Summary
Burada, plasental kondroitin sülfat A bağlama peptid (plCSA-BP) sentezi için bir iletişim kuralı mevcut-Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri ile tek adım sonication ve bioconjugate teknikleri. Bu parçacıklar tedavi hedeflenen teslimat en insan tümörleri ve kanserleri ve plasental bozuklukları tedavisinde plasental trophoblasts için bir roman araç oluşturmaktadır.
Abstract
Bir etkili kanser tedavi yöntemi azaltır ve tümörleri ile en az sistemik toksisite ortadan kaldırır. Aktif olarak hedefleme nano tanecikleri kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım sunuyoruz. Glikozaminoglikan plasental kondroitin sülfat (plCSA) çok çeşitli kanser hücrelerinin ve plasental trophoblasts ve sıtma protein VAR2CSA özellikle plCSA için bağlayabilirsiniz ifade edilir. Sıtma protein VAR2CSA, türetilmiş bir bildirilen plasental kondroitin sülfat A bağlama peptid (plCSA-BP), de özellikle kanser hücrelerinin ve plasental trophoblasts plCSA bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, nano tanecikleri plCSA BP Birleşik bir araç olarak insan kanser ve plasental trophoblasts için hedeflenen ilaç dağıtım için kullanılabilir. Bu protokol için biz (plCSA-DNPs); doksorubisin ile yüklenen plCSA BP Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri sentezlemek için bir yöntem tarif Yöntem bir tek sonication adım ve bioconjugate teknikleri oluşur. Buna ek olarak, plCSA-DNPs, Fizikokimyasal özellikleri ve plasental choriocarcinoma (JEG3) hücreler tarafından hücresel alımını belirlemek de dahil olmak üzere karakterize için birkaç yöntem açıklanır.
Introduction
Bir etkili kanser tedavi yöntemi azaltır ve tümörleri ile en az sistemik toksisite ortadan kaldırır. Bu nedenle, başarılı tedavi yöntemleri keşfetmek için anahtar Seçici tümör hedefliyor. Nano tanecikleri kanser tedavisi için umut verici bir fırsat sunuyoruz ve moleküler derlemeler farklı fonksiyonel grubu ile ilaç etkinliğini artırmak ve azaltmak ilişkili yan etkileri1,2. Ayrıca, nanopartikül sistemleri esas hedef tümörler3ulaşmak için pasif ve aktif hedefleme yararlanmak.
Pasif hedefleme nano tanecikleri ve gelişmiş geçirgenliği ve tümör hücreleri ulaşmak için saklama (EPR) etkileri doğuştan gelen özellikleri patlatır. Katyonik lipozomlar başarıyla çeşitli antikanser ilaçlar tümör klinik uygulamaları4,5,6' teslim etmek için kullanılmaktadır. Potansiyel etkili kanser tedavi edici etkiye rağmen düşük ilaç konsantrasyonu tümör bölgesi ve tümör hücrelerinin normal dokuların ayırt etmek için bir yetersizlik pasif hedefleme nano tanecikleri7' nin iki önemli sınırlamaları vardır.
Etkin hedefleme stratejileri antijen-antikor, ligand-reseptör ve özellikle uyuşturucu tümörler8' e teslim etmek için diğer moleküler tanıma etkileşimleri yararlanın. Glikozaminoglikan plasental kondroitin sülfat (plCSA) genel olarak çoğu kanser hücreleri ve plasental trophoblasts ifade edilir. Ayrıca, sıtma protein VAR2CSA özellikle plCSA9,10' a bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, VAR2CSA insan kanser hücrelerinin hedefleme için bir araç olabilir. Ancak, VAR2CSA için nano tanecikleri Birleşik zaman, tam uzunlukta protein nano tanecikleri penetrasyon tümör hücreleri içine sınırlayabilir. Son zamanlarda, biz Sıtma protein VAR2CSA türetilmiş bir plCSA bağlama peptid (plCSA-BP), keşfetti. plCSA-BP-Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri hızla choriocarcinoma hücreleri ve önemli ölçüde artış doksorubisin (DOX) antikanser aktivite vivo içinde11yapıştırılmış; Bu parçacıklar da özellikle plasental trophoblasts gümrüklü ve uyuşturucu hedeflenen teslimat plasenta12için bir araç olarak hizmet verebilir.
Lipid-polimer nano tanecikleri lipid monolayer kabuk ve hidrofobik bir polimer çekirdek oluşur ve ilaç dağıtım için yeni bir taşıyıcı temsil eder. Bu nano tanecikleri lipozomlar ve kontrol edilebilir nanopartikül boyutu, yüksek biyouyumluluk, sürekli uyuşturucu serbest, yüksek ilaç yükleme verimliliği (LE) ve mükemmel istikrar13gibi polimer nanocarriers avantajlarını birleştirir. Bu çalışmada, biz bir tek adım sonication lipid-polimer nano tanecikleri sentezlemek için kullanılan yöntem. Bu yöntem hızlı, pratik ve ölçek-up için uygundur ve yaygın lipid-polimer nano tanecikleri hazırlamak için bizim grup11,14 ve diğerleri tarafından kullanılmıştır15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) crosslinking Aracısı içeren aminler ve carboxylates19biomolecules conjugating için kullanılan popüler bir carbodiimide var. EDC ek olarak, en yaygın konjugasyon reaktif yüzey ve nanoparçacık konjugasyon reaksiyonları20,21N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) olduğunu. NHS yan tepkileri azaltmak ve istikrarı geliştirmek ve ester verimini22,23ara ürün.
Burada, plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri sentezleme için bir protokol açıklayın. İlk olarak, DOX yüklü lipid-polimer nano tanecikleri (DNPs) tek adım sonication sentezi açıklanmıştır. Sonra plCSA-BP-Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri üretmek için EDC/NHS bioconjugate tekniği tanıttı. Bu bioconjugate teknik diğer antikorlar ve peptidler nano tanecikleri için çekimlerine de kullanılabilir. Son olarak, biz plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri karakterize etmek için kullanılan Fizikokimyasal özellikleri ve vitro tahlil tanımlamak. Bizce bu plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri en insani kanser ve plasental bozuklukları tedavi plasenta payloads hedeflenen teslimini ilaçlara hedeflenen teslimat için etkili bir sistem teşkil edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stok çözümleri hazırlanması
- %4 etanol sulu bir çözüm mutlak etanol 4 mL 100 mL Ultrasaf Su ile sulandrarak hazırlayın. Çözüm 4 ° C'de depolayın
Not: Ultrasaf Su kirleticileri bakteri, partiküller, iyonlar veya enzimler gibi susuz olarak tanımlanır. Ultrasaf Su bir su arıtma sisteminden düşük anyonik kirlenme anlamına gelir kadar 18,2 mΩ·cm bir hedef direnci ile elde edildi. - 1 mg/mL Soya lesitin hisse senedi çözüm Soya lesitin 20 mL % 4 etanol sulu çözeltisi içinde 20 mg çözülerek hazırlayın. Soya lesitin hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
- Bir 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH hisse senedi çözüm DSPE-PEG-COOH 100 mg 4 ml % 4 etanol sulu çözüm çözülerek hazırlayın. Mağaza-20 ° C'de hisse senedi çözüm
- Bir 10 mg/mL DOX 50 mg 5 ml Ultrasaf Su çözülerek DOX hisse senedi çözüm hazırlamak. Karanlıkta DOX hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın.
- 2 mg/mL PLGA hisse senedi çözüm PLGA 20 mg 10 ml Asetonitril çözülerek hazırlayın. PLGA hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
Dikkat: Asetonitril yanıcı ve zehirli. Bir duman başlıklı özenle faaliyet ve laboratuvar mont, koruyucu gözlük ve lateks eldiven gibi uygun kişisel donanımları. - Bir 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic asit (MES, pH 6.0) hisse senedi çözüm MES 2.17 g Ultrasaf Su 100 ml çözülerek hazırlayın. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
2. DNPs sentezi
Not: DOX fotokimyasal yıkımı önlemek için tüm işlemleri karanlıkta gerçekleştirilmiştir.
Nano tanecikleri tarafından daha önce raporlanmış tek adım sonication yöntemi11,13,14sentez.
- %4 etanol sulu çözüm 3 mL steril 10 mL santrifüj tüpü ekleyin. Sonra Soya lesitin hisse senedi çözüm 90 µg, 210 µg DSPE-PEG-COOH hisse senedi çözüm ve 750 µg DOX hisse senedi çözümün 3 mL % 4 etanol sulu çözüm ekleyin.
- Santrifüj tüpü bir buz banyosu yerleştirin ve buz banyosu ultrasonik bir işlemci yerleştirin.
- 1 mL şırınga ile 2 mg (1 damla/4-6 s) PLGA hisse senedi çözüm dropwise santrifüj tüpüne pipet. Bu arada, DNPs sentezlemek için 20 kHz Frekans ve %30 5 min için bir çıkış genliği ultrasonik bir işlemci kullanarak tüp solüsyon içeren temizleyicide.
Not: küçük boyutları ile Tekdüzen parçacıklar sentezlemek için hangi PLGA çözüm tüpün içine damladı hızı yavaş olması gerekir ve kabarcık üretimi kaçınılmalıdır. - DNPs 0.1 M MES arabellek (pH 6.0) Yukarıdaki çözüm yıkayarak arındırmak 3 kez bir santrifüj filtre (MWCO, 10 kDa) kullanarak. Santrifüj 4 ° C'de ve 1000 × g 3 dk her zaman için. Son olarak, yaklaşık 1 mL nano tanecikleri MES çözüldü kalmalıdır.
Not: Bu yordam bir kabul edilebilir durdurma noktasıdır. Yoksa peptidler çekimlerine kullanılan, nano tanecikleri PBS arabellek (pH 7,4) tarafından saf ve saf DNPs-ebilmek var olmak stok içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de.
3. DNPs için peptidler konjugasyon
-
Ester etkinleştirme
- EDC 0.4 mg eklemek (son konsantrasyonu 2 mM) DNPs 1 ml.
- NHS 0,24 mg için tepki eklemek (son konsantrasyonu 2 mM).
Not: reaktifleri çözünmüş ve hemen kullanımı için EDC ve NHS doğru miktarı kolay eklenmesi, hisse senedi bir çözüm hazır. - Reaksiyon bileşenleri karıştırın ve tepki bir shaker yerleştirin; tepki için 30 dk - 1 saat içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında izin verir.
-
Amin tepki
- 7.2-7,5 kullanarak arabellek pH artırmak PBS (20 ×, pH 7,4).
- Reaksiyon 0.5 mg plCSA hedefleme peptid (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) ekleyin.
Not: toplamadan önce % 20 Asetonitril peptidler geçiyoruz. Peptidler eriyen değilseniz, bir banyo sonicator sonication yararlı olabilir. - Çözüm karıştırın ve bir shaker yerleştirin; reaksiyon gecede karanlıkta 4 ° C'de devam etmek izin verir.
- Yer eşlenik çözüm diyaliz torbalar içine (MWCO, 3500 Da) diyaliz ve plCSA-DNPs arındırmak için 24 saat içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında PBS (pH 7,4) arabellek kullanarak.
Not: Alternatif olarak, adım olduğu gibi plCSA-DNPs elde etmek için 2.4 arıtma yerine olabilir. - Hücre kültür uygulamaları için potansiyel precipitates kaldırmak için bir 0,22 µm steril enjektör filtreden Sulandırılan çözüm filtre.
4. plCSA hedefli Lipid karakterizasyonu-polimer nano tanecikleri
-
Dinamik ışık saçılma (DL) kullanarak hidrodinamik nanopartikül boyut ölçümü
- Ultrasaf Su (50-fold seyreltme) ile nano tanecikleri sulandırmak. Örnek 500 µL DLS veya zeta potansiyel enstrümanın talimatlara göre bir küvet içine yükleyin.
Not: Zeta potansiyeli ve DLS cuvettes cihazın özelliklerine göre farklı olabilir. - Ölçüm tamamlandıktan sonra parçacık çapı, polydispersity dizin (PDI) ve zeta potansiyel kaydetmek. Ortalama 4'ten elde edilen sonuçları okuma tekrarlanan ve standart sapmayı hesaplamak.
- Ultrasaf Su (50-fold seyreltme) ile nano tanecikleri sulandırmak. Örnek 500 µL DLS veya zeta potansiyel enstrümanın talimatlara göre bir küvet içine yükleyin.
-
Transmisyon Elektron mikroskobu (TEM)
Not: Nano tanecikleri morfolojisi negatif leke yöntemiyle TEM tarafından gözlenmiştir. 24- Ultrasaf Su (400-fold seyreltme) ile nano tanecikleri sulandırmak. Örnek bir TEM ızgara üzerine 20 µL ekleyin ve 5 min için oturmak sağlar.
- %2 (w/v) phosphotungstic asit 100 µL ekleyin ve damlacık 2 dk. için fitil uzakta oturmak.
- Oda sıcaklığında TEM kılavuz kuru.
- TEM ivme gerilim 80 küme kV ve nano tanecikleri görselleştirmek için 100.000 × görüntüyü büyüt.
-
Kapsülleme verimliliği (EE) belirlenmesi ve LE
- Standart eğri üretimi. Beş farklı konsantrasyonlarda DOX çözümler hazırlamak için DOX ultrasaf su dağıtılması: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL ve 100 µg/mL. 480 DOX Solutions'da emilimini ölçmek nm UV-VIS Spektrometre ile. DOX konsantrasyonları dayalı standart bir eğri oluşturur.
- Nano tanecikleri 25 µL 500 µL Ultrasaf Su ile sulandırmak. Emme 480 ölçmek nm UV-VIS Spektrometre ile. İlaç konsantrasyonları tarafından standart eğri hesaplamak.
- LE aşağıdaki eşitliği kullanarak hesaplar:
LE = ((nano tanecikleri ilaçların miktarı) / (Toplam ağırlık malzemelerin)) × %100. - EE aşağıdaki eşitliği kullanarak hesaplar:
EE = ((nano tanecikleri ilaçların miktarı) / (miktarı ekledi uyuşturucu)) × %100.
-
Bicinchoninic asit (BCA) tahlil kullanarak konjugasyon verimlilik ölçümü 25 , 26 , 27
- Standart peptid çözümleri (Tablo 1) veya plCSA-DNPs 25 µL pipet Çoğalt Mikroplaka wells içine. Her şey için çalışma reaktif 200 µL ekleyip karıştırın plaka bir plaka shaker 30 üzerinde de s.
- Plaka kapağı ve 30 dakika için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 562 absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu üzerinde. PlCSA-DNPs plCSA konsantrasyonları hesaplamak için oluşturulan standart eğri'yi kullanın.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak konjugasyon verimlilik hesaplamak:
Konjugasyon verimliliği = ((nano tanecikleri peptid miktarı) / (miktarı ekledi peptid)) × %100.
| Şişe | Seyreltici (μL) hacmi | Birim ve peptid (μL) kaynağı | Son peptid konsantrasyonu (μg/mL) |
| A | 0 | stokunun 300 | 1000 |
| B | 250 | şişe bir seyreltme 250 | 500 |
| C | 250 | şişe B seyreltme 250 | 250 |
| D | 250 | şişe C seyreltme 250 | 125 |
| E | 300 | 200 tane şişe D seyreltme | 50 |
| F | 250 | şişe E seyreltme 250 | 25 |
| G | 400 | 100 şişe F seyreltme | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tablo 1. Standart peptidler hazırlanması
5. floresans mikroskobu değerlendirme Choriocarcinoma (JEG3) hücrelerdeki nanopartikül Alım plCSA hedefli
- Tohum hücreleri 1,0 × 10 steril 12-şey plakalar üzerine4 hücreleri/iyi ile tam DMEM/F12 (cDMEM/F12, % 1 penisilin/streptomisin ve % 10 fetal Sığır serum (FBS) içeren). Hücreleri % 60 izdiham 37 ° C ve % 5 CO2 nemli koşul altında büyümeye izin.
- Medyayı çıkarın ve 1 mL soğuk taze medya ile düşük serum içerik ekleyin (%5 FBS) ve DNPs ya da plCSA-DNPs (5 µg DOX eşdeğeri).
- Hücreleri ve 1 h için 4 ° C'de nano tanecikleri karışımı kuluçkaya.
- Sonra kuluçka, medyayı çıkarın ve hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Daha sonra 1 mL taze cDMEM/F12 ekleyin ve 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- CDMEM/F12 kaldırmak ve hücreleri üç kez PBS ile yıkayın.
- 2 mL soğuk %4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin ve hücreleri düzeltmek 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- PFA kaldırın. PBS 2 mL hücrelerle bir kez yıkayın. PBS DAPI içeren 1 mL ekleyin (1 µg/mL) için boyama, çekirdek ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- PBS Aspire edin ve hücreleri üç kez PBS ile yıkayın.
- Montaj orta ekleyin ve floresan DOX ve çekirdeği, sırasıyla görselleştirmek için mavi ve yeşil kanallarını kullanarak bir floresans mikroskobu ile görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol için PLGA, DSPE-PEG-COOH ve soya lesitin are bir temsilcisi polimer, lipit-PEG-COOH eşlenik ve lipid, anılan sıraya göre. Sonication yöntemi ile tek adım plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri ve EDC/NHS tekniği sentezi Şekil 1' de gösterilmiştir. İlk olarak, sonication koşullar altında Soya lesitin, PLGA ve Show DSPE-PEG-COOH formu çekirdek-kabuk için kendi kendine araya DNPs yapılandırılmış. Çekirdek PLGA ve kapsüllenmiş DOX oluşur, DSPE-PEG-COOH, kabuk oluşur ve soya lesitin monolayer kabuk ve çekirdek arayüzü yer alır. O zaman, DNP yüzeyinde maruz - COOH grupları -NH2 grupları peptid yolu ile plCSA-DNPs sentezlemek için EDC/NHS tekniği ile Birleşik.
Bu protokol için hazırlanan DNPs 82,3 ± 4.7 nm çapında vardı ve plCSA-BP için konjugasyon sonra birincil DNPs çapını 109.3 ± 5,9 nm (Şekil 2) arttı. PDI, DNPs ve plCSA-DNPs 0.127±0.005 ve 0,134 ± 0,065, sırasıyla yapıldı. DNPs ve plCSA-DNPs TEM görüntülerini de parçacıklar de dağınık ve genellikle küresel türleri morfoloji (Şekil 3) vardı gösterdi. -20.1 DNPs ve plCSA-DNPs zeta potansiyeli olduğunu ± 1,32 mV ve-29.9 ± 3,56 mV, sırasıyla (Tablo 2). Bu nedenle, bu nano tanecikleri son derece kararlı olduğu tahmin edilmektedir.
| Nano tanecikleri | Diameter(Nm) | PDI | Zeta Potansiyel (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity dizin. Verileri ortalama ± SD sunulmaktadır (n = 3). | |||
Tablo 2. Nano tanecikleri karakterizasyonu
EE ve nano tanecikleri LE klinik uygulamalar için önemlidir. DNPs ve plCSA-DNPs tarafından DOX EE 40,3 %1,67 ± ve %1.94 39,5 ±, sırasıyla oldu. DNPs ve plCSA-DNPs DOX LE 6.2 %0,74 ± ve %0,42 5.1 ±, sırasıyla oldu. Bu veriler, uyuşturucu yükleme ve uyuşturucu kapsülleme plCSA-BP dekorasyon sonra devam edildi gösterdi. PlCSA-BP DNPs yüzeyinde dekorasyon verimliliğini BCA tahlil (Şekil 4) tarafından tespit edilmiştir. PlCSA-BP konjugasyon verimliliği % 3.7 45,5 ± bulundu.
JEG3 hücresel alımını tahlil plCSA DNPs hızla 30 dk (Şekil 5) içinde JEG3 hücrelere bağlı belirtti. Bu nedenle, plCSA-BP verimli bir şekilde bu protokolü DNP yüzeye Birleşik. Ayrıca, plCSA-BP olabilir hızla JEG3 hücrelere bağlamak ve nano tanecikleri hücresel alımını artırmak.
Şekil 1. Şematik plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri sentezlemek için kullanılan yöntem. İlk olarak, bir tek adım sonication Yöntem lipid-polimer nano tanecikleri (DNPs) sentezlemek için kullanılmıştır ve sonra peptidler nanopartikül yüzeylere (plCSA-DNPs) çekimlerine EDC/NHS tekniği kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Boyut farklı nano tanecikleri dağılımı. DNPs (A) ve plCSA-DNPs (B) ölçülen DLS tarafından hidrodinamik boyutu. Temsilcisi partikül boyutu ve boyut dağıtım göstermek için bazındaki gibidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. TEM tarafından karakterize nanopartikül morfoloji. DNPs (A) ve (B) % 2 phosphotungstic asit boyama ile gözlenen plCSA DNPs tipik TEM görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. BCA tahlil kullanarak konjugasyon verimlilik ölçümü. 562, peptidler, standart eğri nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. JEG3 hücreleri tarafından nanopartikül alımını. JEG3 hücreleri, kuluçka 5 µg/mL farklı nano tanecikleri ile 30 dk sonra floresans mikroskobu tarafından analiz edildi. Kırmızı: DOX, mavi: çekirdeklerin DAPI etiketli. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı plCSA BP Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri sentezleme için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Lipid-polimer nano tanecikleri hazırlamak için tek adım sonication Yöntem hızlı, tekrarlanabilir ve Isıtma, vortexing veya buharlaşma içeren tipik nanoprecipitation yöntemlerden farklı değildir. Bu nedenle, Gelişmiş Yöntem sentez zaman önemli ölçüde azaltır. Buna ek olarak, bu protokol için kullanılan EDC/NHS bioconjugate peptidler ve nano tanecikleri antikorlar çekimlerine bir yaygın olarak kullanılan ve uygun tekniktir. Bu nedenle, kasanın plCSA hedefleme lipid-polimer sentez için EDC/NHS bioconjugate tekniği ile tek adım sonication yönteminin nano tanecikleri klinik uygulamalar için ölçeklenebilir.
Bazı prosedürleri başarıyla sentezleme ve plCSA-DNPs karakterize için kritik öneme sahiptir. Öncelikle, lesitin, PLGA ve DSPE-PEG-COOH göreli konsantrasyonları polydispersity ve lipid-polimer nanopartikül boyutu belirleyin. Ne zaman lesitin konsantrasyon sabittir, alt polydispersity DSPE-PEG-COOH sonuçlarında daha yüksek bir konsantrasyon ve daha küçük bir nanopartikül boyutu,13,15 sonuç olarak uyuşturucu LE azalır. PLGA konsantrasyonu düzeltildiğinde, daha fazla DSPE-PEG-COOH daha yüksek nanopartikül polydispersity ve daha büyük nanopartikül boyutu15önde gelen lesitin tarafından değiştirilir. Bu durumda, nano tanecikleri daha kararsız ve toplama kolayca. Bu iletişim kuralı ' DSPE-PEG-COOH/PLGA ağırlık oranı 0,11 ve 0,43 lesitin/DSPE-PEG-COOH kitle oranıdır. Yaklaşık 82 lipid-polimer nanopartikül boyutudur nm, yaklaşık 0,127 PDI ile.
İkinci olarak, çözüm için nano tanecikleri peptidler konjugasyon sırasında pH son derece önemlidir. Ester harekete geçirmek en uygun pH 5,0-6.0, ve amin tepki pH 7.2-7,519,28,29, en verimli. En iyi sonuçlar için iki adımda tepki yapılmalıdır. İlk olarak, ester etkinleştirme pH 5,0-6.0 MES (veya başka bir noncarboxylate, nonamine arabellek) oluşuyor. O zaman, pH 7.2-7,5 kullanmadan PBS (veya başka bir nonamine arabellek) hemen önce Amin içeren molekül19ile reaksiyonu için ayarlanır. NHS esterleri yarı ömrü 4-5 h pH 7,019olduğunu göz önünde bulundurursak, Amin tepki süresi 4 ° C'de 10 h aşıyor
Son kritik faktör nanopartikül alımını olduğunu. Nontargeted DNPs JGE3 hücreleri tarafından alımını hedeflenen alımı işlev analizinde kültür zaman ve sıcaklık ve FBS konsantrasyon orta kontrol ederek ortadan kaldırıldı. Bu protokol için JEG3 hücreleri % 5 ile inkübe FBS 1 s ve o zaman 30 dk 37 ° C'de kültürlü için 4 ° C'de DNP hücresel alımını en aza indirmek için.
İşlem sırasında sorunlar ortaya çıkarsa, sentez ve karakterizasyonu plCSA-DNPs ile ilgili üç önemli sorun giderme adımları vardır. İlk olarak, lipit-polimer nano tanecikleri tarafından hazırlanan kendinden montajlı, PLGA ve lesitin sonication koşullar altında. PLGA sadece organik çözücü içinde çözülür. Bu nedenle, hidrofilik bir çözücü için ek PLGA hızlı bir şekilde küçük nano tanecikleri precipitates. Dropwise yanı sıra hız etkisini en aza indirmek ve daha büyük partiküller oluşturulmasını engellemek için 1-2 min için karışım sonication PLGA eklemeden önce gereklidir. İkinci olarak, kantitatif analiz BCA yöntemiyle plCSA-BP konjugasyon verimlilik hızlı ve uygun olsa da, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) tahlil daha doğru olur. HPLC deneysel detayları olmuştur bizim grup11 ve diğerleri tarafından açıklanan30,31,32. Son olarak, plCSA-DNP hücresel alımı için en uygun koşulları diğer kanser hücreleri için farklı olabilir. Yavaş yavaş FBS konsantrasyon azalan ve artan yaşam kuluçka süresi 37 ° C'de optimal koşullar belirlemenize yardımcı.
Bir protokol hydrophobicity ilaçların uyuşturucu EE belirler kısıtlamasıdır. Hidrofilik ilaçlar ile karşılaştırıldığında, hidrofobik ilaçların bir artan uyuşturucu EE sonuç PLGA için daha güçlü bir ilgi var. Bu durumda, yordamlar plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri sentezi için ideal ilaç LE ve EE sonuçlar en verimli sentez yöntemi belirlemek için deneysel olarak incelenmesi gerekir.
Yukarıda belirtildiği gibi özellikle çoğu kanser hücreleri ve plasental trophoblasts glikozaminoglikan plCSA ifade edilir. Bu nedenle, plCSA-NPs therapeutics hedeflenen teslimat tümör hücreleri sadece nonpregnant hayvanlar ve insanlar için kullanılması gerektiğini ve bu uyuşturucu yüklü parçacıklar yan etkileri hamile hayvan plasenta içinde yol açacak unutmamak önemlidir ve insanlar.
Özetle, biz plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri sentezlemek için basit ve uygun bir yöntem anlatmıştık. Bu tümörler ve plasenta, uyuşturucu kullanılabilirliğine eşlik eden toksisite en aza indirerek artırır bu protokolü önem taşıyor. Bu yaklaşım uyuşturucu hedeflenen teslimat tümörleri ve plasenta için yararlı olmalı ve plCSA hedefli lipid-polimer nano tanecikleri geleceğe klinik uygulamalar için hazırlamak için ölçekli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. ve B.Z. mucitler patent PCT/CN2017/108646 ve bir plCSA hedefli nanoparçacık sentezi yöntemi ve uygulama kapsayan SIAT tarafından gönderilmiş 201710906587.6 vardır. Hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları diğer yazarlar tarafından açıklanması.
Acknowledgments
Bu eser hibe tarafından ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (2016YFC1000402), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81571445 ve 81771617) ve Guangdong Eyaleti doğal Bilim Vakfı (2016A030313178) için desteklenen X.F. ve X.F. için Shenzhen temel araştırma fonu (JCYJ20170413165233512)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
