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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Qui descriviamo un'analisi fluorescenza-basata di alto-rendimento che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza attraverso analisi fluorometriche e imaging in cellule viventi. Questo test può essere utilizzato per lo screening di farmaci o geni che regolano la chiusura della membrana plasmatica in cellule di mammifero.

Abstract

Nel loro ambiente fisiologico, cellule di mammiferi sono spesso sottoposti a sollecitazioni meccaniche e biochimiche che si traducono in danno della membrana del plasma. In risposta a questi danni, complessi macchinari molecolari risigillare rapidamente la membrana plasmatica per ripristinare la sua funzione di barriera e mantenere la sopravvivenza delle cellule. Nonostante i 60 anni di ricerca in questo campo, ci manca ancora una conoscenza approfondita della cella una chiusura di macchinari. Con l'obiettivo di identificare componenti cellulari che controllo chiusura della membrana plasmatica o farmaci che possono migliorare la risigillazione, abbiamo sviluppato un'analisi di alto-rendimento fluorescenza-basata che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero coltivate in piastre microtiter. Come sistema modello per danno della membrana del plasma, le cellule sono esposte per la Listeriolisina di tossina batterica pore-forming O (LLO), che forma il grande 30-50 nm di diametro proteinico pori in colesterolo-contenere le membrane. L'uso di un lettore di micropiastre a modalità multipla temperatura controllata permette misurazioni rapide e sensibili spectrofluorometric in combinazione con campo chiaro e formazione immagine di microscopia di fluorescenza delle cellule viventi. Analisi cinetica dell'intensità di fluorescenza emessa da un fluorocromo acido nucleico-associazione impermeant membrana riflette l'estensione della membrana ferendo e una chiusura a livello di popolazione cellulare, consentendo per il calcolo della cella efficienza una chiusura della . Formazione immagine di microscopia di fluorescenza consente l'enumerazione delle cellule, che costitutivamente esprimono una chimera fluorescente del nucleare della proteina istone 2B, in ciascun pozzetto della micropiastra per tener conto delle variazioni di potenziale nel loro numero e permette per eventuali identificazione di popolazioni distinte delle cellule. Questa analisi di alto-rendimento è un potente strumento prevede di espandere la nostra comprensione dei meccanismi di riparazione della membrana tramite screening per geni ospitanti o esogenicamente aggiunto composti che controllo una chiusura della membrana plasmatica.

Introduction

Cellule di mammifero sono soggetti a sollecitazioni meccaniche, osmotico e biochimici, causando la perdita di integrità della membrana del plasma. Senza una chiusura rapida ed efficiente, le cellule danneggiate sarebbero rapidamente soccombere alla morte programmata o necrotica. Dal 1960, sforzi per comprendere la membrana di plasma una chiusura processo sono stati motivati dalle conseguenze devastanti connesse con sue disfunzioni. Infatti, malattie come la distrofia muscolare dei cingoli, il diabete e la sindrome di Chediak-Higashi sono state collegate alla riparazione della membrana di plasma carente a causa di mutazioni nel gene codifica disferlina, produzione di prodotti finiti avanzati di glycation e difetti di il regolatore di traffico lisosomiale CHS1, rispettivamente1,2,3,4,5,6. Tuttavia, ad oggi, la nostra comprensione della membrana una chiusura è ancora limitata7. Gli studi iniziali hanno dimostrato che la chiusura della membrana viene avviata dall'afflusso di extracellulare Ca2 + attraverso la membrana plasmatica danneggiata8,9,10. Da allora, parecchi non escludono Ca2 +-dipendente meccanismi sono stati proposti per sigillare le cellule. L'ipotesi di patch propone che in vicinanza alla ferita, vescicole intracellulari fusibile con l'altro e la membrana plasmatica danneggiata di agire come un patch11,12,13,14. Un secondo modello propone che l'esocitosi calcio-dipendente dei lisosomi la ferita sito rilascia la sfingomielinasi acida lysosomal degli enzimi, che converte la sfingomielina alla ceramide l'opuscolo esterno della membrana plasmatica. Questo improvviso cambiamento nella composizione lipidica si traduce in ceramide-driven endocitosi del regione danneggiata15,16,17. Infine, il terzo meccanismo proposto prevede un ruolo per il endosomal ordinamento complessi necessari per il trasporto (ESCRT) promuovere la formazione di vescicole di rivolte che bud fuori dalla membrana plasmatica18. Solo un set limitato di proteine è stato identificato in questi modelli, e loro macchinari devono essere ulteriormente chiarito.

Qui descriviamo un saggio di alto-rendimento che misure sulla membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero aderente sottoposto a danni mediati da ricombinante Listeriolisina O (LLO)19. LLO è una tossina che formano dei pori (PFT) secernuta dall'agente patogeno intracellulare facoltativo Listeria monocytogenes20,21,22 ed appartiene al MACPF/CDC (complesso di attacco della membrana, perforina, e Superfamiglia Citolisina colesterolo-dipendente). MACPF sono mammiferi poro-formare proteine coinvolte nelle difese immunitarie, mentre CDCs sono tossine batteriche principalmente prodotte da patogeni Gram-positivi che danneggiano le cellule dell'ospite per promuovere i loro stili di vita patogeni23. CDCs sono sintetizzati come monomeri solubili in acqua o dimeri che si legano al colesterolo presentano nella membrana plasmatica e oligomerizzazione in un complesso prepore di fino a 50 unità secondarie. Il complesso prepore quindi riorganizza per inserire β-fili attraverso il doppio strato lipidico, formando un poro del β-barilotto che si estende su 30-50 nm in diametro24,25,26,27.  Questi grandi pori consentono flussi di ioni e piccole componenti cellulari dentro e fuori la cellula; però, alcuni studi hanno proposto che i pori di dimensioni più piccole sono anche formato28,29,30. Tra il CDCs, LLO Visualizza proprietà uniche, tra cui l'aggregazione irreversibile e temperatura-dipendente dal pH, che è favorevole alla analisi di alto-rendimento31,32. LLO possa essere aggiunti al terreno di coltura cellulare a 4 ˚ c, una temperatura permissiva al suo legame alle cellule, ma non per la formazione del poro complessa. L'inizio della formazione dei pori può essere sincronizzato quindi alzando la temperatura a 37 ° c, consentendo la diffusione efficiente delle molecole di tossina nel piano della membrana per formare oligomeri e per il rimodellamento conformazionali coinvolti nella generazione del poro. Pertanto, seguendo l'interruttore della temperatura, la cinetica di danno delle cellule dipenderà la quantità di tossina associata alla membrana plasmatica. D'importanza, LLO solubile (non legato alla membrana plasmatica) rapidamente e irreversibilmente aggrega al raggiungimento della temperatura di 37 ° c, che riduce la necessità di lavare via molecole di tossina non associato e limita l'entità del danno di membrana nel corso del tempo. Infine, perché LLO lega al colesterolo e forma i pori nelle membrane ricchi di colesterolo, questo test è suscettibile di una vasta gamma di cellule di mammifero. È importante tenere a mente che LLO colpisce la cellula ospite segnalazione principalmente attraverso la formazione dei pori, con poche eccezioni in quale cella di poro-indipendente di segnalazione può verificarsi33,34,35,36 ,37,38,39. Pertanto, non può essere escluso che LLO segnalazione attività possono influenzare il processo di riparazione della membrana.

Questo test valuta direttamente la portata della cella ferendo misurando l'incorporazione di un fluorocromo impermeant cella (ad es., ioduro di propidio) che entra nelle cellule ferite e diventa altamente fluorescente, una volta che si associa con acidi nucleici passivamente . Quindi, il fluorocromo possa essere mantenuto in medium della coltura cellulare in tutto l'esperimento, permettendo analisi in tempo reale della cella ferendo. L'intensità di fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione aumenterà con la concentrazione della tossina e, per una data concentrazione della tossina, aumenterà nel tempo fino a quando non si formano tutti i pori, e le cellule sono completamente riparate o finché non viene raggiunto la saturazione. L'afflusso di extracellulare Ca2 + attraverso i pori della membrana è un evento di conditio sine qua non per una chiusura. Di conseguenza, l'efficienza risigillazione può essere indirettamente evidenziato confrontando cella ferendo in terreno di coltura contenente Ca2 + (riparazione condizione permissiva) al ferimento in Ca2 +-mezzo libero (condizione restrittiva di riparazione). Poiché l'intensità della fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione è direttamente proporzionale alla concentrazione delle cellule in ciascun pozzetto, è importante per le cellule di seme alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti. È anche importante enumerare le cellule in ciascun pozzetto, prima e dopo il test per assicurare che distacco cellulare non si verifica, come mobili, cellule aggregate possono oscurare letture di fluorescenza che possono complicare l'interpretazione dei dati. Per enumerare le cellule, le cellule che esprimono nucleare localizzato istone 2B-GFP (H2B-GFP) sono state utilizzate in questo test. Temperatura controllata, multi-mode, lettori di micropiastre combinano misure di rapide, ad alta velocità (utilizzando un formato di piastra 96 o 384 pozzetti) delle intensità di fluorescenza con formazione immagine di microscopia di cellule viventi a 37 ° C. Quest'ultimo può essere utilizzato per enumerare il numero di cell e osservare l'eventuale formazione di popolazioni distinte delle cellule.

In definitiva, questo test fornisce agli utenti la possibilità di ampliare la loro conoscenza della complessità dei meccanismi di riparazione della membrana di screening per molecole ospitanti o ripristino esogenicamente aggiunto composti che possono controllare la membrana. Il seguente protocollo descrive la procedura sperimentale per misurare l'efficienza risigillazione delle cellule esposte a LLO e valutare gli effetti di un dato farmaco o trattamento cellulare sull'efficienza risigillazione.

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Protocol

1. preparazione

  1. Placcatura di cella
    Nota: Cellule epiteliali cervicali umane, HeLa e HeLa esprimendo istone 2B-GFP (H2B-GFP), sono state utilizzate in questo protocollo, ma questo dosaggio può essere adattato ad altre cellule di mammiferi19.
    1. Staccare le cellule aderenti da una boccetta di coltura cellulare di 75cm2 lavando le cellule con 2 mL di tripsina-EDTA 0,25%. Sostituire la tripsina usata con 2 mL di tripsina-EDTA fresco 0.25%.
    2. Incubare le cellule a 37 ˚ c per 5 minuti fino a quando le cellule sono arrotondati e staccato dal pallone.
    3. Risospendere le cellule in 8 mL di terreno di coltura (DMEM contenente siero bovino fetale inattivati 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina).
    4. Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro e 10 µ l di sospensione cellulare.
    5. Diluire le cellule in coltura ad una concentrazione di 2.5 x 105 cellule/mL.
    6. Versare la sospensione cellulare in un bacino di pipetta sterile e mescolare bene la sospensione utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL.
    7. Utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli, distribuire le cellule HeLa (2,5 x 104 cellule/100 µ l/pozzetto) in triplice copia (o quadruplice copia) in una piastra di coltura del tessuto-trattati polistirolo inferiore piatto 96 pozzetti, chiaro, nero.
      Nota: Una disposizione di placcatura è presentata come un esempio nella Figura 1.
    8. Coltura delle cellule per 24 h in un'incubatrice di coltura cellulare umidificata a 37 ˚ c e 5% di CO2.
  2. Preparazione della soluzione di riserva
    1. Preparare 1 L di uno stock di 10 x di tampone M (utilizzato per preparare M1 e M2) con l'aggiunta di 95g di Hanks equilibrata soluzione salina, 0,476 g di MgCl2 (5 mM) e g 23,83 di HEPES (100 mM) a 900 mL di acqua. Regolare il pH a 7,4 e aumentare il volume di 1 L. filtro sterilizzare.
    2. Preparare 50 mL di un 50 x (1,25 M) stock di glucosio aggiungendo 11,26 g di D-(+)-glucosio per un totale di 50 mL di acqua. Filtro sterilizzare la soluzione.
    3. Preparare 50 mL di un 100 x (120 mM) calcio di calcio con l'aggiunta di 0,666 g di CaCl2 per un totale di 50 mL di acqua. Filtro sterilizzare la soluzione.
    4. Preparare 50 mL di un 10x (50 mM) calcio di glicole etilenico-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', acido etilendiamminotetraacetico (EGTA) aggiungendo 0,951 g di EGTA a 40 mL di acqua. Aumentare il pH a 8 con NaOH per sciogliere l'EGTA, quindi aumentare il volume di 50 mL. Filtro sterilizzare la soluzione.
    5. Per una singola piastra a 96 pozzetti, preparare 50 mL di Medium 1 (M1, contiene Ca2 +), 50 mL di Medium 2 (M2, Ca2 +-libero) e 15 mL di Medium 2 completati con EGTA, conseguenza:
      1. Per M1, aggiungere 5 mL di 10x Buffer M, 0,5 mL di 100 x CaCl2e 1 mL di glucosio di 50 x 43,5 mL di acqua.
      2. Per M2, aggiungere 5 mL di 10 x M di tampone e 1 mL di glucosio 50 x a 44 mL di acqua.
      3. Per M2/EGTA, aggiungere 1,5 mL di 10x Buffer M e 1,5 mL di 10 x EGTA a 12 mL di acqua.
        Nota: Tutte le soluzioni contenenti ioduro di propidio (PI) dovrebbero essere preparate direttamente prima dell'aggiunta alle cellule.
  3. Plate Reader/Imaging citometro impostazioni
    Nota: Utilizzare un lettore multi-mode dotato di due unità di rilevamento: un spettrofluorimetro e un citometro imaging. Limitare l'esposizione di fluorescenza per evitare photobleaching fluorophores.
    1. Pre-riscaldare il lettore di piastra a 37 ° C prima di eseguire il test.
    2. Impostare i parametri per l'analisi cinetica di conseguenza all'interno della modalità di Impostazioni :
      1. Scegli monocromatore, FL (fluorescenza)e cinetica per la configurazione ottica, modi di leggere e leggere tipo, rispettivamente.
      2. In Impostazioni di lunghezza d'onda, è necessario selezionare un passabanda eccitazione e di emissione di nm 9 e 15, rispettivamente. Per i dosaggi con ioduro di propidio (PI), impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione a 535 e 617 nm, rispettivamente.
      3. Tipo di piastra, selezionare 96 pozzetti per il formato di piastra e una configurazione pre-piastra di fissaggio corrispondente ad una piastra di fondo chiaro nero-parete.
      4. Sotto Area lettura, evidenziare i pozzi che verranno analizzati durante la cinetica.
      5. Sotto PMT e ottica, lampeggiano per lettura a 6 e la casella di controllo per lettura dal basso.
      6. Sotto temporizzazione, inserire 00:30:00 nella casella Totale tempo di esecuzione per un'analisi cinetica di 30 min e 00:05:00 per l' intervallo.
        Nota: Per ogni volta che il punto e una lunghezza d'onda, il tempo di lettura di una piastra a 96 pozzetti completa è di 30 s.
      7. Confermare le impostazioni specificate nelle Informazioni delle impostazioni a destra e selezionare OK. Premere Leggi per avviare la cinetica eseguire.
    3. Impostare i parametri di imaging in conseguenza all'interno della modalità di impostazioni:
      1. Scegliere Minimax, Imaginged Endpoint per la configurazione ottica, modi di leggere e leggere tipo, rispettivamente.
      2. In lunghezze d'onda, selezionare luce trasmessae una o entrambe le caselle di fluorescenza corrispondenti alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 456/541 nm (GFP) e 625/713 nm (PI).
      3. Utilizzare le stesse opzioni per il Tipo di piastra e Zona lettura , come definito nei passaggi 1.3.2.3 e 1.3.2.4.
      4. In Ben Area impostazione, selezionare il numero di siti all'interno di un ben essere imaged.
        Nota: 12 siti corrispondono a un'immagine di benissimo.
      5. Sotto le Impostazioni di acquisizione immagine, selezionare i tempi di esposizione per la luce emessa, 541 (GFP) e 713 (PI). Per GFP, immagine l'intero bene con un tempo di esposizione di 20 ms/immagine. Per trasmettere luce (TL) e fluorescenza di PI, acquisire una sola immagine del centro di ciascun pozzetto con tempi di esposizione di 8 e 20 ms, rispettivamente.
      6. Confermare le impostazioni specificate nelle informazioni delle impostazioni a destra e selezionare OK. Il tempo di acquisizione per l'intera superficie dei pozzetti (12 immagini/pozzetto) di una piastra a 96 pozzetti di imaging e per una lunghezza d'onda è ~ 15 min premere Leggi per avviare la formazione immagine.
        Nota: Il tempo di acquisizione di un singolo immagine/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti richiede ~2.5 min/piastra per una lunghezza d'onda. I parametri descritti sopra corrispondono all'equipaggiamento specifico nel nostro laboratorio. Spectrofluorometric misure: un flash allo xeno visualizzazione 1.0 nm incremento eccitazione lunghezze d'onda (250-850 nm) con un regolabile 9 o 15 nm passa-banda, un fotomoltiplicatore tubo rivelatore con un > 6 log gamma dinamica e un'emissione di nm 15 o 25 regolabile passa-banda. Citometro di imaging: una sorgente di luce di illuminazione in grado di luce bianca, 460 nanometro e 625 lunghezze d'onda di eccitazione di nm con un 20 nm passa-banda, filtri di emissione centrati a 541 nm (108 nm passa-banda) e 713 nm (123 nm passa-banda), rispettivamente, e un obiettivo 4x accoppiato ad un 1,25 12-bit charge coupled device fotocamera megapixel.

2. dosaggio

Nota: Al momento del test, le cellule devono essere 70-90% confluenti. Durante le fasi di lavaggio, il mezzo dovrebbe essere rimosso dal e applicato alla parete laterale del pozzo (non direttamente sopra le celle). Mantenere la temperatura di LLO a < 4 ˚ c per impedire la sua aggregazione fino al punto 3.1.5.

  1. Preparare un brodo di 30 µM PI in M1 e uno stock di 30 µM PI in M2 pre-riscaldati a 37 ˚ c.
  2. Lavare delicatamente le cellule in piastra 1 utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli, come segue:
    1. Per condizioni di riparazione-permissive, rimuovere il terreno di coltura e lavare che le cellule due volte con 200 µ l/pozzetto M1 pre-riscaldate a 37 ˚ c. Sostituire il mezzo con 100 µ l/pozzetto di M1 caldo contenente 30 µM PI.
    2. Per ripristinare condizioni restrittive, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule una volta con 200 µ l/pozzetto calda M2 contenente 5 mM EGTA per chelare Ca2 +, seguito da un lavaggio con 200 µ l/pozzetto M2. Sostituire il supporto con 100 µ l/pozzetto calda M2 contenente 30 µM PI.
    3. Dopo il mezzo di crescita è stato lavato e sostituito con terreno contenente ioduro di propidio, saltare direttamente al punto 2.1.3.
  3. Immagine 1 piastra in luce trasmessa, GFP e PI come dettagliato sotto 1.3.3 (pre-cinetico). Questo passaggio richiede 15-20 min.
  4. Durante il periodo di 15 minuti al punto 2.1.3, preparare la piastra 2 utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli come segue:
    1. Mettere una fondo tondo 96 pozzetti in polipropilene micropiastra sul ghiaccio. Configurare la piastra utilizzando un disegno sperimentale corrispondente per piastra 1 (Figura 1).
    2. Per condizioni di riparazione-permissive, aggiungere 100 µ l/pozzetto di M1 ghiacciata contenente 60 µM PI, seguita dall'aggiunta di 100 µ l/pozzetto di M1 ghiacciata contenente 4 x LLO o non per il controllo.
    3. Per le condizioni di riparazione-restrittive, aggiungere 100 µ l/pozzetto di gelida M2 contenente 60 µM PI, seguita dall'aggiunta di 100 µ l/pozzetto di M2 ghiacciata che contiene 4 x LLO o non per il controllo.
  5. Dopo formazione immagine piastra 1 (punto 2.1.3), immediatamente posto sul ghiaccio, con foglio di alluminio per separare la piastra dal contatto diretto con ghiaccio. Consentire la piastra 1 raffreddare per 5 min.
  6. Utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli, trasferire 100 µ l di ciascun pozzetto nella piastra 2 (passo 2.1.4) ai rispettivi pozzetti della piastra 1. Per distribuire correttamente la tossina nei media della piastra 1, inserire le punte sotto il menisco e delicatamente espellere il volume senza introdurre bolle.
    Nota: Non pipettare su e giù, come questo può staccare inavvertitamente le cellule.
  7. Lasciare la piastra per un ulteriore 1 min consentire la tossina di legarsi alle cellule e trasferire immediatamente piastra 1 al lettore di piastra per l'analisi cinetica utilizzando la modalità spettrofluorimetro (punto 1.3.2).
  8. Alla fine del test cinetico, immediatamente immagine piastra 1 (post-cinetico) utilizzando punto 1.3.3.

3. analisi: Cella enumerazione

  1. Determinare il conteggio delle cellule basato sulla fluorescenza nucleare utilizzando il software di enumerazione delle cellule di micropiastre.
    1. All'interno delle impostazioni, selezionare Re-analisie nella sezione categoria all'interno delle Impostazioni di analisi di immagine selezionare Discreto oggetto analisi utilizzando 541 come la lunghezza d'onda per trovare oggetti.
    2. All'interno l'opzione di trovare oggetti, utilizzando il disegnare sulle immagini la ricerca metodo, selezionare Nuclei sotto la scheda Impostazioni e premere applica.
    3. Premere OK e Leggi per avviare la cella algoritmo di conteggio.
  2. In alternativa, se nessun tale strumento è disponibile, è possibile utilizzare un software di analisi di immagine come ImageJ per enumerare le cellule.
    1. In ImageJ, aprire il file di immagine come una pila.
    2. Convertire lo stack a 8-bit scala di grigi immagini facendo clic su immagine nella barra dei menu con il mouse su tipo e selezionare 8 bit.
    3. Sottrarre lo sfondo: Clicca sull' immagine nella barra dei menu, passa il mouse sopra la regolae selezionare Luminosità/contrasto. Regolare il valore minimo per rimuovere il rumore di fondo e selezionare applica.
    4. Soglia per creare immagini binarie: Clicca sull' immagine nella barra dei menu, passare sul regolaree selezionare soglia. Selezionare sfondo scuro, regolare i valori di soglia minima e massima e fare clic su applica.
    5. Nel caso di nuclei sovrapposti, uno strumento di spartiacque utilizzabile ai nuclei di segmento. Fare clic su processo nel menu, con il mouse su binario e selezionare spartiacque.
      Nota: Questo separerà automaticamente i nuclei collegati.
    6. Analizzare le immagini mascherate, applicando criteri specificati dall'utente (dimensioni e circolarità) per perfezionare l'identificazione dei nuclei ed escludere i detriti cellulari.
      1. Fare clic su Analyze nel menu e poi analizzare particelle. Impostare la dimensione desiderata (pixel ^ 2) e circolarità (un valore di 1 è un cerchio perfetto) varia che sono sufficienti per includere/nuclei di cellule singoli.
      2. Nella casella a discesa Visualizza, selezionare le opzioni desiderate, verifica Summarizee fare clic su OK per ottenere i conteggi delle cellule.

4. analisi: Cinetica delle curve

  1. Trasferire i dati cinetici dal software del lettore di piastra un software di dati analitici.
  2. Per ogni condizione sperimentale, media le intensità di fluorescenza dei replicati in ogni timepoint, insieme con la corrispondente deviazione standard e l'errore standard della media per ogni condizione sperimentale.
  3. Per ogni condizione sperimentale, tracciare il corrispondente diagramma cinetico: intensità di PI (asse y) rispetto al tempo (asse x).
  4. Per calcolare l'efficienza risigillazione di una condizione di trattamento determinato, calcolare l'area sotto la curva (AUC) dei + LLO in M1 (AUC(M1)) e + LLO in M2 (AUC(M2)). Utilizzare l'approccio suggerito qui di seguito per valutare l'efficienza (E) menzionerà:
    Equation
  5. Eseguire un confronto fra il trattamento e di controllo determinando il rapporto di efficienza (REff) indicato di seguito:
    Equation 2
    REFF = 1, test trattamento non ha alcun effetto sulla riparazione
    REFF < 1, test trattamento inibisce la riparazione
    REFF > 1, test trattamento migliora la riparazione
  6. Calcolare l'area sotto la curva utilizzando la seguente equazione:
    Equation 3, dove k è il numero totale di follow-up.

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Representative Results

Precisione di conteggio delle cellule: cellule HeLa sono frequentemente utilizzate come una linea di cellule di mammifero modello per esplorare i meccanismi di riparazione della membrana. Nel valutare la riparazione della membrana a livello della popolazione delle cellule, è importante alle cellule della piastra alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti per interpretazione corretta dei dati. È anche importante verificare al momento del dosaggio che numeri di cellulare sono equivalenti attraverso pozzi. Cellule HeLa che esprimono costitutivamente istone 2B fuso a GFP (H2B-GFP) sono stati introdotti in questo dosaggio per enumerare automaticamente le celle in base al rilevamento dei loro nuclei fluorescenti. Per stabilire la precisione nell'enumerazione delle cellule, diluizioni seriali delle cellule HeLa H2B-GFP sono stati placcati in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti e coltivate per 4 h. Questo lasso di tempo è sufficiente per il collegamento delle cellule e fornisce limitato la divisione cellulare. Completo pozzi erano imaged sotto luce trasmessa (TL) e luminarie di fluorescenza di GFP e conteggi delle cellule sono stati valutati basato sulla fluorescenza GFP utilizzando il software di analisi del lettore di piastra (Figura 2A e 2B). I conteggi cella media ± deviazione standard è stata tracciata contro le concentrazioni di semina cellulare e una retta di regressione indicato un rapporto 1.08:1 del conteggio delle cellule alla cella semina, dimostrando la precisione del conteggio (Figura 2). Di tutti i pozzi prima di un'analisi cinetica di imaging, è possibile garantire che i numeri delle cellule sono coerenti tra tutti i pozzetti. Inoltre, da imaging pozzi dopo l'analisi cinetica, uno può stabilire se l'esposizione alla tossina ha causato il distacco cellulare.

Espressione della GFP non interferisce con misure di intensità propidio ioduro (PI) (IPI): per garantire che Associazione nucleare H2B-GFP non interferisca con l'incorporazione di PI o PI fluorescenza intensità misura (IPI), IPI è stato confrontato in cellule HeLa e HeLa H2B-GFP che sono stati esposti, o non, a 1 nM LLO (Figura 3). In assenza di PI, c'era un altrettanto basso livello di fluorescenza di fondo in HeLa e HeLa H2B-GFP, che indica che la GFP non sanguinare attraverso filtri di emissione di fluorescenza PI. In presenza di PI, ma assenza di LLO, c'era una simile emissione di fluorescenza PI basale sia HeLa e HeLa H2B-GFP che non è cambiato nel tempo. Ciò ha confermato che espressione della GFP non pregiudica la misura della fluorescenza di PI e indicato che PI non penetra le cellule non danneggiati per il lasso di tempo dell'esperimento. Aggiunta di LLO ha provocato un aumento nella fluorescenza PI nel tempo che era simile in HeLa H2B-GFP e HeLa. Questo aumento è dovuto cella ferimento di LLO combinato con associazione di PI con acidi nucleici. Insieme, questi risultati stabiliscono che la espressione di istone-2B-GFP non pregiudica PI incorporazione o misura della sua fluorescenza.

Fluorescenza PI non interferisce con il conteggio delle cellule GFP-base: reciprocamente, era importante verificare che l'incorporazione nucleare PI in cellule ferite non interferisca con il conteggio delle cellule GFP-basato. Immagini di fluorescenza rappresentativo di HeLa e HeLa H2B-GFP esposti a 1 nM LLO in presenza di PI ha mostrato che c'era un marcato accumulo di PI in cellule ferite post cinetica, come previsto (Figura 4A). Formazione immagine ha rivelato anche che PI potrebbe sanguinare attraverso rilevazione della fluorescenza GFP (Figura 4A e tabella 1). Questo crossover di fluorescenza è stato apprezzato meglio sulle immagini post-cinetiche delle cellule HeLa che non esprimono GFP, ma ancora visualizzato verde fluorescenti nuclei (Figura 4A). Questo crossover potrebbe anche essere provato tramite la misura dell'intensità di fluorescenza di GFP (IGFP) in cellule HeLa H2B-GFP, che ha significativamente aumentato post-cinetica rispetto al pre-cinetico (Figura 4B). D'importanza, crossover di fluorescenza di PI non influisce conta cellulare perché il processo di segmentazione coinvolto nell'enumerazione dei nuclei è influenzato da un aumento nella fluorescenza GFP (Figura 4).

Misurazione della membrana plasmatica risigillazione efficienza: In questa sezione, presentiamo la metodologia di base utilizzata per misurare l'efficienza della chiusura della membrana. Per evidenziare il processo di chiusura della membrana, le cellule HeLa H2B-GFP sono stati esposti, o non, a 1 nM LLO in presenza (M1) o assenza (M2) di extracellulare Ca2 + (Figura 5). Come previsto, in assenza di LLO, IPI è rimasto costante in M1 e M2. Aggiunta di LLO in Ca2 +-contenente mezzo ha provocato un aumento costante nell'intensità di fluorescenza di PI (IPI), mentre in assenza di extracellulare Ca2 +, c'era un aumento significativamente più ripido in fluorescenza di PI, che riflette il assenza di chiusura della membrana. Per valutare l'efficienza risigillazione, che è definita come la capacità delle cellule di riparare in M1 rispetto al M2 (passo 1.5.4.1), l'area sotto le curve di M1 e M2 (AUC) sono state determinate e l'efficienza di riparazione (E) è stata calcolata pari a 0,287.

Un'alternativa al PI: PI è stato utilizzato ubiquitariamente come indicatore per danno della membrana del plasma. Tuttavia, ci sono altri coloranti di associazione di acido nucleico che sono adatti anche per questo test. Ad esempio, un'associazione di acido nucleico impermeant carbocyanine membrana tingere (CNABD) esposizioni uno spettro di emissione raggiungendo in lontano rosso e ha un'alta specificità per DNA a doppio filamento. PI si lega invece sia DNA che RNA40,41. A differenza di PI, l'eccitazione e spettri di emissione di CNABD non si sovrappongono con quelli di GFP permettendo per migliore risoluzione spettrale tra le due fluorocromi. Inoltre, la CNABD utilizzata nel presente protocollo ha un coefficiente di estinzione quasi due volte quello del PI, il che significa che per loro lunghezze d'onda di eccitazione rispettivi, questa tintura è più in grado di assorbire energia di PI risultante in una più forte emissione di fluorescenza. Analisi di fluorescenza quantitativa delle immagini CNABD e GFP ha mostrato che questa tintura esibisce una gamma dinamica di fluorescenza grande, non emette in modo significativo alle lunghezze d'onda della fluorescenza di GFP e non influisce il conteggio delle cellule (Figura 6A-D). Infatti, le cellule HeLa H2B-GFP incubati in media M1 o M2 che contengono CNABD e danneggiato da 1 nM LLO hanno esibito un 4 e 5.5 volte aumento hoCNABD rispetto ai controlli non danneggiati, rispettivamente (figura 7A). Per confronto, le cellule esposte a 1 nM LLO in presenza di PI hanno esibito un aumento di 2,5 - 3 volte in intensità di fluorescenza di PI in M1 e M2, rispettivamente (Figura 5). Come PI, CNABD Mostre aumentando l'intensità di fluorescenza con l'aumento della concentrazione di LLO in M1 (figura 7A), e l'efficienza di riparazione risultante è stato calcolato come descritto nel passaggio 1.5.4.1 (figura 7B). Segnaliamo che la cella risigillazione efficienza diminuisce come LLO concentrazione aumenta. Questo fenomeno riflette il fatto che cellule diminuiscono la loro capacità di sigillare quando sono causati danni eccessivi.

Valutazione della qualità del test di riparazione della membrana: un aspetto critico di qualsiasi test è la sua robustezza o la capacità di rilevare e risolvere le differenze tra i controlli positivi e negativi. Variazione del segnale tra i controlli positivi e negativi dovrà visualizzare riproducibilità e gamma dinamica sufficiente. In questa analisi di riparazione della membrana, i controlli positivi e negativi sono le cellule esposte a LLO in riparazione-permissiva (M1) e condizioni di riparazione-restrittive (M2), rispettivamente. Due approcci sono state prese per valutare la validità di questo test per l'analisi di alto-rendimento. In primo luogo, il fattore Z, o coefficiente di finestra, di screening determina se un determinato insieme di condizioni fornisce un grande abbastanza gamma dinamica, rappresentail variabilità del segnale. Z-fattori all'interno delle gamme 0 < Z ≤ 0,5 e 0,5 < Z ≤ 1 corrispondono a un test accettabile e molto buono, rispettivamente42,43. Una limitazione dell'utilizzo il Z-fattore per la valutazione della qualità è che condizioni testate presentano in genere valori più moderati rispetto ai controlli positivi e negativi estremi. Di conseguenza, un secondo approccio, abbiamo calcolato la differenza media rigorosamente standardizzata (SSMD, β), che può identificare le differenze tra le condizioni sperimentali che altrimenti sarebbero essere classificate come un risultato negativo basato su un qualificato Z-factor44 ,45. I valori SSMD possono essere classificati in forza di effetto che vanno da alcun effetto (β = 0) al fortissimo (β ≥ 5). Utilizzando i dati da figura 7A e AUC per confronto di M1 contro condizioni M2, l'esposizione a 0,25 e 0,5 nM LLO prodotto valori di Z-fattore di 0.3100813 e 0.137313 e β = 6.0672 e 4.803308, rispettivamente, che indica che una finestra di concentrazioni LLO è adatto per il dosaggio. Come la concentrazione di LLO è aumentata oltre 1 nM, il divario neiCNABD Curve cinetiche tra condizioni M1 e M2 chiude conseguente drasticamente ridotti valori di Z-factor e SSMD (figura 7B). Tali alte concentrazioni di LLO corrispondono alle condizioni in cui il potenziale di riparazione è compensato dai danni e così nega l'uso del dosaggio nell'identificazione di fattori coinvolti nella riparazione della membrana. Questo è ulteriormente illustrato tramite la diminuzione dell'efficienza di riparazione (E) come aumenti di concentrazione LLO (figura 7B). Tutti i dati (Z-factor, SSMD ed E) sono stati generati con 3 ripetizioni biologici e 3 tecnici replica a condizione sperimentale per la validazione di test. Insieme, questi dati mostrano che questo test ha la robustezza prevista per un'analisi di alto-rendimento con concentrazioni di LLO inferiori a 1 nM per cellule HeLa.

Prova di principio: una volta che la robustezza del dosaggio è stata fondata, abbiamo eseguito gli esperimenti supplementari come prova di principio che questo test ha la sensibilità e la risoluzione per identificare un difetto nel processo di riparazione. Inoltre, abbiamo considerato che dosaggi ad alta velocità vengono utilizzati come un processo di screening per identificare "hits" all'interno di schermi di grandi dimensioni, che possono riguardare meno di 3 biologici replica. Così, è che il disegno sperimentale fornisce la potenza di rilevazione per identificare "hits" all'interno di una sola analisi pertinente. Pertanto, in uno schermo ad alta velocità, il layout di dosaggio possa essere regolato per ospitare 4 repliche tecniche per aumentare la potenza statistica in un singolo esperimento. Le cellule erano placcate in quadruplice copia e sono stati pre-trattati 1 h prima del dosaggio con desipramina, un inibitore farmacologico della sfingomielinasi acida proteina lisosomiale (ASM) che svolge un ruolo nella membrana plasmatica riparazione15,17 ,46. D'importanza, il trattamento con desipramina non ha colpito i conteggi delle cellule durante tutto il test, consentendo un confronto appropriato tra cellule desipramina-trattati e non trattati (Figura 8A). Inibizione di ASM in cellule trattate con desipramina è provocato da un difetto nella membrana risigillazione efficienza sull'esposizione a LLO, come illustrato dalla diminuzione E e RFEP (Figura 8B e 8C). Utilizzando un modello ad effetti misti, un confronto di desipramina-trattati alle cellule non trattate esposte a 0,25 e 0,5 nM LLO in M1 ha mostrato valori di p di 0,0010 e 1 x 10-10, rispettivamente. Insieme, i dati indicano che 0,25 e 0,5 nM LLO sono concentrazioni adeguate per identificare difetti di riparazione in un quadro sperimentale ad alta velocità, con possibili analisi statistiche di un singolo esperimento una volta il tecnico replica è aumentato a quattro . Si noti che l'approccio statistico del modello misto effetti tra quattro esemplari non verrà conto per variazioni potenziali attraverso più replicati biologici. Eventuali risultati significativi utilizzando uno replica biologico deve essere verificato in impostazioni aggiuntive sperimentale.

Figure 1
Figura 1: disegno sperimentale. Il diagramma di flusso descrive un piatto rappresentativo design configurato per testare l'effetto di sette condizioni di test rispetto alle cellule non trattate di controllo. Ulteriori controlli dovrebbero essere inclusi, se del caso, come per i veicoli di droga di esempio. Le cellule sono placcate (tavola 1) 24 h prima dell'esperimento. Il giorno dell'esperimento, le cellule in piastra 1 vengono lavate con M1 o M2 medium preriscaldato a 37 ° C, e il piatto è imaged (TL, GFP e PI fluorescenza) pre-cinetico. Durante i 15 min di imaging, i reagenti vengono aggiunti sul ghiaccio alla piastra 2. Dopo formazione immagine, piastra 1 viene messo immediatamente in ghiaccio per 5 min e 100 μL/pozzetto vengono trasferite dalla piastra 2 a piastra 1. Piastra 1 viene inserito nel lettore della piastra per eseguire il test cinetico a 37 ° C per 30 min, seguita da imaging (TL, GFP e PI fluorescenza). I dati vengono poi analizzati per contare le celle e valutare l'efficienza di riparazione in tutte le condizioni sperimentali. In grandi insiemi di dati, le analisi possono essere automatizzati. Inoltre, il numero delle ripetizioni tecnici può essere aumentato a 4 nelle schermate di alto-rendimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: cella contando precisione. Cellule HeLa che esprimono GFP-etichettato istone 2B sono state seminate in triplici copie alle concentrazioni indicate. (A) cellule erano imaged a 37 ° C sotto luce trasmessa (TL) e fluorescenza GFP (12 immagini/pozzetto) e un algoritmo di rilevamento delle cellule è stato utilizzato per delineare diversi nuclei (in viola). Barra della scala = 1 mm. (B) più alto ingrandimento di TL, GFP e cella rilevamento (viola) immagini (con zoom 2x). Scala bar = 100 μm. Immagine (C) software di analisi è stato utilizzato per contare il numero di celle e la cella conteggi sono stati tracciati contro l'iniziale delle cellule semina concentrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: propidio ioduro fluorescenza misura non è influenzata dall'espressione 2B-GFP istone. Esprimendo la 2B-GFP istone e non-esprimendo le cellule HeLa sono stati esposti, o non, a 1 nM LLO in presenza (linee continue) o assenza (linee tratteggiate) di 30 μM PI in Ca2 +-contenente mezzo (M1). L'analisi cinetica misurata di intensità di fluorescenza di PI di spettrofluorometria ogni 5 min per 30 min a 37 ° C. I dati sono la media intensità di fluorescenza PI (IPI) espressa in fluorescenza relativa unità (RFU) ± SEM (n = 3 esperimenti indipendenti, ognuno eseguiti in triplici copie). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: enumerazione delle cellule è influenzato dalla fluorescenza PI. (A) pre- e post-cinetiche immagini rappresentative (TL, PI e GFP) delle cellule esposte, o non, a 1 nM LLO in M1. Scala bar = 100 μm. (B) analisi di microscopia di fluorescenza quantitativa (hoGFP± SEM) ha rivelato la misura di fluorescenza GFP aumentata dovuto il incorporazione nucleare PI su cella ferimento di LLO (post-cinetico). Enumerazione delle cellule GFP-base (C) era inalterata tramite l'aumento in intensità GFP. Conteggio delle cellule per pozzetto è stata espressa come media ± SEM. (In B e c: barre nere = dati pre-cinetici; barre rosse = dati post-cinetici; n = 3 esperimenti indipendenti, ognuna rappresentata in triplici copie; t-test di un Student a due code è stato utilizzato per analizzare la fluorescenza quantitativa conteggi di intensità e delle cellule da immagini acquisite, * * p < 0.01). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: misurazione della membrana plasmatica risigillazione efficienza. Cellule HeLa esprimenti di istone 2B-GFP sono stati esposti, o non, a 1 nM LLO in Ca2 +-contenenti (M1) o Ca2 +-mezzo libero (M2) contenente 30 μM PI. Dati cinetici rappresentano l'intensità di fluorescenza PI (IPI) in fluorescenza relativa unità (RFU) ± SEM, misurata per 30 min a 37 ° C. n = 3 esperimenti indipendenti, ognuno eseguiti in triplici copie. La risigillazione efficienza è stata misurata come indicato nel protocollo passaggio 1.5.4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: associazione tintura come un colorante alternativo per valutare la chiusura della membrana dell'acido nucleico Carbocyanine. Cellule HeLa H2B-GFP sono stati esposti, o non, a 0,5 nM LLO per 30 min a 37 ° C in presenza di 1 μM CNABD in Ca2 +-contenenti (M1) o Ca2 +-mezzo libero (M2). (A) cellule di immagini di HeLa H2B-GFP sono stati acquisiti pre- e post-cinetici in M1 contenente il colorante. Scala bar = 100 μm. Intensità di fluorescenza CNABD integrato e GFP (B e C) sono stati misurati utilizzando il citometro imaging ed espresso in unità di fluorescenza relativa (RFU) ± SEM. immagini di fluorescenza di GFP (D) sono stati elaborati per enumerare HeLa H2B-GFP cellule (barre nere = barre dei dati pre-cinetico, rosso = dati post-cinetici, n = 3 esperimenti indipendenti, ognuno eseguiti in triplici copie). T-test di un Student a due code è stato utilizzato per analizzare l'intensità di fluorescenza quantitativa e conteggi delle cellule da immagini acquisite, * * p < 0.01, * * * p < 0,001) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: effetto di concentrazione LLO sulla chiusura della efficienza, Z-factor e SSMD. (A) HeLa H2B-GFP cellule incubate in M1 o M2 contenente 1 μM CNABD sono stati esposti alle concentrazioni aumentanti di LLO e sottoposti a test cinetico per 30 min a 37 ° C. I dati sono espressi come intensità CNABD (ICNABD) in fluorescenza relativa unità (RFU) ± SEM. (B) il fattore Z e differenza media rigorosamente standardizzata (SSMD) sono stati calcolati come una valutazione di qualità per la robustezza della riparazione della membrana analisi, usando l'area sotto la curva (AUC) come una metrica per il Curve cinetiche42,43,44,45. Le efficienze risigillazione sono state calcolate come descritto nella sezione protocollo e risultati (n = 3 esperimenti indipendenti, ognuno eseguiti in triplici copie). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: l'esposizione delle cellule a desipramina provoca difetti in una nuova chiusura. Cellule HeLa H2B-GFP (placcate in quadruplice copia) sono state pretrattate con desipramina di 30 μM (o non) per 1 h a 37 ° C e quindi esposti a 0,25 o 0,5 nM LLO in presenza di 1 μM CNABD in Ca2 +-contenenti (M1) o Ca2 +-mezzo libero (M2). Le cellule erano imaged (pre- e post-cinetico) e sottoposti a test cinetico a 37 ° C per 30 min (A) le cellule sono state enumerate; i dati sono espressi come media delle celle conteggi ± SEM. (B) CNABD intensità di fluorescenza (ICNABD) è espresso nella relativa fluorescenza efficienze di unità (RFU) ± Resealing SEM. (C) sono state calcolate in presenza e in assenza di desipramina. Su valori di intensità di registro-trasformate assumendo un'intercettazione casuale per ogni tecnica di replica è stato utilizzato un modello di effetti misti. Per catturare entrambi uno spostamento e modificare in forma delle curve cinetiche, l'effetto principale di condizione di trattamento e l'effetto di interazione tra condizione di trattamento e ora sono stati testati congiuntamente per significatività statistica. T-test di un Student a due code è stato utilizzato per analizzare i conteggi delle cellule da immagini acquisite. Il p-value è stato calcolato tramite il modello a effetti misti. (4 tecnici replica, un esperimento). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Specifiche tecniche di imaging citometro emissione Channel
Fluoroforo Fluoroforo ex / em (nm) Canale verde (ex / em ± bandpass, nm) Canale rosso (ex / em ± bandpass, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabella 1: GFP, PI e CNABD picchi di eccitazione e di emissione e il verde e il rosso canale analisi di eccitazione e di emissione per il cytometer di imaging.

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Discussion

Questo test misura l'efficienza della membrana una chiusura a livello della popolazione di cellule con capacità di alto-rendimento. Può essere utilizzato per schermare per componenti cellulari o librerie di farmaco che potrebbero influire sulla riparazione della membrana. Il saggio descritto utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, ma può essere adattato a piastre da 384 pozzetti per un throughput più elevato. Un vantaggio di questo test è la sua capacità di ottenere misure di fluorescenza delle cellule viventi aderente in tempo reale senza la necessità di cellulare eccessiva elaborazione come distacco cellulare, fissazione o fluorescenza post-fissazione di etichettatura. I lettori di micropiastre multimodale, come quello utilizzato nel presente protocollo, hanno sufficiente sensibilità per spectrofluorometric rapide misurazioni a intervalli di tempo più bassi 30 s su una piastra a 96 pozzetti. L'acquisizione di immagini di fluorescenza fornisce informazioni aggiuntive tra cui enumerazione delle cellule, eventuali cambiamenti nella morfologia delle cellule e potenziale identificazione di popolazioni distinte delle cellule. Il presente saggio non stabilisce la cinetica di chiusura a livello di singola cellula della membrana plasmatica, ma identifica condizioni sperimentali (composti farmacologici o componenti cellulari) che possono influenzare, positivamente o negativamente, il processo di membrana una chiusura a livello della popolazione delle cellule.

Diversi altri approcci sperimentali sono stati sviluppati per valutare la risigillazione meccanismi di membrana. Ad esempio, rottura meccanica di microaghi puntura, perlina abrasione e ablazione laser sono stati utilizzati per modellare danno meccanico della membrana. La misurazione di ferimento/riparazione ha coinvolto la citometria a flusso o microscopia di fluorescenza di quantificare la voce di sonde fluorescenti (FM 1-43, ioduro di propidio, coniugato con fluoresceina destrani) o proteina fluorescente chimere47 di rilevamento ,48,49,50. Ciascuno di questi approcci ha i suoi vantaggi; Tuttavia, non sono suscettibili di high throughput screening in cellule viventi come presentato in questo test.

Il presente saggio è stato ottimizzato per analizzare l'efficienza risigillazione delle cellule ferito dalla proteina pore-forming LLO, quali forme grandi pori che consentono il massiccio afflusso di Ca2 + come provocata da rotture meccaniche della membrana plasmatica. Anche se poro-formare tossine rappresentano una forma di danno della membrana del plasma, riparazione di tossina grandi pori e ferite meccaniche sono state proposte per condividere comuni Ca2 +-vie dipendenti17,51. È importante notare che l'interazione con componenti della membrana cellulare LLO come colesterolo può influenzare la segnalazione delle cellule e quindi può influenzare membrana risigillazione meccanismi rispetto alle ferite meccaniche. Nostra conoscenza relative alla riparazione della membrana è ancora limitata e ulteriori studi sono richiesti per stabilire se una chiusura delle ferite meccaniche differiscono da una chiusura in seguito alla formazione di pori di tossina. Esistono numerosi vantaggi dell'utilizzo di LLO. In primo luogo, l'avvio di danno della membrana può essere sincronizzato alzando la temperatura da 4 a 37 ° C. In secondo luogo, la forma solubile di LLO (non legato alla membrana cellulare) aggrega irreversibilmente a pH neutro e 37 ° C, così limitando gli effetti citotossici e che abroga la necessità di lavare le cellule. Infine, il grado di danno può essere regolato variando la concentrazione della tossina. Tuttavia, una limitazione di questo test è l'interruttore della temperatura tra 4 e 37 ° C, che possono influenzare il meccanismo di riparazione come trasporto vescicolare, endocitosi e la fluidità della membrana, tra altri processi, che sono influenzati dalla temperatura52, 53,54. È importante verificare che qualsiasi inibitore farmacologico incluso nell'analisi non interferisce con la formazione di pori LLO eseguendo un'analisi di emolisi in presenza (contro assenza) della droga55. A causa di differenze di potenziale batch nell'attività LLO, è importante preparare un brodo di LLO che è abbastanza grande per un intero schermo di alto-rendimento55.

Abbiamo incluso l'uso di cellule che esprimono la chimera di istone-2B-GFP nucleare localizzato come un mezzo per enumerare le cellule prima e dopo l'analisi di riparazione della membrana tramite immagini al microscopio, seguita da analisi di immagine automatizzata. Importante, i conteggi delle cellule equivalenti attraverso condizioni e immutabile delle cellule conta prima e dopo l'analisi cinetica sono cruciali come PI o intensità di fluorescenza di CNABD non può facilmente essere normalizzata. Infatti, una differenza nel conteggio delle cellule si tradurrà in differenze nel grado di danno di una data concentrazione di LLO, che non può essere corretto per tramite normalizzazione di fluorescenza a causa delle variazioni in una chiusura di efficienza (Figura 7). Abbiamo mostrato che espressione istone-2B-GFP non interferisca con emissione di incorporazione o fluorescenza PI o CNABD. Al contrario, incorporazione di PI o CNABD non influisce enumerazione delle cellule GFP-basato. Se altre combinazioni di fluorofori devono essere utilizzati, sarebbe necessario valutare la potenziale sovrapposizione spettrale tra fluorocromi, come è stato effettuato in questo lavoro. Anche se il PI è stato ampiamente utilizzato per misurare il danno della membrana, indichiamo che CNABD è un ottimo sostituto che presenta il più alto rendimento quantico di fluorescenza, risultante in una gamma dinamica più grande adatta per caratterizzare una chiusura di efficienza.

Z-factor e SSMD ha confermato che questo test ha la robustezza necessaria per eseguire analisi di alto-rendimento. Il calcolo dell'efficienza risigillazione è uno strumento critico ed affidabile per identificare potenziali hit. Inoltre, il modello misto effetti utilizzabile come uno strumento statistico per valutare i colpi all'interno di una sola analisi. Il piano sperimentale deve comprendere un minimo di tre replicati tecnici se lo schermo può essere ripetuto più volte. Quadruplicato dovrebbe essere usato se strumenti statistici, ad esempio il modello misto effetti, devono essere inclusi in un singolo esperimento, se non sarà ripetuta. Si consiglia tuttavia di eseguire sullo schermo più volte e per convalidare i risultati eseguendo esperimenti complementari.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Riconosciamo il dottor Jesse Kwiek (The Ohio State University) per averci gentilmente di utilizzare la sua piattaforma di rilevamento multi-modalità per alcuni esperimenti preliminari. Ricerca riportata in questo articolo è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, in numero di premio RO1AI107250 da Stephanie Seveau. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

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Immunologia e infezione numero 143 membrana plasmatica una chiusura riparazione della membrana distrofia muscolare ioduro di propidio acido nucleico carbocyanine associazione tintura pore-forming tossina Listeriolisina O
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Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

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