哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定

摘要

本文介绍一种基于荧光的高通量检测方法，通过活细胞的荧光定量和成像分析来测定质膜修复效率。该方法可用于筛选调控哺乳动物细胞质膜修复的药物或靶基因。

摘要

在生理环境中，哺乳动物细胞常受到机械和生化应激，导致质膜损伤。针对这些损伤，复杂的分子机制会迅速重新封闭质膜，以恢复其屏障功能并维持细胞存活。尽管该领域已有60年的研究历史，我们对细胞膜修复机制仍缺乏全面理解。为了鉴定调控质膜修复的细胞组分或可增强修复能力的药物，我们开发了一种基于荧光的高通量检测方法，用于测定培养于微孔板中的哺乳动物细胞的质膜修复效率。作为质膜损伤的模型系统，细胞暴露于细菌来源的成孔毒素——单核细胞增生李斯特菌溶血素O（listeriolysin O, LLO），该毒素可在含胆固醇的膜上形成直径约30–50 nm的大蛋白孔。利用温度可控的多功能微孔板读板仪，可对活细胞进行快速、灵敏的光谱荧光检测，并同步获取明场和荧光显微图像。通过分析膜不通透性核酸结合荧光染料所发射荧光强度的动力学变化，可反映细胞群体水平上的膜损伤与修复程度，从而计算细胞修复效率。荧光显微成像可用于计数每个微孔中稳定表达核蛋白组蛋白2B（histone 2B）荧光融合蛋白的细胞，以校正细胞数量可能存在的差异，并可最终识别不同的细胞亚群。该高通量检测方法是一种强大工具，有望通过筛选调控质膜修复的宿主基因或外源添加化合物，进一步拓展我们对膜修复机制的理解。

引言

哺乳动物细胞会受到机械、渗透和生化应激的影响，导致细胞质膜完整性丧失。若不能迅速而有效地重新封闭，受损细胞将很快发生程序性死亡或坏死性死亡。自20世纪60年代以来，由于质膜修复功能障碍可导致严重后果，人们对质膜修复过程的理解不断深入。事实上，肢带型肌营养不良症、糖尿病和Chediak-Higashi综合征等疾病分别与编码dysferlin的基因突变、晚期糖基化终末产物的积累以及溶酶体转运调节因子CHS1缺陷导致的质膜修复功能缺陷相关^1,2,3,4,5,6。然而，迄今为止，我们对质膜修复机制的理解仍然有限⁷。早期研究表明，质膜修复由细胞外Ca²⁺通过受损质膜内流所启动^8,9,10。此后，已有数种非互斥的Ca²⁺依赖性机制被提出以解释细胞修复过程。其中“膜片假说”认为，在损伤部位附近，细胞内囊泡相互融合并与受损质膜融合，形成修补性膜片^11,12,13,14。第二种模型提出，在损伤部位发生钙依赖性溶酶体外排，释放溶酶体酶酸性鞘磷脂酶，该酶将质膜外小叶中的鞘磷脂转化为神经酰胺。这种脂质组成的突然变化促使受损区域通过神经酰胺介导的内吞作用被清除^15,16,17。最后，第三种被提出的机制涉及运输所需内体分选复合物（ESCRT）的作用，其促进形成从质膜向外出芽的囊泡¹⁸。在这些模型中仅鉴定出有限数量的蛋白质，其分子机制仍需进一步阐明。 

本文描述了一种高通量检测方法，用于测量经重组单核细胞增生李斯特菌溶血素O（listeriolysin O, LLO）介导损伤后，贴壁哺乳动物细胞的质膜修复效率¹⁹。LLO是由兼性胞内病原体单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）分泌的一种成孔毒素（pore-forming toxin, PFT）^20,21,22，属于MACPF/CDC（膜攻击复合物、穿孔素和胆固醇依赖性溶细胞素）超家族。MACPF蛋白是参与免疫防御的哺乳动物成孔蛋白，而CDC则主要由革兰氏阳性病原菌产生，通过破坏宿主细胞以促进其致病生活方式²³。CDC以水溶性单体或二聚体形式合成，可结合质膜中的胆固醇，并寡聚化形成最多包含50个亚基的前孔复合物。该前孔复合物随后发生重排，将β链插入脂双层中，形成贯穿膜结构的β桶状孔道，直径约为30–50 nm^24,25,26,27。  这些大孔允许离子和小分子细胞组分在细胞内外流动；然而，也有研究提出可能存在更小尺寸的孔道^28,29,30。在所有CDC家族成员中，LLO具有独特的性质，包括不可逆的pH和温度依赖性聚集特性，这使其适用于高通量分析^31,32。LLO可在4 ˚C条件下加入细胞培养基中，此温度允许毒素与细胞结合，但不足以启动孔复合物的形成。随后通过将温度升至37 ˚C，可同步启动成孔过程，促使毒素分子在膜平面内高效扩散并形成寡聚体，同时完成孔道生成所需的构象重塑。因此，在温度转换之后，细胞损伤的动力学将取决于结合到质膜上的毒素量。重要的是，未结合到质膜的可溶性LLO在温度达到37 ˚C时会迅速且不可逆地聚集，从而无需洗涤去除未结合的毒素分子，并能随时间推移限制膜损伤的进一步扩展。最后，由于LLO可结合胆固醇并在富含胆固醇的膜上形成孔道，该检测方法适用于多种哺乳动物细胞。需要注意的是，LLO主要通过成孔作用影响宿主细胞信号通路，尽管在少数情况下也可能发生非依赖于孔道的细胞信号传导^{33,34,35,36,37,38,39}。因此，不能排除LLO的信号活性可能对膜修复过程产生影响。 

该实验通过检测细胞非渗透性荧光染料的摄入量，直接评估细胞损伤程度（例如，碘化丙啶）可被动进入受损细胞，并在与核酸结合后产生强烈荧光。因此，该荧光染料可在整个实验过程中持续存在于细胞培养基中，从而实现对细胞损伤的实时分析。核酸结合染料的荧光强度将随毒素浓度的增加而增强；对于特定浓度的毒素，荧光强度将随时间延长而上升，直至所有孔道形成、细胞完成修复或达到饱和状态。细胞外 Ca²⁺ 的内流²⁺ 通过膜孔是一种 必要条件 用于重新封闭的事件。因此，通过比较含有Ca的培养基中的细胞损伤情况，可间接证明重新封闭的效率²⁺ （允许修复的条件）至Ca损伤²⁺无血清培养基（修复限制性条件）。由于核酸结合染料的荧光强度与每孔中的细胞浓度成正比，因此在所有孔中以相同浓度接种细胞至关重要。此外，必须在实验前后对每孔中的细胞进行计数，以确保未发生细胞脱落，因为悬浮的聚集细胞可能干扰荧光读数，进而影响数据解读。为实现细胞计数，本实验使用表达核定位组蛋白2B-GFP（H2B-GFP）的细胞。温度可控的多功能微孔板读板仪可结合快速、高通量的荧光强度检测（采用96或384孔板格式）与在37 °C条件下对活细胞进行显微成像。后者可用于细胞数量统计，并观察不同细胞群体的形成过程。

最终，该检测方法使研究人员能够通过筛选调控细胞膜修复的宿主分子或外源添加的化合物，进一步拓展对膜修复机制复杂性的认识。以下实验方案描述了检测细胞在暴露于LLO后膜的再封闭效率，并评估特定药物或细胞处理对再封闭效率影响的实验步骤。 

方案

1. 准备

1. 细胞铺板
   注意：本方案中使用了人宫颈上皮细胞 HeLa 及表达组蛋白 2B-GFP（H2B-GFP）的 HeLa 细胞，但该检测方法可适用于其他哺乳动物细胞¹⁹。
   1. 用 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 洗涤细胞，使贴壁细胞从 75 cm² 细胞培养瓶中脱离。弃去用过的胰蛋白酶，加入 2 mL 新鲜的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
   2. 在 37 ˚C 下孵育 5 分钟，直至细胞变圆并从培养瓶表面脱落。
   3. 用 8 mL 生长培养基（含 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM）重悬细胞。
   4. 使用血细胞计数板和 10 µL 细胞悬液测定细胞浓度。
   5. 用生长培养基将细胞稀释至浓度为 2.5 × 10⁵ 个细胞/mL。
   6. 将细胞悬液倒入无菌移液盆中，使用 10 mL 移液管充分混匀。
   7. 使用 12 道多通道移液器和 200 µL 吸头，将 HeLa 细胞（每孔 100 µL，含 2.5 × 10⁴ 个细胞）以三复孔（或四复孔）形式加入 96 孔平底、透明底、黑色聚苯乙烯组织培养处理板中。
      注意：铺板布局示例见 图 1。
   8. 将细胞置于 37 ˚C、5% CO₂ 的加湿细胞培养箱中培养 24 小时。
2. 储备液配制
   1. 通过将 95 g 汉克斯平衡盐溶液、0.476 g MgCl₂（5 mM）和 23.83 g HEPES（100 mM）加入 900 mL 水中，配制 1 L 的 10× 缓冲液 M 储备液（用于配制 M1 和 M2）。调节 pH 至 7.4，并加水定容至 1 L。过滤除菌。
   2. 将 11.26 g D-(+)-葡萄糖溶于水，定容至 50 mL，配制 50 mL 的 50×（1.25 M）葡萄糖储备液。过滤除菌。
   3. 将 0.666 g CaCl₂ 溶于水，定容至 50 mL，配制 50 mL 的 100×（120 mM）钙储备液。过滤除菌。
   4. 将 0.951 g EGTA 溶于 40 mL 水中，配制 50 mL 的 10×（50 mM）EGTA 储备液。用 NaOH 调节 pH 至 8 以溶解 EGTA，然后加水定容至 50 mL。过滤除菌。
   5. 针对单个 96 孔板，分别配制 50 mL 培养基 1（M1，含 Ca²⁺）、50 mL 培养基 2（M2，无 Ca²⁺）以及 15 mL 添加 EGTA 的 M2 培养基：
      1. 配制 M1：将 5 mL 10× 缓冲液 M、0.5 mL 100× CaCl₂ 和 1 mL 50× 葡萄糖加入 43.5 mL 水中。
      2. 配制 M2：将 5 mL 10× 缓冲液 M 和 1 mL 50× 葡萄糖加入 44 mL 水中。
      3. 配制 M2/EGTA：将 1.5 mL 10× 缓冲液 M 和 1.5 mL 10× EGTA 加入 12 mL 水中。
         注意：所有含碘化丙啶（PI）的溶液均应在加入细胞前立即配制。
3. 酶标仪/成像细胞仪设置
   注意：使用配备两个检测单元（光谱荧光仪和成像细胞仪）的多功能酶标仪。限制荧光曝光时间以避免荧光染料光漂白。
   1. 在进行检测前，将酶标仪预热至 37 °C。
   2. 在 设置 模式下，根据需要设置动力学检测参数：
      1. 分别选择 单色器、FL（荧光） 和 动力学 作为光学配置、读数模式和读数类型。
      2. 在 波长设置 下，分别选择 9 nm 和 15 nm 的激发和发射带宽。对于使用碘化丙啶（PI）的检测，将激发和发射波长分别设为 535 nm 和 617 nm。
      3. 在 板类型 下，选择 96 孔 板格式，并选择与黑壁透明底板相对应的预设板配置。
      4. 在 读取区域 下，标出将在整个动力学过程中分析的孔位。
      5. 在 PMT 和光学 下，预设每次读数的闪光次数为 6，并勾选 从底部读取 选项。
      6. 在 时间设置 下，在 总运行时间 框中输入 00:30:00 以进行 30 分钟的动力学检测，并在 间隔 框中输入 00:05:00。
         注意：对于每个时间点和一个波长，完整读取一块 96 孔板所需时间为 30 秒。
      7. 确认右侧 设置信息 中的指定参数，然后选择 确定。点击 读取 以启动动力学运行。
   3. 在设置模式下相应地设置成像参数：
      1. 分别选择 Minimax、成像 和 终点 作为光学配置、读数模式和读数类型。
      2. 在 波长 下，选择 透射光，以及对应于 456/541 nm（GFP）和 625/713 nm（PI）激发和发射波长的荧光通道（可选其一或两者）。
      3. 使用与步骤 1.3.2.3 和 1.3.2.4 中定义相同的 板类型 和 读取区域 选项。
      4. 在 孔内成像区域设置 下，选择每个孔内要成像的位点数量。
         注意：12 个位点对应全孔图像。
      5. 在 图像采集设置 下，设置透射光、541 nm（GFP）和 713 nm（PI）的曝光时间。对于 GFP，以 20 ms/图像的曝光时间对整个孔进行成像；对于透射光（TL）和 PI 荧光，以 8 ms 和 20 ms 的曝光时间分别采集每个孔中心的单张图像。
      6. 确认右侧 设置信息 中的指定参数，然后选择 确定。对一块 96 孔板的每个孔全表面（每孔 12 张图像）进行成像，且针对一个波长的采集时间约为 15 分钟。点击 读取 以开始成像。
         注意：对一块 96 孔板每孔单张图像的采集，针对一个波长约需 2.5 分钟/板。上述参数对应于本实验室特定设备。光谱荧光测量：采用氙闪光灯，激发波长步进 1.0 nm（250–850 nm），可调激发带宽为 9 或 15 nm，光电倍增管检测器具有 > 6 个对数级动态范围，可调发射带宽为 15 或 25 nm。成像细胞仪：照明光源可提供白光、460 nm 和 625 nm 激发波长（带宽 20 nm），发射滤光片中心波长分别为 541 nm（108 nm 带宽）和 713 nm（123 nm 带宽），配备 4× 物镜和 1.25 百万像素 12 位电荷耦合器件相机。

2. 检测

注意：进行检测时，细胞融合度必须为70-90%。在洗涤步骤中，应从孔板侧壁移除和加入培养基（避免直接加在细胞上方）。在步骤3.1.5之前，需将LLO温度保持在< 4 ˚C，以防止其发生聚集。

1. 在37 °C预热的M1培养基中配制30 µM PI储备液，在37 °C预热的M2培养基中配制另一份30 µM PI储备液。
2. 使用12通道多通道移液器和200 µL吸头，按以下步骤轻柔洗涤1号板中的细胞：
   1. 对于允许修复的条件，吸去生长培养基，用37 °C预热的M1培养基每孔200 µL洗涤细胞两次。随后更换为每孔100 µL含30 µM PI的温热M1培养基。
   2. 对于限制修复的条件，吸去生长培养基，先用每孔200 µL含5 mM EGTA的温热M2培养基洗涤一次以螯合Ca²⁺，再用每孔200 µL M2培养基洗涤一次。随后更换为每孔100 µL含30 µM PI的温热M2培养基。
   3. 在生长培养基被洗涤并替换为含碘化丙啶的培养基后，直接进入步骤2.1.3。
3. 按照1.3.3节所述条件，对1号板进行透射光、GFP和PI成像（动力学前成像）。此步骤耗时15–20分钟。
4. 在步骤2.1.3的15分钟期间，使用12通道多通道移液器和200 µL吸头按以下步骤准备2号板：
   1. 将一个96孔圆底聚丙烯微量板置于冰上。根据1号板的实验设计配置该板（图1）。
   2. 对于允许修复的条件，每孔加入100 µL含60 µM PI的冰冻M1培养基，随后每孔加入100 µL含4倍LLO或不含LLO（对照）的冰冻M1培养基。
   3. 对于限制修复的条件，每孔加入100 µL含60 µM PI的冰冻M2培养基，随后每孔加入100 µL含4倍LLO或不含LLO（对照）的冰冻M2培养基。
5. 完成1号板成像（步骤2.1.3）后，立即将其置于冰上，并使用铝箔将板与冰直接隔离。让1号板冷却5分钟。
6. 使用12通道多通道移液器和200 µL吸头，将每孔100 µL液体从1号板转移至2号板（步骤2.1.4）中对应孔位。为使毒素在1号板培养基中充分分散，将吸头插入弯月面以下，轻柔排液，避免产生气泡。
   注意：不要反复吹打，以免意外导致细胞脱落。
7. 静置额外1分钟，使毒素充分结合细胞，随后立即将1号板转移至酶标仪中，使用荧光分光光度模式进行动力学检测（步骤1.3.2）。
8. 动力学检测结束后，立即使用步骤1.3.3对1号板进行成像（动力学后成像）。

3. 分析：细胞计数

1. 使用微孔板细胞计数软件，根据细胞核荧光确定细胞数量。
   1. 在设置中，选择重新分析，在图像分析设置的类别部分中，选择使用波长541进行目标识别的离散对象分析。
   2. 在“查找目标”选项中，使用在图像上绘制的查找方法，在设置选项卡下选择细胞核，然后点击应用。
   3. 点击确定和读取，以启动细胞计数算法。
2. 或者，若无此类工具，可使用ImageJ等图像分析软件进行细胞计数。
   1. 在ImageJ中，将图像文件作为图像栈打开。
   2. 通过点击菜单栏中的图像，将图像栈转换为8位灰度图像，将鼠标悬停在类型上，然后选择8位。
   3. 减去背景：点击菜单栏中的图像，将鼠标悬停在调整上，然后选择亮度/对比度。调整最小值以去除背景噪声，并选择应用。
   4. 设定阈值以生成二值图像：点击菜单栏中的图像，将鼠标悬停在调整上，然后选择阈值。选择暗背景，调整最小和最大阈值，并点击应用。
   5. 对于重叠的细胞核，可使用Watershed工具进行分割。点击菜单中的处理，将鼠标悬停在二值化上，然后选择Watershed。
      注：此操作将自动分离相连的细胞核。
   6. 通过应用用户自定义的标准（大小和圆形度）分析掩膜图像，以优化细胞核的识别并排除细胞碎片。
      1. 点击菜单中的分析，然后选择分析颗粒。设置合适的大小范围（像素²）和圆形度范围（值为1表示完美圆形），以充分包含单个细胞/细胞核。
      2. 在“显示”下拉框中选择所需选项，勾选汇总，然后点击确定以获得细胞计数结果。

4. 分析：动力学曲线

1. 将动力学数据从酶标仪软件转移至数据分析软件。
2. 针对每种实验条件，计算每个时间点重复样本的荧光强度平均值，以及相应的标准差和均值标准误。
3. 针对每种实验条件，绘制相应的动力学曲线：PI 强度（y 轴）随时间（x 轴）的变化曲线。
4. 为计算特定处理条件下的膜修复效率，需计算 M1 中 +LLO 的曲线下面积（AUC(M1)）和 M2 中 +LLO 的曲线下面积（AUC(M2)）。采用以下建议的方法评估修复效率（E）：
   
5. 通过计算下述效率比（R_Eff），对对照组与测试处理组进行比较：
   
   R_EFF = 1，测试处理对修复无影响
   R_EFF < 1，测试处理抑制修复
   R_EFF > 1，测试处理促进修复
6. 使用以下方程计算曲线下面积：
   ，其中 k 为随访总次数。

结果

细胞计数准确性：HeLa 细胞常被用作研究膜修复机制的模式哺乳动物细胞系。在群体水平评估膜修复时，为确保数据的正确解读，必须在所有孔中以相同浓度接种细胞。此外，在检测时验证各孔中的细胞数量相等也至关重要。本实验引入了稳定表达组蛋白 2B 与 GFP 融合蛋白（H2B-GFP）的 HeLa 细胞，通过检测其荧光标记的细胞核实现细胞的自动计数。为验证细胞计数的准确性，将 HeLa H2B-GFP 细胞进行两倍系列稀释后，以每组三个复孔的形式接种于 96 孔板中，并培养 4 小时。该时间足以使细胞贴壁，同时细胞分裂极少。使用透射光（TL）和 GFP 荧光照明对所有孔成像，并利用酶标仪分析软件基于 GFP 荧光进行细胞计数（图 2A 和 2B）。将平均细胞计数值 ± 标准差对细胞接种浓度作图，最佳拟合直线显示细胞计数与接种细胞数之比为 1.08:1，证明了计数的准确性（图 2C）。通过在动力学检测前对所有孔进行成像，可确保各孔间...

讨论

该实验通过高通量方式在细胞群体水平上测量细胞膜修复的效率，可用于筛选影响细胞膜修复的细胞组分或药物文库。所述实验采用96孔板格式，但也可适配为384孔板以实现更高通量。该实验的一个优势在于能够对贴壁活细胞进行实时荧光检测，无需进行细胞消化、固定或固定后荧光标记等繁琐的细胞处理步骤。多功能酶标仪（如本方案中所使用的仪器）具有足够的灵敏度，可在低至30秒的时间间隔内对96孔板进行快速荧光光谱检测。荧光图像的采集可提供额外信息，包括细胞计数、细胞形态的潜在变化以及不同细胞群体的可能识别。本实验方法不能揭示单个细胞水平上细胞膜修复的动力学过程，但可鉴定出能够以正面或负面方式影响细胞群体水平膜修复过程的实验条件（如药理学化合物或细胞组分）。

已开发出多种其他实验方法用于评估膜修复机制。例如，通过微针穿刺、微珠摩擦和激光消融等机械性损伤手段已被用于模拟机械性膜损伤。对损伤/修复的检测通常采用荧光显微镜或流式细胞术，通过定量荧光探针（FM 1-43、碘化丙啶、荧光素偶联葡聚糖）的进入，或追踪荧光蛋白嵌合体^47,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 成像细胞仪	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	赛默飞世尔科技	T3605
碘化丙啶	赛默飞世尔科技	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	默克密理博	SCC117
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25200056
康宁96孔平底黑色聚苯乙烯组织培养处理板	康宁	3603
Hanks' 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-葡萄糖，HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG