula com o 4 X referenciais; 
são as coordenadas da célula com o 20 X referencial (quadrado laranja na Figura 5); e 
são as coordenadas dos 20 X ponto referencial na imagem 4 X (20XR).
são coordenadas de célula no retângulo delimitador referencial; 
são as coordenadas de célula no 4 X referenciais; e 
são as coordenadas do retângulo delimitador referencial na imagem X 4.
são a célula coordena a porcentagem da largura e altura do retângulo delimitador; 
são coordenadas de célula no retângulo delimitador referencial; 
é a largura do retângulo delimitador medido acima no protocolo; e 
é a altura do retângulo delimitador medida acima no protocolo.
é a coordenada x do lado direito da fatia; e 
é o novo x-coordenada expressado no referencial no lado esquerdo da fatia.
e 
, respectivamente, no retângulo delimitador referencial (calculado acima).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acoplamento entre as células do cérebro não é estático, mas prefiro dinamicamente regulamentado por muitos fatores. Os métodos descritos foram desenvolvidos para redes hamartomas reveladas sob diferentes condições de analisar e entender sua organização em NVsnpr. Estes resultados foram já publicados1. Biocytin enchimento de astrócitos único foram realizadas na parte dorsal do NVsnpr em três condições diferentes: em repouso (em controlar as condições na ausência de qualquer estímulo), numa Ca2 +-free condições e após a estimulação elétrica de fibras sensoriais que se projetam para o núcleo. As configurações experimentais para o enchimento de biocytin de astrócitos para cada condição são ilustradas na esquerda laterais da figura 6A-C.
Redes de células biocytin-etiquetadas foram observadas em condições de controle e confirmaram um estado basal da célula de acoplamento entre NVsnpr astrócitos em repouso. Em 11 casos testados, biocytin difusão mostrou redes composto de 11 ± 3 células (meio painel na figura 6A, Figura 6) estendendo-se por uma área de 34737 ± 13254 µm2 (Figura 6E). Glicirrizina (CBX, 20 μM), um bloqueador específico de junções, foi usada em um conjunto independente de experimentos para assegurar que a rotulagem observada foi um resultado de biocytin difusão através de junções e não absorção pelas células de biocytin, que pode vazar para o espaço extracelular da pressão positiva aplicada a pipeta remendo antes da aplicação de patches. Aplicação de banho de CBX reduziu o número de pilhas etiquetadas para 2 ± 0,5 células (painel à direita na figura 6A, Figura 6; Método de Iman-Conover, P = 0.016; Teste de Holm-Sidak, P = 0,010) e a área de biocytin se espalhou para 2297 ± 1726 µm2 (Figura 6E; Método de Iman-Conover, P = 0.0009; Teste de Holm-Sidak, P = 0,025).
O efeito da remoção de cálcio do meio sobre a NVsnpr redes hamartomas foi testado como concentração baixa de cálcio extracelular é conhecida por abrir connexins e lacuna entroncamentos20,21,22e pode ser usado como um estímulo maciço e uniforme para abrir o sincício e maximizar a difusão de marcador através de junções. As redes hamartomas que foram reveladas em Ca2 +-free condições (n = 10) mostrou um maior número de células que as redes revelada em condições de controle, com 37 ± 10 rotulado células (meio painel na Figura 6, Figura 6; Método de Iman-Conover, P = 0.016; Teste de Holm-Sidak, P < 0,001) cobrindo uma área de 108123 ± 27450 μm2 (médio painel na Figura 6, Figura 6E; Método de Iman-Conover, P = 0,009; Teste de Holm-Sidak, P = 0,001).
Comparado com a remoção completa de cálcio do meio, a estimulação elétrica de entradas aferentes para o núcleo de interesse é um estímulo mais fisiológico que envolve diretamente o circuito neuronal do interesse. Consequentemente, os resultados deste tipo de manipulação podem fornecer informações significativas sobre as implicações funcionais das redes hamartomas observadas. Por exemplo, a entrada de dois caminhos diferentes pode causar efeitos diferentes no estado basal de células em uma determinada área de acoplamento, ou ele pode eliciar acoplamento entre astrócitos em distintas subdivisões do núcleo. No nosso circuito, pulsos de estimulação elétrica das fibras sensoriais que o projeto para o NVsnpr usando trens de 2 segundos de 0,2 ms em 40-60 Hz (n = 11) produziu um aumento do acoplamento entre NVsnpr astrócitos, em relação às condições unstimulated, com 23 ± 6 células (painel médio na Figura 6B, Figura 6; Método de Iman-Conover, P = 0.016; Teste de Holm-Sidak, P = 0,012) espalhando-se por uma área de 814174 ± 15270 μm2 (painel médio na Figura 6B, Figura 6E; Método de Iman-Conover, P = 0,009; Teste de Holm-Sidak, P = 0,004).
Os efeitos destes dois tipos de estimulação, a remoção de cálcio do meio e a estimulação elétrica de entradas aferentes, todos são rompidos pela CBX. As redes hamartomas nesta condição composta por apenas 5 ± 1 células em Ca2 +-aCSF livre (painel à direita na Figura 6, Figura 6; n = 4; Método de Iman-Conover, P = 0.016; Teste de Holm-Sidak, P < 0,001) e 9 ± 2 células com estimulação de fibras sensoriais (painel à direita na Figura 6B, Figura 6; n = 6; Método de Iman-Conover, P = 0.016; Teste de Holm-Sidak, P = 0,023). As áreas de superfície de rede também foram reduzidas a 17987 ± 9843 µm2 com Ca2 +-aCSF livre (Figura 6E; n = 4; Método de Iman-Conover, P = 0,009; Teste de Holm-Sidak, P = 0,004) e 39379 ± 11014 µm2 com estimulação sensorial fibras (Figura 6E; n = 6; Método de Iman-Conover, P = 0,009; Teste de Holm-Sidak, P = 0,055).
Análise anatômica foi realizada apenas em casos onde os limites de NVsnpr podiam ser claramente definidos em 4 X de imagem, que foi o caso para 9 de 10 redes obtido com Ca2 +-aCSF livre e 8 de 11 redes obtidos com estimulação elétrica. Plotagem de todas as redes de hamartomas analisadas em um NVnspr teórico mostra que a maioria das células composto nas redes foram confinados dentro dos limites do núcleo (figuras 7A e 7B, painéis esquerdos e meio). Ca2 +-livre aCSF, 4 de 9 hamartomas redes espalhou fora o NVsnpr na direção do núcleo motor localizado medialmente para o NVsnpr. Nestes 4 casos, a grande maioria das células rotuladas estava confinada ao núcleo. As redes de pilhas etiquetadas, obtidas com a estimulação elétrica das fibras sensoriais eram mais restritas. Apenas 2 redes estendidas as fronteiras do núcleo, no qual uma espalhados sobre a fronteira mediodorsal na área lateral supratrigeminal (rede verde escuro na Figura 7B, painéis esquerdos e meio). No segundo caso, 2 astrócitos na rede vermelha (Figura 7B, painéis esquerdos e meio) cruzaram à porção ventral do NVsnpr.
A análise vectorial para a orientação preferencial de redes hamartomas (painel à direita na Figura 7A e 7B) produziu resultados diferentes dependendo o estímulo utilizado. Com efeito, para as redes hamartomas observadas com Ca2 +-aCSF livre, todos, exceto um dos vetores de orientação preferencial foram orientados em direção ao centro do NVsnpr. No entanto, para as redes hamartomas observadas com a estimulação elétrica, os vetores de orientação preferencial eram principalmente orientados para as fronteiras do núcleo. Isto é refletido pelas diferenças angulares da computada em orientação preferencial entre as redes hamartomas obtidos com Ca2 +-livre aCSF e aqueles obtidos com a estimulação elétrica das fibras sensoriais. Ca2 +-aCSF livre, os gráficos de barras verticais da distribuição da diferença angular mostrou que a maioria das redes de pilhas etiquetadas têm uma diferença angular entre 0 e 40 graus, com média de diferença angular de 39,5 ± 12,7 graus ( Figura 7). Com estimulação elétrica das fibras sensoriais, a distribuição é mais uniforme, e a diferença angular média (99,5 ± 17 graus) é significativamente diferente (Figura 7; teste t de student, P = 0,012).
Estes dados mostram que biocytin análise de rotulagem nos permite distinguir os efeitos de acoplamento hamartomas de modulação de estímulos diferentes. Além disso, o mapeamento das redes hamartomas em um núcleo normalizado, seguido de análise vectorial fornece informações valiosas sobre o tamanho e a organização anatômica destas redes.
Figura 1: células inteiras remendo-braçadeira de astrocyte. (A) astrócitos rotulados com um carregamento de sulforhodamina o marcador 101 (SR-101) em NVsnpr. Destina-se uma soma astrocyte SR-101-etiquetadas com a pipeta de remendo (linha branca tracejada). Barra de escala = 100 μm. (B) um protocolo de rampa despolarizante é executado em tensão-braçadeira (de -120 de 110mV) para avaliar as características passiva astrocyte. (C) avaliação da falta de disparo no astrocyte por injeção de pulsos de corrente em modo de corrente-braçadeira do potencial de ação. Esta figura é uma adaptação de Condamine et al (2018) 1. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: tratamento e análise de redes hamartomas com software ImageJFIJI. (A) criação de Z-pilha da imagem latente confocal de uma rede de hamartomas. Na janela superior-esquerda, Z-pilha em ImageJFIJI. (B) fundo processo de subtração. No canto superior esquerdo, subtrai a janela de plano de fundo no ImageJFIJI. O círculo pontilhado enfatiza a área da imagem onde o efeito do comando fundo subtrair é o mais óbvio quando comparada com a imagem no processo de A. (C) remover valores atípicos. Este processo remove as pequenas manchas devido a depósitos inespecíficas de streptavidine acoplado a um 594 Alexa. As setas brancas mostram o depósito antes (Figura 2B) e depois (Figura 2) o comando tiver sido processado. No canto superior esquerdo, remova a janela de outliers em ImageJFIJI. (D) exemplo do efeito de desfocagem que pode ser produzido por um ajustamento inadequado dos parâmetros remover valores atípicos. Setas amarelas mostram algumas células turva. (E) ajuste o processo de limite. No canto superior esquerdo, ajuste a janela de limiar em ImageJFIJI. As barras de rolagem agir sobre a adaptação de sinal de limite. (F) fazer passo binário. A imagem é convertida em um arquivo binário em ImageJFIJI. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: detecção de células em hamartomas redes com ImageJFIJI. (A) exemplo de uma imagem binária de uma rede de hamartomas obtida em ImageJFIJI. Barra de escala = 100 μm. (B) ilustra o arquivo"detecção" obtido após a aplicação do processo de partículas de analisar no arquivo binário. As formas correspondem a todas as células detectadas com o seu número de associado em vermelho. (C) deixou parte: analisar a janela de partículas em ImageJFIJI. Esta função detecta as células da rede na imagem binária. O tamanho de células detectadas e sua circularidade pode ser ajustado. Números a ser utilizado devem ser definidos por tentativa e erro, até à obtenção de um resultado satisfatório. Direito parte: tabela de deteção gerada pelo processo de análise de partículas. X e Y colunas listam as coordenadas de cada célula detectado na imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: rede de área de análise e determinação da célula remendada em ImageJFIJI. (A) usando de que a ferramenta polígono em ImageJFIJI, um ROI é traçada em torno do aglomerado detectadas células (linha vermelha) que serão usadas para determinar a área de superfície da rede. (B) o ROI é adicionado para o Gerenciador de ROI. (C) exemplo de uma rede de hamartomas na qual a célula remendada (seta branca) é facilmente identificável por causa da intensidade marcante de sua biocytin de rotulagem. (D) exemplo de uma rede de hamartomas onde a célula remendada não pôde ser identificada, mas onde uma área de mais denso rotulagem claramente indica biocytin depósitos. Um ROI é desenhado em torno desta área e adicionado ao Gerenciador de ROI. Seu centroide é computado e considerada como a posição da célula remendada usar para análise vectorial. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: diagrama do referentials diferente usado para análise de redes hamartomas. O quadrado cinzento é a imagem de X 4 com o 4XR ponto referencial para ser alinhado com o canto inferior esquerdo do documento Adobe Illustrator. O quadrado branco cercado em laranja é a imagem de X 20 com o 20XR ponto referencial. Ambas as imagens estão alinhadas uns com os outros, conforme descrito no protocolo. O retângulo delimitador (azul) define NVsnpr (linha tracejada roxa) e é dimensionado em percentagem com o ponto referencial (BR). O centro theoric da parte dorsal do NVsnpr é esquematizado pelo ponto azul escuro (C). A rede hamartomas é esquematizada pela célula remendada (ponto preto, P) e o principal vetor de direção preferencial (linha vermelha). Cada linha tracejada preta é o vetor de cada célula da rede hamartomas. A diferença angular da rede hamartomas (α) é o ângulo entre a principal orientação preferencial da rede (linha vermelha) e a linha preta que liga o astrocyte remendado ao centro teórico do núcleo. Baixo-relevo é um zoom da imagem X 20 mostrando o triângulo PCD formado pelo centro teórico da NVsnpr (C), a célula remendada e o principal vetor de direção preferencial (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: redes hamartomas rotuladas com biocytin em NVsnpr em condições diferentes, mostrando diferentes tamanhos. (A-C) À esquerda, um desenho esquemático da condição experimental. Em todas as condições, um único astrocyte rotulado pelo SR-101 foi alvejado para gravação de células inteiras e cheia de biocytin (0,2%). Coluna do meio: fotomicrografias ilustrando as redes hamartomas obtidas sob controle as condições (A), após a estimulação elétrica do tracto Vth (2 trens s, 40-60 Hz, 10-300 µA, pulsos de 0,2 ms) (B); e após a perfusão com um Ca2 +-aCSF livre (C). Coluna direita: ilustrando as redes hamartomas de fotomicrografias obtidas nas mesmas condições, mas na presença de CBX (20 μM) no antes do banho. Barra de escala = 100 μm. (D e E) Gráfico de barras verticais representando o número de acoplado as células e a área de superfície, respectivamente, das redes biocytin-cheia de astrócitos nas três condições experimentais apresentados acima (A, B e C) na presença (nascidos) e ausência (sólido) de CBX (20 ΜM). Os dados são representados como média ± SEM. múltiplas comparações (Holm-Sidak test): * = P < 0,05; * * = P < 0,001. Esta figura é uma adaptação de Condamine et al (2018) 1. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Caracterização das redes de NVsnpr Ca2 +-aCSF livre e com estimulação elétrica do tracto Vth . (A e B) Esquerda: Todas as células rotuladas em 9 redes preenchido em perfusão com Ca2 +-livre aCSF (A) ou em 8 redes cheias enquanto estimula o trato Vth (B) são plotados de acordo com sua posição em um núcleo teórico de NVsnpr (rectângulo cinzento). Cada rede (e as células compor o) são representadas por uma cor diferente. Médio: os limites de cada rede. O ponto em cada área representa a célula remendada. Direita: representação do principal vetor de orientação preferencial de cada rede. O ponto representa a célula remendada e a seta do vetor de direção preferencial. (C e D) Distribuição das diferenças angulares entre o principal vetor da orientação preferencial e uma recta que une a célula remendada para o centro da parte dorsal do NVsnpr (localizada em 25% sobre o eixo dorsoventral e 50% no eixo mediolateral) sob o duas condições estudaram. A diferença angular média foi de 39,5 ± 12,7 graus em Ca2 +-livre aCSF, indicando uma orientação preferencial para o centro do núcleo e 99,5 ± 17 graus com estimulação elétrica, indicando uma orientação preferencial para a periferia (teste t de student, P = 0,012). Esta figura é uma adaptação de Condamine et al (2018) 1. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| sacarose-aCSF* | mMol |
| Sacarose | 219 |
| KCl | 3 |
| KH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 4 |
| NaHCO3 | 26 |
| Glicose | 10 |
| CaCl2 | 0.2 |
Tabela 1: composição da solução de sacarose-baseado usada para cortar o cérebro. (*) = pH e osmolaridade foram ajustados para 7.3-7.4 e 300-320 mosmol/kg, respectivamente.
| aCSF* | mMol |
| NaCl | 124 |
| KCL | 3 |
| KH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 1.3 |
| NaHCO3 | 26 |
| Glicose | 10 |
| CaCl2 | 1.6 |
Tabela 2: composição da solução usada para o armazenamento de fatia e gravação de células inteiras aCSF. (*) = pH e osmolaridade foram ajustados para 7.3-7.4 e 290-300 mosmol/kg, respectivamente.
| Solução de remendo interno* | mMol |
| K-gluconato | 140 |
| NaCl | 5 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,5 |
| Sal de tris ATP | 2 |
| Sal de tris GTP | 0.4 |
Tabela 3: composição da solução interna usada para gravação de células inteiras. (*) = pH e osmolaridade foram ajustados para 7.2-7.3 e 280-300 mosmol/kg, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Existe um número de métodos eletrofisiológicos para avaliar funcional acoplamento entre astrócitos23,24. No entanto, esses métodos não fornecem informações sobre o arranjo anatômico das redes hamartomas. Vários estudos já mostraram que "corante ou marcador-acoplamento", como feito aqui, ocorre apenas em uma fração de juntamente com as células que são detectadas por métodos eletrofisiológicos25,26,27, sugerindo que o número de células detectadas com este método é subestimado. No entanto, este ainda é o melhor método para visualização de acoplamento. Tintura-acoplamento maior é obtido quando usando traçadores de molécula menor do que 1-1.2 KDa que permeiam a lacuna entroncamentos20. Visualização ao vivo de acoplamento pode ser realizada por difusão de derivados de glicose fluorescente (2-NBDG) ou um marcador fluorescente (como alguns corantes Alexa ou Lúcifer amarelo)13de monitoramento, mas devido ao seu menor tamanho, biocytin produz melhores resultados e permite a quantificação em tecido fixo. Assim, deve notar-se que o número de células detectadas com este método é largamente subestimado. Por outro lado, algumas das células podem ser rotulada como não por causa de seu acoplamento, mas por causa da captação de marcador que vazou para o espaço extracelular. A extensão da rotulagem resultante de vazamento pode ser estimada em experimentos de controle com aplicações de banho de uma junção de lacuna bloqueador1. No entanto, pode-se supor que qualquer viés devido o método seriam aplicáveis a todas as condições.
Finalmente, deve-se ressaltar que não está acoplado as células são astrócitos. Redes de Panglial, onde os astrócitos são acoplados a oligodendrócitos têm sido descritas em diversas áreas do cérebro, incluindo o verde-oliva superior lateral8, tálamo16, córtex e hipocampo28. Nosso objetivo foi desenvolver um método de comparação hamartomas redes reveladas com tintura-acoplamento sob diferentes condições de avaliar a hipótese de que eles formam bem definidos, distintos domínios funcionais revelados por diferentes estímulos. Desde que em NVsnpr, o núcleo trigeminal tronco cerebral em que este protocolo foi realizado, o acoplamento entre astrócitos é muito limitado sob condições de repouso, que era importante primeiro desenvolver um método confiável e imparcial para detectar pilhas etiquetadas. Isto foi conseguido com detecção automática com ImageJFIJI. Às vezes é difícil de distinguir células fracamente rotuladas de ruído de fundo. Aqui, imagem de pilha e um método de ImageJFIJI são usados para melhorar o sinal, mas o ruído de fundo ainda pode ser muito alta e levar a rejeição de dados. Em estudos futuros, esclarecimento protocolos podem ser usados para melhorar a relação sinal-ruído. Um protocolo de compensação é um método interessante de esclarecimento que preserva a morfologia do tecido (nenhum encolhimento), não afeta lipídios e é compatível com immunostaining29. Outra limitação do método descrito é a ferramenta de "divisor de águas" usada para discriminar as células que estão muito perto um do outro. Inspeção visual de células detectadas deve ser feita quando se utiliza esta ferramenta.
Se redes hamartomas formam domínios funcionais, então eles podem definir os limites de um núcleo ou pelo menos devem limitar-se aos limites de um núcleo. Revelou-se de redes podem sempre ser confinadas dentro de um núcleo, mais se eles são menores em tamanho, se o astrocyte remendado é no centro (ou dentro) do núcleo. Para testar se astrócitos sentado perto da fronteira de um núcleo de preferência casal com outros astrócitos fora do núcleo, ou com os outros dentro do núcleo, que precisávamos para determinar a direção preferencial para que o corante se espalhou do astrocyte remendado. Vários outros estudos têm abordado um problema semelhante no córtex de barril, barreloid campos do tálamo, glomérulos olfativos, hipocampo e oliva superior lateral, mas eles centraram-se análises principalmente sobre a distância de difusão do traçador, caracterização eletrofisiológica de diferentes tipos de astrócitos em função de sua localização e propagação do corante ao longo de eixos ortogonais com relação a estas estruturas bem definidas8,9,10, 13,14,16. Aqui, usamos análise vectorial para determinar a direção dominante do tracer espalhado, que foi dado pelo tamanho e orientação do principal vetor normalizado. Pequenos vetores não indicam nenhuma orientação clara "dominante" ou preferencial. Um passo crítico para análise vectorial é a capacidade de identificar com precisão a astrocyte remendado, que nem sempre é possível. Uma alternativa interessante para ajudar a localizar o astrocyte remendado é adicionar um grande (não-lacuna cruzamento permeant) e marcador solucionável, como dextranos, para a solução de gravação. Se não for possível determinar a célula remendada ou localização de remendo, pode ser preferível omitir estas experiências a partir da análise de vetor.
Finalmente, para analisar se Propriedades de redes variaram de acordo com sua localização no núcleo, precisávamos de um método de expressar sua posição em um núcleo "normalizado". O crítico só passo neste procedimento é a capacidade de ver claramente os limites do núcleo nas imagens de baixa ampliação (4x). Uma solução simples para este problema, se isso ocorrer, muitas vezes, é adicionar uma coloração histológica padrão para processamento antes da análise de tecido.
Heterogeneidade de astrócitos em todas as regiões do cérebro se encontra claramente estabelecida, e um crescente corpo de evidências suporta o conceito de que suas especializações são especialmente adaptadas para a função do circuito que estão inseridos em9, 10,30,31. Para que isso seja verdade, comunicação inter hamartomas deve ser limitada a astrócitos associados ao mesmo circuito. Observações para apoiar esta hipótese estão surgindo em áreas diferentes do cérebro, mas são mais evidentes em áreas com representações em cluster, como mapas sensoriais no córtex de barril ou bulbo olfactory. No entanto, a maioria dos relatos de sobreposição entre mapas neuronais e hamartomas são descritivos e qualitativos. Os métodos aqui apresentados podem ser usados para objetivar estas observações e desenvolver ferramentas para analisar melhor hamartomas redes de acordo com sua posição em um determinado circuito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado por institutos canadenses de pesquisa saúde, Grant/prêmio número: 14392.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C.
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
