Summary
यहां, हम अपरा chondroitin सल्फेट के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक बाध्यकारी पेप्टाइड (plCSA-बीपी)-संयुग्मित लिपिड-बहुलक नैनोकणों के माध्यम से एकल कदम sonication और bioconjugate तकनीक । इन कणों सबसे मानव ट्यूमर और अपरा trophoblasts कैंसर और अपरा विकारों के इलाज के लिए चिकित्सकीय के लक्षित वितरण के लिए एक उपंयास उपकरण का गठन ।
Abstract
एक प्रभावी कैंसर चिकित्सकीय विधि कम कर देता है और ंयूनतम प्रणालीगत विषाक्तता के साथ ट्यूमर समाप्त । सक्रिय रूप से लक्ष्यीकरण नैनोकणों कैंसर थेरेपी के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । glycosaminoglycan अपरा chondroitin सल्फेट ए (plCSA) कैंसर की कोशिकाओं और अपरा trophoblasts की एक विस्तृत श्रृंखला पर व्यक्त किया जाता है, और मलेरिया प्रोटीन VAR2CSA विशेष रूप से plCSA के लिए बाध्य कर सकते हैं । एक रिपोर्ट अपरा chondroitin सल्फेट एक बाध्यकारी पेप्टाइड (plCSA-बीपी), मलेरिया प्रोटीन VAR2CSA से व्युत्पंन, भी विशेष रूप से कैंसर की कोशिकाओं और plCSA अपरा पर trophoblasts के लिए बाध्य कर सकते हैं । इसलिए, plCSA-बीपी-संयुग्मित नैनोकणों मानव कैंसर और अपरा trophoblasts को लक्षित दवा वितरण के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम plCSA-BP-संयुग्मित लिपिड-बहुलक नैनोकणों डॉक्सोरूबिसिन (plCSA-DNPs) के साथ भरी हुई संश्लेषित करने के लिए एक विधि का वर्णन; विधि एक एकल sonication चरण और bioconjugate तकनीकों के होते हैं । इसके अलावा, निस्र्पक plCSA-DNPs के लिए कई विधियों, जिनमें अपरा choriocarcinoma (JEG3) कोशिकाओं द्वारा अपने भौतिक गुण और सेलुलर का निर्धारण शामिल है, का वर्णन किया गया है ।
Introduction
एक प्रभावी कैंसर चिकित्सकीय विधि कम कर देता है और ंयूनतम प्रणालीगत विषाक्तता के साथ ट्यूमर समाप्त । इसलिए, चयनात्मक ट्यूमर लक्ष्यीकरण सफल चिकित्सकीय तरीकों की खोज करने के लिए महत्वपूर्ण है । नैनोकणों कैंसर थेरेपी के लिए एक होनहार अवसर प्रदान करते हैं, और विभिंन कार्यात्मक समूहों के साथ आणविक विधानसभाओं दवा प्रभावकारिता में वृद्धि और जुड़े दुष्प्रभाव1,2को कम करेगा । इसके अलावा, nanoparticle सिस्टम मुख्य रूप से निष्क्रिय और सक्रिय लक्ष्यीकरण का उपयोग करने के लक्ष्य ट्यूमर तक पहुंचने3।
निष्क्रिय लक्ष्यीकरण नैनोकणों की जंमजात विशेषताओं और संवर्धित पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव ट्यूमर कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए शोषण करता है । Cationic liposomes सफलतापूर्वक नैदानिक अनुप्रयोगों4,5,6में ट्यूमर के लिए विभिन्न विरोधी दवाओं देने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संभावित प्रभावी कैंसर उपचारात्मक प्रभाव, ट्यूमर क्षेत्र में एक कम दवा एकाग्रता और सामान्य ऊतकों से ट्यूमर कोशिकाओं को भेद करने में असमर्थता के बावजूद निष्क्रिय लक्ष्यीकरण नैनोकणों7की दो प्रमुख सीमाएं हैं.
सक्रिय लक्ष्यीकरण रणनीतियां प्रतिजन-एंटीबॉडी, ligand रिसेप्टर और अंय आणविक मांयता बातचीत का लाभ लेने के लिए विशेष रूप से8ट्यूमर के लिए ड्रग्स उद्धार । glycosaminoglycan अपरा chondroitin सल्फेट ए (plCSA) मोटे तौर पर अधिकांश कैंसर कोशिकाओं और अपरा trophoblasts पर व्यक्त की है । इसके अलावा, मलेरिया प्रोटीन VAR2CSA plCSA9,10करने के लिए विशेष रूप से बाइंड कर सकते हैं । इसलिए, VAR2CSA मानव कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक उपकरण हो सकता है । हालांकि, जब VAR2CSA नैनोकणों करने के लिए संयुग्मित है, पूर्ण लंबाई प्रोटीन ट्यूमर कोशिकाओं में नैनोकणों के प्रवेश को सीमित कर सकते हैं । हाल ही में, हम एक plCSA बाध्यकारी पेप्टाइड (plCSA-बीपी), मलेरिया प्रोटीन VAR2CSA से व्युत्पंन की खोज की । plCSA-बीपी-संयुग्मित लिपिड बहुलक नैनोकणों तेजी से choriocarcinoma कोशिकाओं के लिए बंधुआ और काफी बढ़ डॉक्सोरूबिसिन (DOX) vivo11में विरोधी गतिविधि; इन कणों को भी विशेष रूप से अपरा trophoblasts के लिए बंधुआ और अपरा12को दवाओं के लक्षित वितरण के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है ।
लिपिड बहुलक नैनोकणों एक लिपिड monolayer खोल और एक hydrophobic बहुलक कोर से मिलकर बनता है और दवा वितरण के लिए एक नया वाहक का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन नैनोकणों liposomes और बहुलक nanocarriers, जैसे कि नियंत्रणीय nanoparticle आकार, उच्च असंगति, निरंतर दवा रिलीज, उच्च दवा लदान दक्षता (ले), और उत्कृष्ट स्थिरता13के लाभों को जोड़ । इस काम में, हम लिपिड बहुलक नैनोकणों संश्लेषित करने के लिए एक एकल कदम sonication विधि का इस्तेमाल किया । इस विधि तेजी से, सुविधाजनक और स्केल अप के लिए उपयुक्त है और व्यापक रूप से हमारे समूह11,14 और अंय15,16,17,18 द्वारा लिपिड बहुलक नैनोकणों तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है .
1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) एक लोकप्रिय carbodiimide crosslinking के लिए एक conjugating एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जाता है जिसमें अमीन और carboxylates19शामिल हैं । EDC के अलावा, N-hydroxysulfosuccinimide (एन एच एस) सतह और nanoparticle विकार प्रतिक्रियाओं में सबसे आम विकार रिएजेंट है20,21। एन एच एस पक्ष प्रतिक्रियाओं की संख्या को कम करने और स्थिरता और एस्टर22,23मध्यवर्ती की उपज को बढ़ाने कर सकते हैं ।
यहां, हम synthesizing plCSA के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन लिपिड-बहुलक नैनोकणों लक्षित । सबसे पहले, एकल कदम sonication के संश्लेषण DOX-भरी लिपिड-बहुलक नैनोकणों (DNPs) का वर्णन किया गया है । फिर, plCSA-बीपी-संयुग्मित लिपिड बहुलक नैनोकणों पैदा करने के लिए एक EDC/एन एच एस bioconjugate तकनीक शुरू की है । इस bioconjugate तकनीक का इस्तेमाल अन्य एंटीबॉडी और पेप्टाइड्स को नैनोकणों करने के लिए भी संयुग्मी किया जा सकता है । अंत में, हम भौतिक गुणों का वर्णन और इन विट्रो में plCSA-लक्षित लिपिड-बहुलक नैनोकणों विशेषताएं परख करते थे । हम मानते है कि इन plCSA-लक्षित लिपिड बहुलक नैनोकणों सबसे मानव कैंसर के लिए दवाओं के लक्षित वितरण के लिए एक प्रभावी प्रणाली का गठन कर सकते है और अपरा को अपरा विकारों के इलाज के लिए पेलोड के लक्षित वितरण ।
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Protocol
1. स्टॉक समाधानों की तैयारी
- ultrapure पानी की १०० मिलीलीटर के साथ निरपेक्ष इथेनॉल के 4 मिलीलीटर कमजोर द्वारा 4% इथेनॉल का एक जलीय समाधान तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
नोट: Ultrapure पानी जैसे बैक्टीरिया, कण, आयनों, या nucleases के रूप में दूषित पदार्थों के बिना पानी के रूप में परिभाषित किया गया है । Ultrapure जल एक जल शोधन प्रणाली से १८.२ तक का लक्ष्य प्रतिरोधकता के साथ प्राप्त किया गया था mΩ · cm, जिसका अर्थ है कम anionic संदूषण. - 4% इथेनॉल के जलीय समाधान के 20 मिलीलीटर में सोयाबीन लेसितिण के 20 मिलीग्राम भंग करके एक 1 मिलीग्राम/एमएल सोयाबीन लेसितिण स्टॉक समाधान तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर सोयाबीन लेसितिण स्टॉक समाधान की दुकान ।
- एक 25 मिलीग्राम/एमएल DSPE-खूंटी (2000)-COOH स्टॉक समाधान 4% इथेनॉल के जलीय समाधान के 4 मिलीलीटर में DSPE-खूंटी-COOH के १०० मिलीग्राम को भंग करके । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर ।
- ultrapure पानी की 5 मिलीलीटर में DOX के ५० मिलीग्राम भंग करके एक 10 मिलीग्राम/एमएल DOX स्टॉक समाधान तैयार करें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर DOX स्टॉक समाधान की दुकान ।
- acetonitrile के 10 मिलीलीटर में PLGA के 20 मिलीग्राम भंग करके एक 2 मिलीग्राम/एमएल PLGA स्टॉक समाधान तैयार करें । 4 ° c पर PLGA स्टॉक समाधान संग्रहीत करता है ।
सावधानी: Acetonitrile ज्वलनशील और विषाक्त है । एक धुएं डाकू में देखभाल के साथ संचालित है, और ऐसे लैब कोट, सुरक्षा चश्मा और लेटेक्स दस्ताने के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत उपकरण, पहनते हैं । - ultrapure पानी की १०० मिलीलीटर में एमईएस के २.१७ ग्राम भंग करके एक ०.१ एम 2-(morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस, पीएच ६.०) स्टॉक समाधान तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर ।
2. DNPs का संश्लेषण
नोट: DOX photochemical क्षरण से बचने के लिए सभी ऑपरेशन अंधेरे में किया गया ।
नैनोकणों एक पहले रिपोर्ट एकल-चरण sonication विधि11,13,14द्वारा संश्लेषित किए गए थे ।
- एक बाँझ 10 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए 4% इथेनॉल के जलीय समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें । फिर, सोयाबीन लेसितिण शेयर समाधान के ९० µ जी जोड़ें, २१० DSPE के µ जी-खूंटी-COOH स्टॉक समाधान और ७५० µ जी के DOX स्टॉक समाधान 4% इथेनॉल के जलीय समाधान के 3 मिलीलीटर ।
- एक बर्फ स्नान में केंद्रापसारक ट्यूब प्लेस, और एक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर पर बर्फ स्नान जगह है ।
- एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ, पिपेट PLGA स्टॉक समाधान dropwise के 2 मिलीग्राम (1 ड्रॉप/4-6 एस) केंद्रापसारक ट्यूब में । इस बीच, sonicate की एक आवृत्ति पर एक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग कर ट्यूब 20 kHz और DNPs के संश्लेषित करने के लिए 5 मिनट के लिए 30% की एक उत्पादन आयाम.
नोट: छोटे आकार के साथ वर्दी कणों संश्लेषित करने के लिए, जिस पर PLGA समाधान ट्यूब में dripped है गति धीमी होने की जरूरत है, और बुलबुला पीढ़ी से बचना चाहिए । - ०.१ मीटर एमईएस बफर (पीएच ६.०) में 3 बार एक केंद्रापसारक फिल्टर (MWCO, 10 केडीए) का उपयोग कर ऊपर समाधान धोने से DNPs शुद्ध । 4 ° c और 3 मिनट के लिए १००० × जी पर केंद्रापसारक हर बार । अंत में, एमईएस के लगभग 1 मिलीलीटर-हल नैनोकणों रहना चाहिए ।
नोट: यह प्रक्रिया में एक स्वीकार्य रोक बिंदु है । यदि संयुग्मी पेप्टाइड्स के लिए इस्तेमाल नहीं किया, नैनोकणों पंजाबियों बफर (पीएच ७.४) द्वारा शुद्ध किया जा सकता है, और शुद्ध DNPs अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
3. DNPs को पेप्टाइड्स की विकार
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एस्टर सक्रियकरण
- जोड़ें ०.४ EDC के मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी) DNPs के 1 मिलीलीटर के लिए ।
- जोड़ें ०.२४ प्रतिक्रिया करने के लिए एन एच एस के मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी).
नोट: EDC और एन एच एस की सही मात्रा के अलावा आसान के लिए, एक शेयर समाधान तैयार किया जा सकता है अगर reagent भंग कर रहे है और तुरंत इस्तेमाल किया । - मिश्रण प्रतिक्रिया घटकों को अच्छी तरह से, और एक शेखर पर प्रतिक्रिया जगह; अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट-1 ज के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
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अमीन प्रतिक्रिया
- बढ़ाने के लिए बफर पीएच 7.2-7.5 का उपयोग कर (20 ×, पीएच ७.४) ।
- जोड़ें ०.५ plCSA-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) प्रतिक्रिया समाधान के लिए मिलीग्राम ।
नोट: इसके अलावा, 20% acetonitrile में पेप्टाइड्स भंग । पेप्टाइड्स dissolvable नहीं हैं, तो एक स्नान sonicator में sonication मददगार हो सकता है । - हल अच्छी तरह से मिश्रण है, और फिर एक प्रकार के बरतन पर जगह; अंधेरे में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
- डायलिसिस बैग में संयुग्मी समाधान प्लेस (MWCO, ३,५०० डीए) को dialyze और शुद्ध plCSA-DNPs का उपयोग कर पंजाब (pH ७.४) बफर कमरे के तापमान पर अंधेरे में 24 घंटे के लिए ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, शुद्धि के रूप में चरण २.४ plCSA-DNPs प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । - सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए, एक ०.२२ µm बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पुनर्गठन समाधान संभावित हालाs को दूर करने के लिए फ़िल्टर ।
4. plCSA-लक्षित लिपिड बहुलक नैनोकणों का लक्षण वर्णन
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डायनेमिक लाइट कैटरिंग (DLS) का उपयोग करके hydrodynamic nanoparticle आकार का मापन
- ultrapure पानी के साथ नैनोकणों पतला (५०-गुना कमजोर पड़ने) । DLS या जीटा संभावित साधन के निर्देशों के अनुसार एक cuvette में नमूना के ५०० µ एल लोड ।
नोट: जीटा संभावित और DLS cuvettes है साधन विनिर्देशों के आधार पर अलग कर सकते हैं । - माप के पूरा होने के बाद, कण व्यास, polydispersity सूचकांक (PDI) और जीटा क्षमता रिकॉर्ड । औसत 4 दोहराया रीडिंग से प्राप्त परिणामों, और मानक विचलन की गणना ।
- ultrapure पानी के साथ नैनोकणों पतला (५०-गुना कमजोर पड़ने) । DLS या जीटा संभावित साधन के निर्देशों के अनुसार एक cuvette में नमूना के ५०० µ एल लोड ।
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ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)
नोट: नैनोकणों की आकृति विज्ञान उनि द्वारा नकारात्मक दाग विधि के साथ मनाया गया था । 24- ultrapure पानी के साथ नैनोकणों पतला (४००-गुना कमजोर पड़ने) । एक उनि ग्रिड पर नमूना के 20 µ एल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं ।
- जोड़ें १०० µ 2% (डब्ल्यू/वी) phosphotungstic एसिड की एल और 2 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दूर छोटी बूंद बाती ।
- कमरे के तापमान पर उनि ग्रिड सूखी ।
- ८० केवी पर उनि त्वरण वोल्टेज सेट करें, और नैनोकणों कल्पना करने के लिए १००,००० × करने के लिए छवि बढ़ाना ।
-
encapsulation दक्षता का निर्धारण (EE) और LE
- मानक वक्र पीढ़ी । ultrapure पानी में DOX भंग पांच अलग सांद्रता के DOX समाधान तैयार करने के लिए: 1 µ g/एमएल, 5 µ जी/एमएल, 10 µ जी/एमएल, ५० µ जी/एमएल, और १०० µ g/ एक यूवी की तुलना स्पेक्ट्रोमीटर के साथ ४८० एनएम पर DOX समाधान के अवशोषण को मापने । DOX सांद्रता के आधार पर एक मानक वक्र उत्पन्न करें ।
- ultrapure पानी के ५०० µ l के साथ नैनोकणों के 25 µ l को पतला कर दीजिये. एक यूवी की तुलना स्पेक्ट्रोमीटर के साथ ४८० एनएम पर अवशोषण को मापने । मानक वक्र द्वारा दवा सांद्रता की गणना ।
- निंन समीकरण का उपयोग कर ले की गणना करें:
LE = (नैनोकणों में दवाओं की मात्रा)/(सामग्री का कुल वजन)) × 100% । - निंन समीकरण का उपयोग करके EE की गणना करें:
EE = (नैनोकणों में औषधियों की मात्रा)/(जोड़ा दवा की मात्रा)) × 100% ।
-
bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग कर विकार दक्षता का मापन 25 , 26 , 27
- पिपेट 25 µ एल मानक पेप्टाइड समाधान (तालिका 1) या plCSA-DNPs में microplate कुओं में डुप्लिकेट । एक अच्छी तरह से करने के लिए काम कर रहे एजेंट के २०० µ एल जोड़ें, और प्लेट अच्छी तरह से एक थाली के लिए शेखर पर मिश्रण 30 एस ।
- प्लेट को कवर, और 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
- एक प्लेट रीडर पर ५६२ एनएम पर अवशोषक उपाय । plCSA-DNPs की plCSA सांद्रता की गणना करने के लिए उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग करें ।
- निंन समीकरण का उपयोग कर विकार दक्षता की गणना करें:
विकार दक्षता = (नैनोकणों में पेप्टाइड की मात्रा)/(जोड़ा पेप्टाइड की मात्रा)) × 100%.
| शीशी | मंदक (μL) की मात्रा | मात्रा और पेप्टाइड का स्रोत (μL) | अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता (μg/ |
| ए | 0 | ३०० स्टॉक का | १००० |
| बी | २५० | २५० शीशी एक कमजोर पड़ने के | ५०० |
| सी | २५० | शीशी बी कमजोर पड़ने के २५० | २५० |
| डी | २५० | शीशी C कमजोर पड़ने के २५० | १२५ |
| ई | ३०० | शीशी D कमजोर पड़ने के २०० | ५० |
| एफ | २५० | २५० शीशी ई कमजोर पड़ने के | 25 |
| जी | ४०० | शीशी च कमजोर पड़ने के १०० | 5 |
| एच | ५०० | 0 | 0 |
तालिका 1. मानक पेप्टाइड्स की तैयारी
5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक असेसमेंट ऑफ plCSA-लक्षित Nanoparticle Choriocarcinoma (JEG3) कोशिकाओं में
- बीज कोशिकाओं पर बाँझ 12-अच्छी तरह से प्लेटें पर 1.0 × 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से DMEM/f12 (cDMEM/f12, जिसमें 1% पेनिसिलिन/streptomycin और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) । आर्द्रता शर्त के तहत कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर ६०% संगम को विकसित करने की अनुमति दें ।
- मीडिया को निकालें, और कम सीरम सामग्री (5% FBS) और DNPs या plCSA-DNPs (5 µ g के DOX समतुल्य) के साथ 1 मिलीलीटर ठंडा ताजा मीडिया जोड़ें ।
- 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं और नैनोकणों के मिश्रण की मशीन ।
- मशीनीकरण के बाद, मीडिया को हटा दें, और तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । फिर, ताजा cDMEM/F12 के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।
- cDMEM/F12 निकालें, और तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
- ठंड 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ।
- पीएफए निकालें । एक बार पंजाब की 2 मिलीलीटर वाली कोशिकाओं को धो लें । नाभिक धुंधला के लिए DAPI (1 µ g/एमएल) युक्त पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
- पंजाबियों को महाप्राण, और तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
- बढ़ते मध्यम जोड़ें, और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ प्रतिदीप्ति छवि, हरे और नीले चैनलों का उपयोग कर DOX और नाभिक, क्रमशः कल्पना ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में क्रमशः PLGA, DSPE-खूंटी-COOH और सोयाबीन लेसितिण एक प्रतिनिधि बहुलक, लिपिड-खूंटी-COOH संयुग्मी और लिपिड हैं । एक एकल कदम sonication विधि और एक EDC/एन एच एस तकनीक के माध्यम से plCSA-लक्षित लिपिड बहुलक नैनोकणों के संश्लेषण चित्रा 1में सचित्र है । पहला, sonication शर्तों के तहत, सोयाबीन लेसितिण, PLGA और DSPE-खूंटी-COOH स्व-इकट्ठा करने के लिए कोर-शैल संरचित DNPs । कोर PLGA और encapsulated DOX के होते हैं, खोल DSPE-खूंटी-COOH के होते हैं, और सोयाबीन लेसितिण monolayer खोल और कोर के इंटरफेस पर स्थित है । फिर, DNP सतह पर उजागर-COOH समूहों plCSA-DNPs को संश्लेषित करने के लिए EDC/एन एच एस तकनीक के जरिए पेप्टाइड के एनएच2 समूहों के साथ संयुग्मित थे ।
इस प्रोटोकॉल में तैयार DNPs व्यास में ८२.३ ± ४.७ एनएम थे, और विकार के बाद plCSA-बीपी, प्राथमिक DNPs के व्यास १०९.३ ± ५.९ एनएम (चित्रा 2) की वृद्धि हुई । DNPs और plCSA-DNPs के PDI क्रमशः 0.127 ± 0.005 और ०.१३४ ± ०.०६५ था । DNPs और plCSA-DNPs के उनि छवियों को भी पता चला है कि कणों अच्छी तरह से फैलाया गया था और आम तौर पर गोलाकार morphologies (चित्रा 3) था । DNPs और plCSA के जीटा क्षमता-DNPs था-२०.१ ± १.३२ एमवी और २९.९ ± ३.५६ एमवी, क्रमशः (तालिका 2) । अत: इन नैनोकणों के अत्यधिक स्थिर होने की भविष्यवाणी की जाती है ।
| नैनोकणों | व्यास (एनएम) | Pdi | जीटा संभावित (एमवी) |
| DNPs | 82.3 ± 4.7 | 0.127 ± 0.005 | -20.1 ± 1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3 ± 5.9 | 0.134 ± 0.065 | -29.9 ± |
| PDI: polydispersity index. डेटा प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± एसडी (एन = 3) । | |||
तालिका 2. नैनोकणों का लक्षण वर्णन
नैनोकणों के EE और LE नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं । DNPs और plCSA-DNPs द्वारा DOX का अपनाओ क्रमशः ४०.३ ± १.६७% और ३९.५ ± १.९४% था । DNPs और plCSA-DNPs में DOX के LE ६.२ ± ०.७४% और ५.१ ± ०.४२%, क्रमशः था । इन आंकड़ों से पता चला कि plCSA-बीपी डेकोरेशन के बाद ड्रग लोडिंग और ड्रग encapsulation की हद को बनाए रखा गया । DNPs की सतह पर plCSA-बीपी की सजावट कुशलता बीसीए की परख (चित्रा 4) द्वारा निर्धारित की गई थी । plCSA-बीपी विकार दक्षता को ४५.५ ± ३.७% पाया गया ।
JEG3 सेलुलर तेज परख संकेत दिया कि plCSA-DNPs तेजी से 30 मिनट के भीतर JEG3 कोशिकाओं को बाध्य (5 चित्रा) । इसलिए, plCSA-BP इस प्रोटोकॉल में DNP सतह के लिए कुशलता से संयुग्मित किया गया था । इसके अलावा, plCSA-बीपी तेजी से JEG3 कोशिकाओं को बांध सकता है और नैनोकणों के सेलुलर तेज वृद्धि हुई है ।
चित्र 1. plCSA-लक्षित लिपिड बहुलक नैनोकणों को संश्लेषित करने के लिए प्रयुक्त विधि का योजनाबद्ध चित्रण । सबसे पहले, एक एकल कदम sonication विधि लिपिड बहुलक नैनोकणों (DNPs) संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और फिर EDC/एन एच एस तकनीक nanoparticle सतहों (plCSA-DNPs) के लिए पेप्टाइड्स संयुग्मी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. विभिंन नैनोकणों का आकार वितरण । Hydrodynamic का आकार DNPs (क) और plCSA-DNPs (ख) DLS द्वारा मापा जाता है. प्रतिनिधि के आंकड़े कण आकार और आकार वितरण प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. Nanoparticle आकृति के उनि द्वारा विशेषता । DNPs (क) और plCSA-DNPs (बी) के ठेठ उनि छवि 2% phosphotungstic एसिड धुंधला के साथ मनाया । स्केल बार = 100 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4. विकार दक्षता का मापन बीसीए परख का उपयोग कर । ५६२ एनएम पर पेप्टाइड्स के मानक वक्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5. JEG3 कोशिकाओं द्वारा Nanoparticle । JEG3 कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 5 µ जी/एमएल अलग नैनोकणों के साथ मशीन के 30 मिनट के बाद विश्लेषण किया गया । लाल: DOX, नीला: DAPI-त्यसपछि नाभिक । स्केल बार = 50 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल synthesizing plCSA-बीपी-संयुग्मित लिपिड पॉलिमर नैनोकणों के लिए एक कुशल और reproducible विधि प्रदान करता है । एकल कदम sonication विधि लिपिड बहुलक नैनोकणों तैयार करने के लिए तेजी से है, reproducible और ठेठ nanoprecipitation तरीकों से अलग है कि हीटिंग, भंवर, या वाष्पीकरण शामिल है । इसलिए, विकसित विधि काफी संश्लेषण समय कम कर देता है । इसके अलावा, EDC/एन एच एस bioconjugate इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एक सामांयतः इस्तेमाल किया और सुविधाजनक करने के लिए संयुग्मी पेप्टाइड्स और एंटीबॉडी नैनोकणों के लिए तकनीक है । इसलिए, plCSA-लक्ष्यीकरण लिपिड-बहुलक नैनोकणों के लिए EDC/एन एच एस bioconjugate तकनीक के साथ एकल-चरण sonication विधि का संयोजन नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए स्केल किया जा सकता है ।
कुछ प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक synthesizing और निस्र्पक plCSA-DNPs के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, लेसितिण, PLGA और DSPE-खूंटी-COOH के सापेक्ष सांद्रता लिपिड बहुलक nanoparticle आकार और polydispersity निर्धारित करते हैं । जब लेसितिण की एकाग्रता तय की है, कम polydispersity में DSPE-खूंटी-COOH परिणामों की एक उच्च एकाग्रता और एक छोटे nanoparticle आकार,13,15 जिसके फलस्वरूप दवा ले कम हो जाती है । जब PLGA की एकाग्रता तय की जाती है, तो अधिक DSPE-खूंटी-COOH लेसितिण द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, उच्च nanoparticle polydispersity और बड़ा nanoparticle आकार15के लिए अग्रणी । इस स्थिति में, नैनोकणों अधिक अस्थिर और समग्र आसानी से कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में, DSPE-खूंटी-COOH/PLGA वजन अनुपात ०.११ है, और लेसितिण/DSPE-खूंटी-COOH जन अनुपात ०.४३ है । लिपिड बहुलक nanoparticle आकार लगभग ०.१२७ के एक PDI के साथ ८२ एनएम है ।
दूसरा, नैनोकणों के लिए पेप्टाइड्स के विकार के दौरान समाधान का पीएच अत्यंत महत्वपूर्ण है । एस्टर सक्रियण के इष्टतम पीएच 5.0-6.0 है, और अमीन प्रतिक्रिया पीएच 7.2 में सबसे कुशल है-7.519,28,29। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रतिक्रिया दो चरणों में किया जाना चाहिए । पहले, एस्टर सक्रियण एमईएस में (या किसी अन्य noncarboxylate, गैर-अमीन बफ़र) पीएच 5.0-6.0 में होता है । फिर, पीएच 7.2-7.5 का उपयोग कर पंजाब (या एक और गैर अमीन बफर) तुरंत अमीन-19अणु युक्त के साथ प्रतिक्रिया से पहले समायोजित है । यह देखते हुए कि आधा एन एस एस्टर के जीवन 4-5 पीएच ७.०19में एच, अमीन प्रतिक्रिया की अवधि 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 से अधिक है एच ।
अंतिम क्रिटिकल फैक्टर nanoparticle है । JGE3 कोशिकाओं द्वारा DNPs के निशाने पर लेने के एक समारोह में संस्कृति समय और तापमान और मध्यम में FBS की एकाग्रता को नियंत्रित करने से लक्षित प्रतिकार्य के विश्लेषण में समाप्त किया गया । इस प्रोटोकॉल में, JEG3 कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% FBS के साथ 1 एच के लिए, और फिर ३७ ° c में 30 मिनट के लिए DNP सेलुलर को कम करने के लिए कल्चरित थे ।
यदि प्रक्रिया के दौरान समस्याएँ उत्पन्न होती हैं, तो plCSA-DNPs के संश्लेषण और लक्षण वर्णन से संबंधित तीन प्रमुख समस्या निवारण चरण हैं. पहला, लिपिड बहुलक नैनोकणों PLGA और लेसितिण के स्व-विधानसभा द्वारा तैयार किए गए sonication शर्तों के तहत । PLGA केवल कार्बनिक विलायक में घुल । इसलिए, एक हाइड्रोफिलिक विलायक के अलावा, PLGA छोटे नैनोकणों में जल्दी से हाला । dropwise अतिरिक्त की गति के प्रभाव को कम करने और बड़े कणों को पैदा करने से बचने के लिए, PLGA जोड़ने से पहले 1-2 मिनट के लिए मिश्रण के sonication आवश्यक है । दूसरा, हालांकि plCSA का मात्रात्मक विश्लेषण-बीपी विकार बीसीए विधि का उपयोग कर दक्षता त्वरित और सुविधाजनक है, एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) परख अधिक सटीक है । HPLC प्रयोगात्मक विवरण हमारे समूह द्वारा वर्णित किया गया है11 और दूसरों को30,31,३२। अंत में, plCSA-DNP सेलुलर के लिए इष्टतम स्थिति अंय कैंसर कोशिकाओं के लिए अलग हो सकता है । FBS एकाग्रता को कम करने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी समय बढ़ाने में मदद कर सकते हैं इष्टतम स्थितियों का निर्धारण.
प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि दवाओं का hydrophobicity निर्धारित करता है कि दवाओं का अपनाओ. हाइड्रोफिलिक दवाओं के साथ तुलना में, hydrophobic दवाओं PLGA के लिए एक मजबूत समानता है, जो एक वृद्धि की दवा EE में परिणाम है । इन उदाहरणों में, plCSA-लक्षित लिपिड-बहुलक नैनोकणों के संश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं के लिए प्रयोगात्मक दवा LE और EE में परिणाम है कि सबसे कुशल संश्लेषण विधि निर्धारित करने के लिए प्रयोग करने के लिए जांच की जानी होगी ।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, glycosaminoglycan plCSA विशेष रूप से सबसे अधिक कैंसर कोशिकाओं और अपरा trophoblasts पर व्यक्त की है । इसलिए, यह ध्यान रखें कि plCSA-एनपीएस केवल गर्भवती पशुओं और मनुष्यों में ट्यूमर कोशिकाओं के लिए चिकित्सीय चिकित्सा के लक्षित वितरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और यह है कि इन दवाओं लोड कणों गर्भवती पशुओं के अपरा में साइड इफेक्ट के लिए नेतृत्व करेंगे और मनुष्य.
संक्षेप में, हम plCSA-लक्षित लिपिड बहुलक नैनोकणों को संश्लेषित करने के लिए एक सरल और सुविधाजनक विधि का वर्णन किया है । इस प्रोटोकॉल का महत्व है कि यह ट्यूमर और अपरा में दवा की उपलब्धता बढ़ जाती है, जबकि सहवर्ती विषाक्तता को कम । इस दृष्टिकोण ट्यूमर और अपरा के लिए दवाओं के लक्षित वितरण के लिए उपयोगी होना चाहिए और plCSA-लक्षित लिपिड-बहुलक नैनोकणों भविष्य में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए तैयार करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
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Disclosures
X.F. और B.Z. पेटेंट पीसीटी पर अंवेषकों हैं/CN2017/108646 और २०१७१०९०६५८७.६ सियाट द्वारा प्रस्तुत है कि एक plCSA-लक्षित nanoparticle संश्लेषण विधि और अनुप्रयोग को शामिल किया गया । हित के किसी संभावित संघर्ष का खुलासा दूसरे लेखकों द्वारा नहीं किया गया ।
Acknowledgments
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC1000402), राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१५७१४४५ और ८१७७१६१७) और गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2016A030313178) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था X.F. और द शेन्ज़ेन बेसिक रिसर्च फंड (JCYJ20170413165233512) को X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
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