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Bioengineering

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/58478
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

Summary

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

Abstract

Se describe un flujo de trabajo para el análisis de la expresión génica de las células endoteliales sometidos a un constante flujo laminar utilizando múltiples cámaras monitoreadas flujo de placas paralelas. Las células endoteliales forman el revestimiento celular interno de los vasos sanguíneos y están crónicamente expuestas a la fuerza de fricción del flujo de sangre llamado tensión de esquileo. En condiciones fisiológicas, la función de las células endoteliales en presencia de varias condiciones de esfuerzo cortante. Por lo tanto, la aplicación de las condiciones de tensión de esquileo en vitro modelos permiten comprender mejor una mayor respuesta endotelial in vivo. La cámara de placas paralelas flujo previamente publicada por Lane et al. 9 se adapta para estudiar la regulación de los genes endoteliales en presencia y ausencia de flujo laminar (no pulsátil) constante. Adaptaciones claves en la configuración para flujo laminar como se presenta aquí incluyen un entorno grande, dedicado a los circuitos de flujo concurrente de la casa, el control de caudales en tiempo real y la inclusión de una referencia exógena RNA para la normalización de datos cuantitativos de PCR en tiempo real. Para evaluar varias condiciones de tratamientos con la aplicación de la tensión de esquileo, múltiples circuitos de flujo y bombas se utilizan simultáneamente en la misma incubadora calentada y humidificada. El caudal de cada circuito de flujo se mide continuamente en tiempo real a estandarizar las condiciones de esfuerzo cortante a lo largo de los experimentos. Debido a estos experimentos tienen condiciones múltiples, también utilizamos un RNA de referencia exógena que se enriquecieron en el momento de la extracción de RNA para la normalización de la extracción de RNA y la eficiencia de síntesis de primera-strand cDNA. Estos pasos minimizan la variabilidad entre las muestras. Esta estrategia se emplea en nuestros proyectos para el análisis de expresión génica con tensión de esquileo experimentos usando la cámara de flujo paralelo de la placa, pero partes de esta estrategia, como la exógena de referencia punto de RNA, pueden fácilmente y rentable utilizadas para otras aplicaciones.

Introduction

Las células endoteliales vasculares forman la guarnición celular interna de los vasos sanguíneos en el sistema cardiovascular cerrado de especies mayores. Forman la interfaz entre la sangre y los tejidos y se caracterizan por luminal y abluminal superficies. El endotelio es un sistema diverso, activo y adaptativo que regula el flujo de sangre, trata de nutrientes, inmunidad y el crecimiento de los vasos de sangre nueva1. En el cuerpo, las células endoteliales existen normalmente en un entorno donde están expuestos a la fuerza friccional de la circulación, tensión de cizalla2. Tensión de esquileo es un importante regulador de la célula endotelial gene expression3y células endoteliales intentan mantener la tensión de esquileo dentro de un rango dado2,4. Las células endoteliales muestran angiogénicos patrones en ausencia de tensión de esquileo5 que puede mejorar la perfusión del tejido. Patrones regionales del flujo disturbado y tensión de esquileo alterado se asocia a la expresión de genes inflamatorios6 y el desarrollo de ateroesclerosis7,8. Así, modelos que incluyen la tensión de esquileo son un componente importante de la comprensión de la regulación de los genes endoteliales.

Se describe un método para el estudio de la regulación génica en las células endoteliales vasculares bajo tensión de esquileo. Este sistema utiliza flujo no pulsátil e imita los niveles de tensión de esquileo líquido y concentración de oxígeno condiciones de modelo para las células endoteliales arteriales. Este protocolo incluye los detalles de los métodos para la caída de genes mediante ARN de interferencia (ARNi), la configuración de la aplicación del esfuerzo cortante con el aparato de flujo de placas paralelas y métodos para la espiga de una referencia exógena RNA antes del análisis por reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa cuantitativa (RT-qPCR). Esta tubería se utiliza para estudiar la regulación de los genes en las células endoteliales en presencia y en ausencia de tensión de esquileo laminar e incluye una adaptación de los aparatos de placas paralelas flujo descritos por Lane et al. 9. esta configuración particular fue diseñado para facilitar la evaluación simultánea de varias condiciones experimentales que permite la comparación directa de las condiciones de esfuerzo cortante, así como la normalización de análisis de ARN. Una gran unidad con humedad controlada se utiliza para permitir que múltiples cámaras de flujo separado y bombas que se ejecutan simultáneamente con tasas de flujo para cada montaje de la cámara de flujo en tiempo real. La aplicación de esta disposición se utiliza para la precipitación del gene mediante RNAi en el ajuste de la tensión de esquileo del flujo laminar /, pero los aspectos de este protocolo se pueden aplicar a cualquier evaluación de la expresión de RNA.

Métodos comunes para la aplicación de la tensión de esquileo para células endoteliales incluyen sistemas de microfluidos10, un viscosímetro de cono y placa11y una cámara de placas paralelas flujo12. Sistemas microfluídicos de diversos fabricantes han sido útiles en el estudio de la mecanobiología y mecanotransducción en múltiples células y tipos de tejidos y una variedad de estímulos biofísicos. Para las células endoteliales, se han utilizado para el estudio de las células endoteliales en aislamiento, así como la interacción de las células endoteliales y el tráfico de células de inmune o tumor10. Sin embargo, estos sistemas son menos convenientes para la recuperación de grandes cantidades de células9. El Viscosímetro de cono y plato y cámaras de placas paralelas de flujo permiten la recuperación de un gran número de células en monocapas confluentes12. Estos sistemas pueden generar una variedad de esquileo las fuerzas y patrones de12. Las placas paralelas flujo cámara Asamblea9 tiene la ventaja de que imagen en tiempo real puede realizarse a través de la ventana de cristal para evaluar la morfología celular en cualquier momento. Además, se puede recoger la solución en condiciones estériles. Para el sistema presentado aquí, el flujo también puede ser monitoreado en tiempo real y en un montaje multicámara, que facilita el mantenimiento de condiciones de cizalla entre las cámaras.

Experimentos representativos, se utilizan células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que representan un tipo de célula endotelial macrovasculares, y las condiciones de esfuerzo cortante que utilizamos (1 Pa) reflejan las condiciones arteriales (0.1 - 0.7 Pa). Sin embargo, este protocolo se puede utilizar con otros tipos de células endoteliales, y las condiciones de tensión de esquileo se pueden ajustar según la pregunta experimental. Por ejemplo, la evaluación de células endoteliales humanas en condiciones de circulación venosa del modelo requiere bajos niveles de tensión de esquileo (1-6 Pa) y estudios que modelan la circulación microvascular han utilizado niveles de tensión de esquileo de 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Además, la tensión de esquileo puede variar incluso entre las células endoteliales en el mismo vaso sanguíneo6. En la configuración actual, se utiliza un único sistema de vigilancia que puede monitorear simultáneamente cuatro bucles de flujo separado. Para los laboratorios que necesitan más lazos de flujo, hay espacio en el ambiente dedicado para un sistema de monitoreo adicional.

RT-qPCR se utiliza para la cuantificación absoluta de la expresión génica en el ajuste de tensión de esquileo. La expresión relativa de genes de la blanco a menudo se utiliza para comparar la expresión de RNA en condiciones. Algunas especies de RNA pueden existir en cantidades muy bajas o estar ausente, complicando así mediciones relativas. Por ejemplo, larga noncoding RNAs en las células endoteliales pueden ejercer un efecto potente en números relativamente bajos copia por célula5. Además, las diferencias en la eficiencia de la cartilla pueden conducir a una interpretación inexacta de utilizando el método de delta-delta ciclo umbral (Ct) para analizar los datos. Para abordar esta preocupación, realizamos la cuantificación absoluta mediante la generación de una curva estándar utilizando una cantidad conocida de ADN plásmido. Además, síntesis complementaria de DNA (cDNA) es un proceso ineficiente, y diferencias en la eficiencia de cDNA pueden explicar las diferencias en la expresión de RNA entre condiciones y entre las muestras15. La aplicación de la tensión de esquileo o reactivos de transfección puede afectar viabilidad, apoptosis y proliferación celular, o agregar componentes que puedan interferir con la síntesis de ARN aislamiento o cDNA. Para tener en cuenta la posibilidad de sesgo de aislamiento de RNA y síntesis de cDNA, utilizamos un spike en control de RNA sintetizado en el laboratorio, añadido en el momento de la extracción de RNA y medidos con cada cDNA síntesis mediante RT-qPCR. Esto permite no sólo el ajuste técnico las diferencias en la extracción y cDNA síntesis de RNA pero también permite el cálculo de cantidades absolutas por la célula, cuando se conoce el conteo de células.

Este sistema utiliza medidas adicionales para mantener la similitud o cuenta las diferencias técnicas entre las condiciones. Particularmente enfatizamos estos pasos debido a la naturaleza compleja de estos experimentos, que implican múltiples configuraciones físicas y condiciones experimentales que pueden conducir a la variabilidad experimental.

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Protocol

1. preparación de referencia exógeno RNA

Nota: Elija una referencia exógena RNA que no existe en la especie o modelo de interés. Para sistemas mamíferos, puede utilizarse la luciferasa de luciérnaga RNA.

  1. Linealización de plásmido de referencia exógeno RNA
    1. Preparación de referencia exógeno RNA al menos 48 h antes de la extracción de RNA anticipada. Obtener o fabricar un clon de cDNA de la referencia solicitada, exógeno RNA, como un clon de cDNA de luciferasa de luciérnaga en un vector plásmido apropiado para transcripción en vitro (véase Tabla de materiales).
    2. Realizar la digestión de la enzima de restricción (RE) de 1 μg de plásmido de larga duración (el plásmido de la luciferasa de luciérnaga es pSP-luc + que tiene 4100 bp) usando solo cortador RE (XhoI) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Elegir un RE que es un solo cortador (corta el plásmido sólo 1 x) en el extremo 3' de la referencia exógena secuencia de ARN que deja un excedente de 5' o extremo romo. Para una preparación típica, realizar siete reacciones de linearización de plásmido (pasos 1.1.4 - 1.1.7) en paralelo para generar suficiente concentración de RNA y la cantidad para completar un conjunto de experimentos o un proyecto.
      1. Medir la concentración de plásmido mediante espectrofotometría o spectrofluorometry.
      2. Preparar una mezcla RE en cada tubo: Añadir 4 μL de XhoI (20.000 unidades/mL), 8 μl de RE buffer, x µL de plásmido (1 μg) y suficiente de H2O para llegar a una solución total de 80 μl.
      3. Incubar la mezcla RE por 2 h a 37 ° C. Utilice RE según protocolo del fabricante, ya que cualquier modificación puede resultar en aumento de la actividad estrella o escote inespecífica del ADN diana. Inactive por calor la mezcla de reacción por 20 min a 65 ° C.
      4. Terminar el Resumen RE con la precipitación del etanol en cada tubo. A la mezcla RE, directamente añadir 4 μL de 0,5 M EDTA pH 8.0, 8 μl de 3 M sodio acetato pH 5.2 y 184 μl de etanol al 100%. Mezclar bien y la congelación de la mezcla a-20 ° C por 30 minutos.
      5. Desactivación de la mezcla a 4 ° C por 20 min a una fuerza centrífuga relativa (RCF) de 16.100 x g.
      6. Quite el sobrenadante con una punta fina, sin tocar el sedimento. Secar el pellet por 5 min y resuspender en 6 μl de H2O (calentado a 37 ° C) mediante pipeteo arriba y abajo 5 x - 10 x.
      7. Confirmar la linearización del plásmido luciferase ejecutando el producto digerido en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio (EtBr) junto con una 1 kb + escalera, una escalera superenrollado y corte y plásmido sin cortar. Inspeccione el gel y proceda a la transcripción en vitro si el carril para el plásmido corte muestra una sola banda a ~ 4 kb (el plásmido sin cortar tendrá tres bandas; Figura 1).
        PRECAUCIÓN: EtBr es carcinogénico. Trabajar en una campana de humos químicos.
  2. En transcripción de vitro de plásmido de referencia exógeno RNA
    1. Para cada tubo de los productos de los plásmidos digeridos, realizar la transcripción in vitro utilizando un método de transcripción en vitro (véase Tabla de materiales). Siga las instrucciones del fabricante y utilizar el phage apropiado polimerasa del RNA. Si el método de síntesis de cDNA requiere una cola de poly(A), u otras aplicaciones requieren una cola poly(A), elija un método de transcripción en vitro que incluye una adición de la cola de poly(A) (véase Tabla de materiales).
    2. Combinar todo en vitro transcribe los productos en un solo tubo de polipropileno de 1,5 mL antes de la purificación.
  3. Purif y del ARN de la reacción de transcripción en vitro
    1. Purificar en vitro transcritos productos con una en vitro transcripción limpiar kit (véase Tabla de materiales). Por favor, siga el protocolo del fabricante.
    2. Evaluar la concentración de RNA mediante la medición de absorbancia a 260 nm espectrofotómetro.
      Nota: La concentración de RNA se calcula usando la ley de Beer-Lambert. Esto indica que la absorción de los ácidos nucleicos (que absorben la luz fuertemente en 260 nanómetro) es proporcional a la concentración. Una absorbancia de 1.0 es igual a 40 μg/mL de ARN monocatenario.
  4. Tomar el caldo RNA en PCR tubos para uso experimental
    1. Asegúrese de que la concentración de RNA es 1 μg/μl.
      1. Si la concentración de RNA > 1 μg/μl, diluir el caldo a 1 μg / μl. alícuota 1 μL en PCR los tubos y almacenar a-80 ° C.
      2. Si la concentración de RNA es < 1 μg/μl, precipitación adicional con 5 M de acetato de amonio (proporcionado en el kit) puede realizarse según el protocolo del fabricante. Si la concentración de RNA todavía es < 1 μg/μl, proceder a tomar 1 μL en tubos de PCR.

2. Deslice la capa

Nota: Los pasos 2.1-2.10 debe realiza 24-48 h antes de la siembra anticipada de la célula.

  1. Precalentar el horno a 250 ° C.
  2. Usando guantes estériles, envuelva cada diapositiva de cristal 2 x con papel de aluminio. Evite tocar directamente la superficie de la diapositiva.
  3. Hornear las diapositivas en el horno durante 1 hora a 250 ° C y deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente.
    Nota: Este paso es importante para destruir cualquier contaminante de la endotoxina.
  4. Mientras que las diapositivas son refrigeración, hacer una solución madre de 1 mg/mL con agua destilada a fibronectina e incubar durante 30 min a 37 ° C para disolver. Hacer alícuotas de 100 μl. Apartar las alícuotas para su uso inmediato y congelar las restantes alícuotas para uso futuro.
  5. Desenvuelva la cubierta exterior de papel de aluminio antes de colocar el portaobjetos de cristal en una bioseguridad gabinete. Realizar pasos de 2.6-2.7 y 2.9 en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
  6. Coloque el portaobjetos de cristal en una placa de cultivo celular de 4 pozos rectangulares estéril.
  7. Diluir fibronectina solución 1: 100 con agua destilada. Cubra cada portaobjetos con 1 mL de fibronectina diluido, gota a gota con una pipeta. Asegúrese de que la diapositiva entera está cubierta.
  8. Incubar los portaobjetos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 24-48 h.
  9. Después de la incubación, aspirar la fibronectina inclinando la placa de cultivo celular de 4 pozos. Evite tocar el carro directamente con el aspirador.

3. célula de siembra sobre el vidrio se desliza

  1. Contar las células endoteliales humanas en temprano paso (paso 2-5) y semilla de ~1.0 x 106 células cada portaobjetos de vidrio recubierto de fibronectina con 1 mL de medio (1.0 x 106 células/mL: los medios de comunicación). Las células 24 h antes de la aplicación anticipada del flujo laminar de la semilla si no otro tratamiento debe ser realizado.
    Nota: Estos números se utilizan como una guía para los experimentos con 24 h de flujo.
    1. Ajustar la densidad de siembra para lograr una monocapa confluente de células en el momento de la cosecha celular y la extracción de RNA.
  2. Que las células se adhieren a la diapositiva durante 15 min a 37 ° C.
  3. Añadir 3 mL de medio en cada pocillo de la placa de cultivo celular para cubrir la diapositiva e incubar las células a 37 ° C por 24 h con 5% CO2.

4. pequeño interferir ARN (siRNA) transfección

  1. Preparación de las células en portaobjetos de vidrio para experimentos de transfección y flujo de siRNA
    1. Seguir el protocolo en los pasos 2 (capa de diapositiva) y 3 (célula siembra sobre portaobjetos de vidrio) para la preparación de los portaobjetos de vidrio y recubrimiento para los experimentos de flujo.
    2. Las células de semilla 24 h antes del tratamiento siRNA (48 h antes de la aplicación de flujo laminar).
    3. Células endoteliales humanas de semilla en medio libre de antibiótico en 750.000 a 1 x 106 células por diapositiva para lograr la confluencia de 85% - 95% al día siguiente.
      Nota: HUVEC se utilizan en el presente Protocolo.
  2. Preparación de complejos de reactivo de transfección basado en lípidos siRNA (por deslizamiento)
    1. Diseño de siRNAs encargo u orden preconfeccionados siRNAs para el gen deseado de interés.
      Nota: Realice los pasos siguientes en un gabinete de bioseguridad.
    2. Añadir 6 μl de siRNA (stock de 20 μm) en 414 μl de medio de suero reducida (véase Tabla de materiales) y suavemente mezclar mediante pipeteo.
    3. Diluir 49.5 μl de reactivo de transfección suavemente mixto basado en lípidos (véase Tabla de materiales) en 130,5 μl de medio de suero reducido.
    4. Mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    5. Combinar siRNAs diluidos y el reactivo de transfección basada en lípidos, mezclar suavemente e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Mezcle suavemente para evitar la interrupción de los complejos de reactivo de transfección basada en lípidos.
      Nota: La solución puede aparecer turbia como forma complejos.
    6. Mientras que se están formando complejos, eliminar el medio de crecimiento y lave las células 1 x medio de suero reducido.
    7. Agregar 2,4 mL de medio de suero reducidos para cada diapositiva.
    8. Añadir 600 μl de complejos de reactivo de transfección suavemente mixto basado en lípidos siRNA a cada placa y la placa a la mezcla de la roca. Garantizar la concentración final de siRNA es de 40 nM. Asegúrese de que la diapositiva está completamente cubierta.
    9. Incube las células a 37 ° C durante 4 horas.
    10. Añadir 1 mL de medio de crecimiento de la célula endotelial libre de antibióticos que contienen 3 x la normal concentración de suero bovino fetal (FBS) sin quitar la mezcla de transfección.
    11. Incube las células a 37 ° C hasta que esté listo para usar.

5. cálculo de la tasa de flujo basada en la tensión de esquileo deseado9

  1. Calcular la tasa de flujo basada en las tensiones de cizallamiento deseadas según la siguiente ecuación:
    Equation 1
    Aquí,
    Q es el caudal en mL/min;
    Τ es la tensión de esquileo deseada en dinas/cm2 (1 Pa = 10 dinas/cm2);
    w es el ancho de la cámara de flujo paralelo de la placa en cm;
    h es la altura de la cámara de flujo paralelo de la placa en cm;
    μ es la viscosidad de los medios de comunicación en cP (g/Resumen).
    Nota: Tensión de esquileo laminares típicos experimentos (no pulsátil) en este flujo de trabajo se llevan a cabo en τ = 1 Pa (10 dinas/cm2). μ puede ser medida con un viscosímetro como un viscosímetro de cono y plato y puede variar según el contenido de los medios de comunicación incluyendo el suero y el dextrano adicional9.
  2. Para lograr una específica τ (esfuerzo cortante), ajustar la velocidad de flujo y viscosidad. A tasas de flujo más altas, las células adherentes pueden disociar de la diapositiva. Las tasas de flujo de la muestra con cámaras de flujo típicos se muestran en la tabla 1.

6. configuración de un entorno dedicado para monitoreo de múltiples cámaras de flujo paralelo de la placa (Figura 2) y sistema de

  1. Uso de una gran unidad climatizada/incubadora con múltiples estantes, acceso interior de la electricidad y puertas de cristal, conocido como la playa (ambiente integrado con ajustable CO2 ) y el calor — albergar múltiples cámaras de flujo al mismo tiempo para experimentos que requiere tensión de esquileo y la comparación directa entre dos o más tratamientos o salidas (es decir, DNA, RNA y proteínas).
    Nota: La playa permite monitoreo frecuente del circuito del flujo, incluyendo la tasa de flujo, sin la interrupción frecuente del medio ambiente.
  2. Asegurar suficiente CO2 para el experimento y que el monitor de CO2 es funcional. Asegurar adecuadamente se llena la bandeja de agua, que habrá aire humidificado.

7. instalación del aparato de flujo de placas paralelas

Nota: Para la fabricación de placas paralelas, por favor vea Lane et al. 9.

  1. Autoclave el flujo cámara de placas, embalse, amortiguador, tubo y luer para cada configuración de cámara de flujo paralelo de la placa como se indica en la tabla 2.
  2. Instalación de la Asamblea de circuito de flujo (Figura 3).
    1. Coloque toallas estériles en la seguridad biológica de gabinete. Montar el sistema de lazo de flujo, primero sin la cámara de flujo de placas paralelas, en el gabinete de seguridad biológica.
    2. Conecte el conjunto de tubería para el depósito:
      1. Inserte un tubo duro #14 un agujero y dos #14 tubos suaves en los otros dos agujeros en la tapa del depósito de flujo. Asegúrese de que uno de los tubos de suaves toque el fondo del embalse como tubería de salida .
      2. Coloque un 1/16" Luer masculino al final de la #14 duro tubo y conecte un filtro estéril como un sistema de ventilación.
      3. Coloque un 1/16" Luer hembra al final de la suave #14 entrada tubo, procedente de la reserva y fijar una llave de 4 vías.
        Nota: Para el análisis de expresión génica u otros estudios donde perfusates no necesitan ser recogidos, llaves de paso de 2 vías pueden utilizarse en lugar de llaves de 4 vías en este protocolo.
      4. Coloque un 1/16" Luer macho en el extremo del tubo de salida suave #14, que viene del depósito.
    3. Conecte el tubo de salida de depósito a la tubería de la bomba: Coloque un 1/16" Luer hembra en cada extremo de un tubo duro #13 (tubos de la bomba). Conecte el tubo de salida suave #14 del depósito al tubo duro #13 mediante la conexión de 1/16" Luer macho y hembra juntos.
    4. Conecte la tubería de la bomba con tubería de 'puente de amortiguador': Coloque una 1/8" Luer masculino y una 1/8" Luer hembra en cada extremo de un tubo suave de #16. Conexión 1/16" Luer hembra del tubo duro #13 (el final de la salida de la tubería de la bomba) con 1/8" Luer macho del tubo suave #16.
    5. Montar la tubería para el amortiguador de flujo: Coloque un 3/16" Luer macho en un extremo del tubo suave #25 y repetir este proceso para el otro lado de la pulsación de flujo. Fije los extremos libres de los tubos suaves #25 a cada lado de la pulsación de flujo.
    6. Conecte el tubo de 'puente de amortiguador' con la tubería para el amortiguador de flujo: Conecte un tubo suave #25 desde el amortiguador de flujo con el tubo suave #16 del 'puente de amortiguador' mediante el 1/8" Luer hembra del lado #16 'puente amortiguador' y la ya colocado 3/16" macho Luer desde el lado del tubo amortiguador suave #25.
    7. Montar el tubo de 'puente de cámara':
      1. Coloque una 1/8" Luer hembra y una 1/8" Luer macho en cada extremo de un tubo suave #16 (tubería de 'puente de cámara').
      2. Conexión 1/8" Luer hembra del 'puente de la cámara' con el 3/16" Luer macho en el tubo suave #25 del extremo libre de la pulsación de flujo.
      3. En el 1/8" Luer macho (extremo libre) de la tubería 'puente de cámara', coloque una llave de 4 vías.
    8. Conecte la llave de 4 vías desde el extremo libre del 'puente de la cámara' a la llave de 4 vías del tubo suave de entrada del depósito (del paso 7.2.2.3). Cerrar las llaves de paso.
    9. Añadir medios al depósito y el amortiguador. Para que la exposición de 48 h a tensión de esquileo, añadir 35 mL de medios de comunicación al embalse y a 25 mL y el de la pulsación. Ajustar el volumen de los medios de comunicación basado en la duración de la experiencia de flujo y el número de células sembradas.
    10. Llevar el sistema de lazo de flujo montado a la bomba en la playa. Coloque el tubo duro #13 (tubos de la bomba) en la cabeza de la bomba y fijarlo. Abrir las llaves de paso.
    11. Encienda la bomba y lentamente aumente la velocidad de la bomba. Los medios de comunicación, deje circular a través del sistema de lazo. Revise cualquier fuga o la obstrucción (p. ej., presión). Asegúrese de que los medios de comunicación está fluyendo hacia el depósito.
  3. Instalación de la Asamblea de la cámara de flujo
    1. Coloque una 1/8" Luer hembra en un extremo de un #16 suave del tubo y colocar una llave de 4 vías. Conecte el extremo libre del tubo a la derecha de la placa superior (entrada lateral) .
    2. Coloque una 1/8" Luer macho en un extremo de un #16 suave del tubo y colocar una llave de 4 vías. Conecte el extremo libre del tubo en el lado izquierdo de la placa superior (salida lateral).
    3. Coloque una 1/8" Luer masculino y una 1/8" Luer hembra en cada extremo de un tubo suave #16 (tubería de la trampa de la burbuja). Acople el tubo de burbuja trampa mediante el 1/8" Luer macho. Coloque una llave de 4 vías en el otro extremo de la tubería a través de la 1/8" Luer hembra.
    4. Utilizando pinzas estériles, transfiera el porta celular semillas de cristal de la placa de cultivo celular de 4 pozos a la hendidura en la placa inferior. Asegúrese de que el lado celular semillas de lo portaobjetos de vidrio quede hacia arriba.
    5. Utilizando una jeringa de 10 mL, añadir 10 mL de medio caliente a la placa inferior dentro de la línea de empaque rojo alrededor de la placa. Permitir que los medios de comunicación para flujo a través de la diapositiva y cubrir las células. Evitar la adición de medios directamente en la diapositiva.
    6. Suavemente Coloque la placa superior sobre la placa inferior, alineando de un lado a otro. Evitar la introducción de burbujas de aire. Atornillar las placas firmemente.
    7. Eliminar burbujas de aire de la botella lavagases abriendo la llave de paso a la derecha (entrada) de la placa y limpiar cuidadosamente 20 mL de medio tibia usando una jeringa de 30 mL. Asegúrese de que está cerrada la llave de paso a la izquierda (salida) de la placa y que los medios de comunicación está fluyendo a través de la llave de la trampa de burbujas (abierto). Desechar el medio sonrojado.
    8. Cierre la llave de paso en la trampa de la burbuja y abrir la llave de paso a la izquierda (salida) de la cámara. Elevar el lado izquierdo (salida) de la cámara en un ángulo de 45° y lave suavemente 20 mL de medio tibia usando una jeringa de 30 mL del lado derecho (entrada) de la cámara para eliminar las burbujas de aire de la cámara. Las burbujas pueden ser visualizadas a través de la ventana. Desechar el medio sonrojado.
    9. Cerrar los grifos en ambos lados de la cámara y la tapa. Examinar a las células por microscopía.
    10. Transporte de la cámara a la playa con el sistema de bucle montado anteriormente.
    11. Poco a poco disminuir la velocidad de la bomba y la bomba de pausa. Cerrar las llaves de paso en el sistema de lazo de flujo para evitar fugas.
    12. Conecte la cámara y lazo sistema juntos a través de grifos. Abra todos los grifos.
    13. Poco a poco aumentar la velocidad de la bomba y examinar la configuración para cualquier fuga o la obstrucción. Asegúrese de que los medios de comunicación circula en una dirección y se devuelve al depósito.
    14. Coloque el sensor de flujo en el tubo de 'puente de cámara' situado en el lado de entrada de la cámara. Asegúrese de que el sensor esté orientado correctamente en la dirección del flujo.
    15. Ajustar la velocidad de la bomba para obtener el caudal que se calculó anteriormente, basado en la tensión de corte deseada.
      Nota: La tasa de flujo puede variar dependiendo de la altura y la anchura de cada cámara, así como la viscosidad de los medios de comunicación.
    16. Encienda el tanque de CO2 para alcanzar 5% CO2 y colocar una bandeja de agua dentro de la playa.

8. recolección de las células y la extracción de ARN de la cámara de flujo

  1. Una vez finalizado el período de tiempo deseado de flujo, lentamente disminuya la velocidad de la bomba peristáltica a 0 y desconecte la energía eléctrica. Cierre todos los grifos abiertos y rápidamente quitar la cámara y el tubo conectado con una llave de paso en cada extremo.
  2. La cámara a una mesa limpia y suavemente Desatornillar todos los tornillos para quitar la placa superior. Con unas pinzas de punta de aguja, retire el portaobjetos de cristal de la placa inferior y colóquelo en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro.
  3. Lavar el portaobjetos con 10 mL de frío con tampón fosfato salino (PBS)- / - y comprobar las células bajo un microscopio para confirmar la adhesión celular y la alineación en la dirección del flujo.
  4. Aspire el PBS de la placa y transfiera el porta a un plato de diámetro 100 mm limpio. Añadir 350 μl de tampón de lisis de la extracción de RNA (véase Tabla de materiales), del kit que contiene 1/100 de beta-mercaptoetanol, a la diapositiva.
    Atención: Añadir beta-mercaptoetanol en una campana de humos químicos.
  5. Raspar las células de la diapositiva usando un raspador con una hoja de polietileno de la célula. Incline el plato de cultivo de tejidos, permitiendo el líquido a la piscina en el fondo y retirar el portaobjetos de cristal con pinzas. Pipeta de la célula del lisado en un tubo de 1,5 mL y conservar en hielo.
  6. Diluir el stock referencia exógeno RNA (RNA del luciferase) ng/μl 0.0025 por dilución seriada antes de añadir a la muestra. Por ejemplo, si la concentración del stock es 1 μg/μl, una dilución de 1/400.000 es necesaria para lograr 0.0025 ng / μl. Añadir 10 μl del diluido luciferase ARN para cada muestra de lisado para análisis y posterior aislamiento de RNA de la célula.
  7. Proceder con el protocolo de extracción de RNA según las instrucciones del fabricante, o congelar el lisado a-80 ° C hasta que pueda proceder con la extracción.

9. cálculo de la eficiencia de la extracción de RNA y síntesis del cDNA

Nota: Calcular la eficiencia de la luciferase después de RT-qPCR comparando el rendimiento teórico y rendimiento experimental.

  1. Determinar el rendimiento teórico para luciferase RNA.
    1. Determinar la cantidad total de ejemplares de luciferase añadido por muestra. (Añadir 0.025 ng/muestra = 2,73 x 107 copias de luciferase RNA por ejemplo antes de la extracción del RNA.)
    2. Calcular la masa molecular de la luciferase RNA usando una media masa molecular por nucleótido de 330 g/mol y multiplicarlo por la longitud de la luciferasa de luciérnaga ARN, nucleótidos de 1652.
    3. Dividir la cantidad de luciferase RNA añadido (0.025 ng) para cada muestra antes de la extracción de RNA por la masa molecular para producir la cantidad molar. Entonces, multiplicar por el número de Avogadro de ceder los ejemplares añadidos por muestra.
    4. Calcular el rendimiento teórico de las copias de la luciferasa para cada reacción de RT-qPCR utilizando la ecuación:
      Equation 2
  2. Calcular el rendimiento experimental de las copias de la luciferasa para cada reacción de RT-qPCR utilizando el plásmido luciferase para generar una curva estándar para RT-qPCR.
  3. Calcular la eficiencia de la luciferasa (%) utilizando la ecuación:
    Equation 3

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Representative Results

Éxito linealización de plásmido de luciferase usando enzimas de restricción fue confirmada por corrientes productos digeridos en un gel de agarosa (figura 1). El tamaño del producto lineal fue confirmado usando escaleras de ADN y comparación con plásmido sin cortar.

Hemos adaptado la instalación de la cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 para los experimentos que requieren múltiples condiciones/tratamientos con tensión de esquileo o varias condiciones de esfuerzo cortante. Utilizamos un entorno dedicado, la playa, que puede albergar múltiples, circuitos de flujo montado completamente que todos han vigilado el caudal (figura 2). Se controla el flujo justo aguas arriba de la Asamblea de placas paralelas (figura 3). Los circuitos de flujo y las tasas pueden controlarse directamente a través de puertas de vidrio sin causar fluctuaciones en la temperatura, la humedad o el contenido de gas dentro de la playa.

Procesos de fabricación pueden conducir a pequeñas variaciones en la altura de la cámara. Así, las tasas de flujo deben calcularse para que cada cámara lograr la misma tensión de esquileo (tabla 1). En teoría, cámaras con idénticas alturas pueden utilizar caudales idénticos para lograr la misma tensión de esquileo y pueden ser utilizados en la serie. Experimentos típicos con las células endoteliales utilizan tensión de esquileo de 0 - 1.5 PA Laminar tensión de esquileo de 1 Pa se utilizó en este flujo de trabajo a tensión de esquileo endotelial arterial modelo. También puede haber variaciones entre la bomba principal y dentro de las cabezas de bomba en el tiempo con el uso. Usando el medidor de flujo puede explicar estas diferencias.

Experimentos usando la aplicación de la tensión de esquileo a menudo involucran múltiples condiciones de estrés de cizalla, condiciones de tratamiento y puntos del tiempo. Siempre que sea posible, utilizamos una referencia endógena RNA a cuenta de cualquier variabilidad en el montaje experimental. Para algunos experimentos, encontrando un RNA de referencia endógena con estabilidad cuantitativa no es posible16. Además, cuantitativa estabilidad o inestabilidad de los genes de referencia endógena entre muestras puede atribuirse a cualquiera de los dos efectos dependiente del estímulo en los niveles de expresión celular o variaciones en las eficiencias de extracciones de RNA o reversa de la transcripción. Para dar cuenta de estas ineficiencias y en el ajuste donde un gen de referencia endógena no es cuantitativamente estable, se utiliza un gen de referencia exógena spike. Para los experimentos de incorporación laminar tensión de esquileo en mamíferas células endoteliales, utilizamos una luciferasa de luciérnaga RNA como un exógeno RNA spike (figura 4A).

La figura 4 muestra datos experimentales RT-qPCR de tensión de esquileo experimentos evaluando Krüppel-como el factor 2 (KLF2) pérdida de la función usando siRNA. KLF2 es un alza del factor de transcripción por flujo laminar en las células endoteliales y un importante mediador transcripcional de la expresión de genes endoteliales en el ajuste de flujo laminar2.

Figura 4A muestra eficiencias de luciferase para tres experimentos separados, cada uno con dos cámaras de flujo. Eficiencias de luciferase pueden ser similar entre las muestras de un experimento (experimento 1) o muestran cierta variabilidad (experimentos 2 y 3) (Figura 4A). Estos resultados son especialmente valiosos en sistemas experimentales donde se ven sólo pequeños cambios absolutos. El uso de un gen de referencia exógena puede ser particularmente importante en los experimentos donde los tratamientos experimentales pueden interferir con la eficiencia de la transcripción inversa o PCR17. Son típicos los resultados representados en la Figura 4A . Una eficiencia de luciferase de 5% indica que el 5% de la luciferase RNA (es decir, la cantidad inicial a partir de RNA) añadido a la muestra antes de la extracción de RNA se detecta por RT-qPCR. Entre muestras o condiciones dentro de un solo experimento, eficiencias de luciferase son generalmente ± 50%. Resultados deben interpretarse con precaución si la variabilidad de las eficiencias de luciferasa es > 50% y debe incluir una revisión de las condiciones y procedimientos experimentales.

Figura 4B muestra resultados experimentales típicos de RT-qPCR de tensión de esquileo repetidos experimentos, cada uno con múltiples cámaras de flujo paralelo de la placa. Dentro de cada experimento, la expresión del mRNA de KLF2 se normaliza en tres formas. La primera normalización utiliza un RNA de referencia endógena, ciclofilina A (CICA). La segunda normalización utiliza un RNA de referencia exógena, luciferasa de luciérnaga (Luc). La tercera normalización utiliza tanto la referencia endógena y exógena RNA. Dentro de cada experimento se muestra en la Figura 4B, los tres métodos de normalización (normalización el gen endógeno de la referencia, el gen de referencia exógena y ambos genes endógenos y exógenos referencia juntos) produce resultados similares. Si el método de normalización cambia significativamente los resultados (por ejemplo, conduce a > 50% de diferencia), los resultados deben ser interpretados con precaución. Cuando existe una variabilidad considerable entre los métodos de normalización, los genes de referencia endógena deben revisarse, como puede ser una variable dependiente en el sistema experimental. Del mismo modo, las condiciones y procedimientos experimentales deben ser revisadas. En la Figura 4B, KLF2 caída usando siRNA rinde similar eficiencia de precipitación entre tres diferentes experimentos (experimento 1, 2 y 3). Utilizamos tres distintas muestras biológicas para estos experimentos, con dos cámaras simultáneamente corriente de flujo tensión de esquileo en 1 Pa para cada experimento.

Figure 1
Figura 1: imagen de gel de agarosa de la linearización del plásmido luciferase exógenos. Escaleras de ADN superenrollado y 1 kb + se utilizan como marcadores para determinar ambos sin cortes y tamaños del corte luciferase plásmido en kilobases (kb). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema Resumen de múltiples asambleas de circuito de flujo dentro de un entorno dedicado (la playa). Las tasas de flujo en ambos circuitos de flujo fácilmente son monitoreadas en tiempo real, sin alterar el medio ambiente y ambos circuitos pueden ejecutar simultáneamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: esquema Resumen de un conjunto de circuitos de flujo único. Los tamaños de tubería y Luer utilizados se indica en esta figura. Asegúrese de que el medidor de flujo está orientado en la dirección del flujo y colocado aguas arriba de la cámara de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Representante resultados de experimentos de KLF2 pérdida de función en células endoteliales humanas expuestas a tensión de esquileo (1 Pa) para 24 h. (A) este panel muestra la cuantificación de luciferase exógeno RNA en tres experimentos de flujo separado. Eficiencias de luciferase pueden ser similar entre las muestras de un experimento (experimento 1) o muestran cierta variabilidad (experimentos 2 y 3). Luciferasa (copias absolutas) es el número de copia de luciferase RNA detectado por PCR cuantitativa de la transcriptasa reversa (RT-qPCR) por cuantificación absoluta usando una curva estándar. Eficiencia de luciferasa es las copias de luciferase experimental divididas por las teórica luciferase copias para cada muestra multiplicado por 100 (véase el paso 8 del Protocolo). Eficiencia relativa de la luciferasa es la eficiencia de la luciferasa de cada muestra dividida por la condición de referencia (flujo + Ctlsi) dentro de cada experimento. (B) estos paneles muestran la normalización de la expresión génica en un sistema de tensión de esquileo muestra experimentos usando ambos genes endógenos y exógenos de la referencia. Los resultados son de PCR cuantitativa de la transcriptasa reversa (RT-qPCR). Caída de la expresión del mRNA de KLF2 aparece en presencia de flujo laminar con la tensión de esquileo de 1 Pa para 24 h. FC = cambio de doblez; CICA = ciclofilina A, utilizado como una referencia endógena RNA; Luc = luciferase, utilizado como una referencia exógena RNA. Los datos adaptados de Man et al. 5. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Altura de cámara
(micras; μm)		 Ancho de cámara
(centímetros, cm) 		Caudal (mL/min) para tensión de esquileo de 1 Pa Viscosidad (centipoise; cP)
303.80 1.90 19.48 0.90
326.10 1.90 22.45 0.90
344.84 1.90 25.10 0.90
319.06 1.90 21.49 0.90

Tabla 1: Cámara de alturas y ejemplos de caudales para distintas cámaras de flujo lograr la tensión de esquileo de 1 PA.

Paños de J
Pinzas
Tapa y botella de depósito
Amortiguador y la tapa
Lazo de flujo
1/16" macho Luer x 3
1/16" Luer hembra x 3
1/8" Luer masculino x 2
1/8" Luer hembra x 4
Adaptador macho de 3/16" x 2
14 tubo duro L/S (2 pulgadas) x 1
14 L/S tubo suave (5 pulgadas) x 2
16 L/S tubo suave (3 pulgadas) x 2
25 L/S tubo suave (3 pulgadas) x 2
13 tubo duro L/S (10 pulgadas) x 1
Cámara de flujo
1/8" Luer masculino x 2
1/8" Luer hembra x 2
16 L/S tubo suave (3 pulgadas) x 3
Parte superior y las placas inferiores
Tornillos

Tabla 2: Piezas para ser esterilizado en el paso 6.2 del protocolo.

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Discussion

Tensión de esquileo es una condición fisiológica que modula la función endotelial, en parte, mediante la expresión de gene de estado estacionario2,5. Modelos de regulación génica en varias condiciones de esfuerzo cortante contribuirá a una mayor comprensión de la función endotelial. Este flujo de trabajo pragmático incluye un circuito de flujo usando una cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 y representa el flujo laminar, no pulsátil. La configuración global fue diseñada para facilitar los experimentos que requieren múltiples cámaras de flujo y reducir al mínimo la variabilidad experimental en este ajuste.

La Asamblea de circuito de flujo es un componente importante de este flujo de trabajo y se ha adaptado de Lane et al. 9. se hicieron varias adaptaciones de esta Asamblea y protocolo para reflejar las diferencias en los sistemas experimentales. Una unidad grande, la playa, es una adaptación que facilita la operación simultánea y el seguimiento de varios circuitos de flujo dentro del mismo entorno. Este sistema se ha utilizado con éxito para la aplicación de tensión de esquileo a las células endoteliales por varios periodos de tiempo, de 1 h a 7 días y en varios niveles de tensión de esquileo (p. ej., 1.0, 1.5 y 2.0 Pa). Este sistema también fue utilizado para estudios de precipitación del gene para evaluar la función de un gen endotelial sensible al flujo en el ajuste de tensión de cizalla (figura 4)5. Hay una considerable variabilidad entre bombas y cabezales de la bomba, que también pueden cambiar con el tiempo debido al desgaste normal. Para tener en cuenta estas diferencias, utilizamos un sensor de flujo situado próximo a la cámara de flujo para monitorear las tasas de flujo. Se utilizan varios tamaños de tubería y luer para asegurar un ajuste apretado para cada componente y para prevenir cualquier fuga durante los experimentos. Cuentan las células y sembradas aproximadamente 1.000.000 células por portaobjeto gota a gota y que las células de incubar a 37 ° C durante 15 minutos aumentar la eficiencia de adhesión. En comparación con las células progenitoras endoteliales, que pueden ser sembradas por un corto tiempo antes de la aplicación de la tensión de esquileo9, semilla de células endoteliales humanas durante al menos 24 h antes de la aplicación de la tensión de esquileo. Duraciones más cortas pueden provocar el desalojo de las células durante el flujo, o una capa discontinua de células endoteliales, incluso con la densidad de siembra adecuada. Hacemos hincapié en la inspección de las diapositivas para una monocapa confluente de células endoteliales, tanto antes como después de la aplicación de la tensión de esquileo. Encontramos que diapositivas con fibronectina, un componente de la matriz extracelular natural18, mantengan la monocapa endotelial más consistente en comparación con lados recubiertos con gelatina (desnaturalizado fibrilar colágeno tipo I). Finalmente, los amortiguadores de flujo en este protocolo están optimizados para utilizar 30 mL de medio, en comparación con 190 mL de medios de comunicación para otros fabricantes.

Varios pasos en el montaje de circuitos de flujo requieren cuidado adicional. Una incluso monocapa de células endoteliales debe establecerse antes de la aplicación de la tensión de esquileo. Es importante para las células de la semilla sobre el portaobjeto gota a gota al aumentar el número de células que se adhieren a la diapositiva y, por tanto, la cobertura total de la diapositiva. El tiempo de espera entre célula siembra y añadiendo contenido multimedia adicional a la diapositiva generalmente mejora la eficiencia de siembra ya que proporciona tiempo suficiente para que las células se adhieren a la diapositiva en lugar de ser arrastrados en la bandeja de múltiples diapositiva. Inspeccione visualmente las células antes, durante y después de la aplicación de la tensión de esquileo. Un microscopio puede ser situado en la playa para este fin. El sensor debe fijarse en la orientación correcta y la velocidad de flujo objetivo debe comprobarse para cada cámara de flujo individual. El sistema de lazo de flujo debe ser inundado sin la cámara para asegurar ninguna salida de medios de comunicación u otros problemas, como la acumulación de la presión, para evitar perturbar las células durante los experimentos reales. Inspeccione y eliminar las burbujas en el sistema. Al probar el sistema de lazo de flujo, asegúrese de que los grifos están abiertos antes de encender la bomba peristáltica que permiten un flujo ininterrumpido, unidireccional. Garantizar que todos grifos son cerradas antes de instalar la cámara de flujo sobre el lazo y completamente abiertos antes de reiniciar la bomba.

Encontramos que la adición de un gen de referencia exógena es útil en una variedad de escenarios. Medios de comunicación de la célula endotelial a menudo contiene heparina, la cual es un inhibidor de la polimerización en cadena17. Mientras que algunos protocolos de extracción de RNA incorporan medidas para eliminar la heparina, trazas pueden causar diferencias en la eficiencia de la PCR entre muestras. Tratamientos potentes también pueden impedir la identificación de un gen endógeno referencia cuantitativa estable. Nuestro laboratorio ha creado un protocolo eficiente para sintetizar RNA tope 5' y cola de poli A luciferase para uso como un RNA de referencia exógena. Esta estrategia ha demostrado para ser un enfoque rentable en comparación a la compra de un RNA comercialmente disponible. Durante la preparación de referencia exógeno RNA es importante alícuota RNA en alícuotas de un solo uso para evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo. Mezcla y pipeteo preciso son fundamentales para mantener consistencia entre alícuota. Experimentos típicos muestran una eficacia de luciferasa en el rango de 5% ± 2,5% pero pueden variar de 1% - 10%. Es prudente corregir resultados RT-qPCR para la eficacia de referencia exógeno RNA y un gen de referencia endógena (limpieza).

Para los experimentos que llevamos a cabo, se utilizan secuencias de luciferasa de luciérnaga no mamíferos en punto referencia RNA en modelos de mamíferos. En experimentos donde luciferasa de la luciérnaga se expresa en las células, esto no sería un gen de referencia. Otros genes de referencia específicos para cada especie se pueden utilizar, incluyendo el Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 y ribulosa bifosfato carboxilasa planta RNA20.

Este circuito de flujo modelos una monocapa de 2-D de las células endoteliales en cultivo de tejidos de plástico o vidrio, que es bastante rígido. Rigidez de la matriz puede influir en la respuesta endotelial a tensión de esquileo líquido21. Este modelo utiliza una concentración relativamente alta del oxígeno más similar al arterial que las concentraciones de oxígeno venoso. Este modelo de cerca se asemeja a segmentos rectos de los buques más grandes en un sistema cardiovascular cerrado y proporciona un entorno relativamente homogéneo de las células endoteliales en la diapositiva. Otras condiciones específicas en las estructuras 3D, tales como bifurcaciones o curvaturas de los vasos, no están representados con este modelo. Otros sistemas pueden modelo otros patrones de flujo, los de las regiones curvas de la vasculatura, incluyendo pero producen menos células que el sistema descrito en el presente Protocolo. Del mismo modo, otros conjuntos pueden ser más apropiados en caso de > 1 x 106 células, o si se requiere el análisis de un sola célula. Nuestra aplicación actual de los modelos no-pulsátil de flujo laminar. Sin embargo, este modelo puede utilizarse para generar otras formas de onda, incluyendo formas de onda oscilatorias o pulsátiles, con consistencia, como las tasas de flujo son monitoreadas continuamente.

En general, este flujo de trabajo pragmático proporciona un sistema para la aplicación simultánea de la tensión de esquileo para múltiples cámaras de flujo con caudales monitoreados. Materiales y procedimientos a través de este flujo de trabajo están diseñados para minimizar la variabilidad entre las muestras y las condiciones experimental. Este flujo de trabajo se ha utilizado con éxito para los experimentos de RNAi en el ajuste de flujo laminar y puede también ser utilizado para cualquier experimentos que requieren de varias condiciones con la tensión de cizalladura laminar, o varias magnitudes de tensión de esquileo laminar o puntos del tiempo, incluyendo formas de onda alternativa.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por CIHR fregona 142307 a p.a.m. H.S.J.M. es un beneficiario de un programa canadiense de institutos de salud investigación formación en beca de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. y M.K.D. son los destinatarios de las becas de postgrado Reina Elizabeth II en la ciencia y la tecnología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA gibco 25300-062
10 mL Syringe BD 302995
10 mm2 Culture Dish Sarstedt 83.3902
30 mL Syringe BD 302832
4-Way Stopcocks Discofix D500
Aluminum foil
BEACH Darwin Chambers Company MN: HO85, SN: 4947549
Cell Scrapers
CO2 Meter BioSphenix, Ltd. MN: P120, SN: 0342
CO2 Sensor BioSphenix, Ltd. MN: C700, SN: 52852
Distilled water gibco 15230-170
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- gibco 14190-144
Endothelial Cell Growth Medium 2 Promo Cell C-22011
Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix Promo Cell C-39216
Fibronectin (pure) Sigma-Aldrich 11051407001
Filter (0.20 um) Sarstedt 83.1826.001
Flow Dampener and Cap U of T glass blowing shop
Flow Meter: 400 Series Console Transonic Scisense Inc. T402
Flow Meter: 400 Series Tubing Transonic Scisense Inc. TS410
Flow Reservoir and Cap U of T glass blowing shop
Flow Sensor Transonic Scisense Inc. ME4PXL
Isotemp 737F Oven Fisher Scientific FI-737F
J cloth J cloth
Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) Fisherfinest 12-544-4
Paper sterilization pouch Cardinal Health 92713
Pump (Masterflex L/S Economy Drive) Cole-Parmer 7554-90
Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) Cole-Parmer 7518-00
Rectangular 4 Well Dish Thermo Scientific 267061
Tweezers
Name Company Catalog Number Comments
Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-14
Name Company Catalog Number Comments
Luer
3/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-08 For #25 tubing
1/8" Male Luer Cole-Parmer 30800-24 For #16 tubing
1/8" Female Luer Cole-Parmer 30800-08 For #16 tubing
1/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-00 For #14 tubing
1/16" Female Luer Cole-Parmer 45508-00 For #14 tubing
Name Company Catalog Number Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine Reagent Invitrogen 12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Medium gibco 31985-070
Name Company Catalog Number Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ DNA ladder Thermo Scientific SM1331
MEGAclear Kit Ambion AM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
pSP-luc+ Promega E4471
Supercoiled DNA Ladder New England BioLabs Inc. N0472S
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500
UltraPure Ethidium Bromide Invitrogen 15585011
XhoI Restriction Enzyme New England BioLabs Inc. R0146S
Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction
Beta-mercaptoethanol Sigma M3148-100mL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104

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References

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Bioingeniería número 140 cámara de flujo tensión de esquileo flujo laminar placas paralelas monitoreo endotelio expresión génica regulación génica PCR cuantitativa normalización luciferasa RNA de referencia
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