Summary
Ce protocole prévoit les mesures nécessaires pour établir et évaluer les infections néonatales chez les souris âgées de 7 jours.
Abstract
Septicémie néonatale reste un fardeau mondial. Un modèle préclinique à des interventions prophylactiques ou thérapeutiques efficaces écran est nécessaire. Infection polymicrobienne souris néonatale peut être induite par l’injection de boue caecum par voie intrapéritonéale dans jour de souris de vie 7 et leur surveillance pour la semaine suivante. Présentées ici sont les étapes détaillées nécessaires à la mise en œuvre de ce modèle de septicémie néonatale. Cela consiste à créer un stock de lisier caecum homogène, il diluer une dose ajustée de poids et de litière, un aperçu de l’horaire de surveillance et d’une définition des catégories de santé observées utilisé pour définir les points limites. La génération d’un stock de lisier caecum homogène de bailleurs de fonds mis en commun permet d’administrer en plusieurs portées au fil du temps, réduire la variation entre les donateurs et empêcher l’utilisation de glycérol potentiellement toxique. La stratégie de surveillance utilisée permet l’anticipation du résultat de la survie et l’identification des souris qui progresserait plus tard à la mort, ce qui permet une identification antérieure du point de terminaison sans cruauté. Deux principales caractéristiques comportementales sont utilisés pour définir les scores de la santé, à savoir, la capacité des souris néonatales à droite eux-mêmes lorsqu’il est placé sur leur dos et leur niveau de mobilité. Ces critères pourraient potentiellement être appliqués aux points limites adresse dans d’autres études de maladies néonatales chez les souris, tant qu’une étude pilote est effectuée pour confirmer l’exactitude. En conclusion, cette approche fournit une méthode normalisée de septicémie néonatale modèle chez la souris, tout en fournissant des ressources pour évaluer le bien-être des animaux utilisé pour définir les points limites précoces pour animaux contestée.
Introduction
Une septicémie est une cause majeure de décès infectieuse nouveau-né humain1. Parce que la septicémie néonatale est mal connue, peu a progressé à la fois l’identification des nouveau-nés à risque très tôt au cours de la maladie et le développement de traitements efficaces ou prophylactiques. Cela nécessite l’utilisation de modèles animaux de septicémie à mieux comprendre les processus et test des interventions possibles. En outre, les rongeurs adultes réagissent différemment à une septicémie, avec des différences statistiquement significatives dans le nombre de bactéries à administrer pour obtenir la même dose létale (DL) et les différences dans la réponse de l’hôte qui en résulte par rapport aux nouveau-nés2. Ainsi, septicémie néonatale doit être étudiée chez les nouveau-nés. Plusieurs modèles de septicémie adultes ont été utilisés dans la recherche d’une septicémie. Il s’agit d’un défi par voie intraveineuse avec certains organismes impliqués dans l’infection humaine adulte ou ligature caecum et perforation (CLP). CLP est un modèle d’endogène défi où le caecum est chirurgicalement isolé, ligaturé et perforé pour permettre la fuite du contenu intestinal dans le péritoine, aboutissant à la diffusion systémique des microbes et de leurs produits3. Toutefois, l’intervention chirurgicale nécessaire pour établir la CLP est mortelle pour les animaux nouveau-nés ; une autre méthode est donc nécessaire pour imiter le défi polymicrobienne du CLP pour induire des infections néonatales. Le modèle de lisier caecum polymicrobienne neonatal sepsis a été développé pour répondre à ce besoin, selon laquelle le contenu cæcal des animaux est récolté, suspendu en stérile dextrose 5 % dans l’eau (D5W) et injecté par voie intrapéritonéale dans des souris nouveau-nées2. C’est, depuis, devenu un modèle de plus en plus populaire pour étudier une septicémie chez les animaux adultes et nouveau-nés et a avancé considérablement les perspicacités mécanistes dans processus4,5,6,7 de la maladie ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Étant donné l’utilisation croissante de ce modèle et de la volonté des chercheurs de comparer directement les résultats à travers des publications, il est nécessaire pour les aspects techniques être bien décrite et normalisées dans toutes les études. Normalisation s’applique à trois aspects du modèle, à savoir i) la préparation du stock lisier caecal, ii) la préparation des aliquotes de défi pour injection dans les animaux de laboratoire et iii) la définition du point de terminaison sans cruauté auquel cas animaux sont réputées survécu dans des expériences de défi. Plus précisément, méthodes pour préparer le stock de lisier caecum renvoient souvent vers l’article original présentant le modèle2. Un bref résumé de ce modèle est que contenu cæcal de souris adultes ont été récoltés, suspendu en D5W stérile à une concentration de 80 mg/mL et utilisé moins de 2 h pour injecter les animaux de laboratoire. Ce modèle original utilisé des souris du même âge, à l’emplacement du vendeur, qui étaient logés dans leurs installations de recherche respectifs pour moins de 2 semaines avant la récolte contenu cæcal. L’utilisation de souris accouplées internes, bien que réduisant le coût de livraison fournisseur régulier et autorisant l’utilisation de souris excès d’une vaste gamme de sexe et âge, également considérablement augmenté variabilité de donateurs-à-donateurs. Ceci a motivé le développement d’une technique alternative, selon laquelle contenu cæcal de plusieurs souris ont été groupés ensemble pour préparer un stock important, qui était alors aliquotés et congelés à-80 ° C13. Cette méthode alternative a été adaptée par plusieurs groupes14,15. Cependant, cette adaptation a entraîné certaines variantes techniques, tant dans les médias de stockage utilisés (10 % ou 15 % de glycérol, ou seul D5W) que dans la stratégie de filtration pour éliminer les particules (multistage filtration à travers un 860 µm et, ensuite, un 190 µm filtre, ou une personne filtrations par 100 µm ou 70 filtres µm)13,14,15. L’injection de glycérol seul pourrait potentiellement causer du tort, étant donné que les injections de glycérol de 25 % - 50 % ont été utilisées comme un modèle de rongeur de lésion rénale16,17,18,19, 20. Pour éviter des effets secondaires involontaires du glycérol, la préparation de lisier caecum stock pour la souris dans cette étude est gelée dans D5W sans glycérol, et subissent des tests de viabilité bactérienne du stockage à-80 ° C. La stratégie de filtration utilisée dans cette étude est un passage à travers un filtre de 70 µm, qui n’a pas été directement comparé aux autres stratégies filtration énumérés.
Doses létales de poids ajusté de lisier caecum injectée peuvent varier d’une installation pour l’installation et doivent être titrés out à la létalité désirée pour différents groupes. Avec des doses différentes, les volumes de défi accompagnement changent par nécessité. Cependant, ce détail méthodologique n’a été signalé avant. En outre, des stratégies pour des procédures standards, telles que l’injection intrapéritonéale, sont rarement développés au sein de la littérature, mais techniques individuelles peuvent avoir pour effet que les souris nouveau-nées fuient lorsqu’elle est injectée et impact sur leurs résultats finaux.
Bien-être des animaux, y compris une définition de point de terminaison sans cruauté, est un aspect central de ce modèle et dans n’importe quel modèle d’infection et l’inflammation chez les rongeurs,21. En 1998, le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) a publié des lignes directrices pour la sélection de point de terminaison sans cruauté, définir le point de terminaison sans cruauté, comme « toute douleur réelle ou potentielle, une détresse ou un inconfort, devrait être minimisé ou allégé en choisissant le plus tôt point de terminaison qui est compatible avec les objectifs scientifiques de la recherche »22. D’autres aussi attention que les points limites doivent être établies fondée sur une justification scientifique plutôt que sur une interprétation subjective de l’état de l’animal seul21. Bien qu’il y a une multitude de ressources pour clinique, comportementales et des critères de condition corporelle axée sur le signe pour point de terminaison sans cruauté, même dans le contexte de l’infection et l’inflammation spécifiquement21,23,24, aucune de ces , y compris les lignes directrices du CCPA pour le point de terminaison sans cruauté22, mentionner les souris nouveau-nées. Ainsi, les points limites objectivement et scientifiquement justifiées sont beaucoup plus difficiles à mettre en place pour les animaux nouveau-nés, compte tenu de leurs capacités comportementales limitées tant en l’absence de preuves de critères comme la perte de poids, qui est couramment utilisé pour adulte souris. Actuellement, les critères du point de terminaison sans cruauté servant de souris néonatales âgés de 5 à 12 jours dans la littérature de lisier caecum toute référence au manuscrit original qui a présenté le modèle2. Dans cet article original, la définition du point de terminaison sans cruauté des animaux nouveau-nés était fondée sur deux critères ; à savoir, l’emplacement d’une souris à l’extérieur du nid (diffusion) et l’absence de taches de lait avaient été vu à entraîner la mort dans les heures. Quelques complication dans l’attribution d’un point de terminaison sans cruauté, c’est que les taches de lait deviennent difficiles à voir dans les souches de souris avec fourrure sombre, comme la souche C57BL/6J couramment utilisée, après la première semaine de vie, tandis que les animaux malades sont suivis jusqu’au 14e jour de vie (DOL). Autres animaux morts se trouvent postchallenge lors de l’application de ces critères (propre observation, non publié) ; ainsi, une définition plus rigoureuse du point de terminaison sans cruauté est nécessaire pour soulager la souffrance des animaux expérimentaux et éviter la mortalité dans les situations où le résultat pourrait être précisément discerné plus tôt.
Les trois aspects méthodologiques du modèle caecum lisier sont présentés dans un mode opératoire normalisé décrivant la préparation du stock de lisier caecal, une méthode d’injection d’animaux de laboratoire, qui conserve la constante de volume d’injection entre les doses et réduit les risques de fuites et d’une définition du point de terminaison sans cruauté pour les souris âgés de 7 à 12 jours basé sur un système de modélisation comportementale. Informations comportementales des scores de santé souris parmi plus de 240 animaux de laboratoire a été collectées et regroupées selon le résultat final de la survie, démontrant une définition axée sur les éléments de preuve du point de terminaison sans cruauté. La souffrance des animaux d’expérimentation est réduite en identifiant les moribonds souris néonatales le plus tôt possible le moment, alors que les résultats de survie biologiquement significative peuvent être déduites par l’observation des variables clés. La représentation visuelle de lisier caecum préparation et des comportements de souris néonatales servira une excellente ressource pour n’importe quel groupe chargé d’étudier la septicémie ou défi nouveau-né modèle animaux.
Protocol
Toutes les expériences dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique sous le numéro de protocole A17-0110.
1. stérilisation de l’outil
- Dans une hotte de sécurité biologique (BSC), allumez et préchauffer le stérilisateur de boudin chaud à 250 ° C, au moins 30 min avant utilisation.
- Tremper les outils dans l’éthanol à 70 %.
- Submerger les outils dans le stérilisateur de boudin chaud préchauffé pendant au moins 1 min.
Remarque : Les poignées des outils devient brûlante et peuvent brûler si laissée dans le stérilisateur de boudin chaud pour plus de 1,5 min. - Vaporiser une natte de serviettes en papier avec de l’éthanol 70 % à stériliser.
- Supprimer les outils du stérilisateur chaud perle sans toucher la partie stérilisée de l’outil pour les poignées non stériles d’autres outils submergées et placez-les sur l’essuie-tout arrosée à l’éthanol.
- Attendre 30 s à 2 min pour les outils nécessaires pour refroidir avant de les utiliser pour la dissection.
2. préparation de la boue caecum
- Preweigh tubes à centrifuger 15 mL (un tube pour chaque cinq souris étant euthanasiés).
- Euthanasier les donateurs de lisier caecum conformément aux directives locales de soins aux animaux, ou utiliser le protocole ci-dessous.
NOTE : Jusqu'à 40 souris C57BL/6J entre 6 et 12 semaines vieux ont été utilisés pour préparation boue caecal, avec jusqu'à cinq souris être euthanasiés à la fois.- Transférer les souris dans la chambre de l’euthanasie et la valeur de la machine d’anesthésie isoflurane à 5 % avec la perfusion d’oxygène.
- Surveiller les souris pour observer la perte de la capacité de déplacer et de les voir entrer dans le plan chirurgical de l’anesthésie et enfin, cesser de respirer.
- Retirer les souris de la chambre de l’euthanasie, pincer sa patte et a observé une rétraction de la jambe ou l’inhalation. Si un est présent, retourner la souris à la chambre de l’euthanasie ; Sinon, continuez.
- En phase terminale euthanasier les souris par forte dislocation cervicale.
- Effectuer la dissection du caecum, l’utilisation des outils préstérilisés et refroidis (voir section 1) d’un BSC.
- Epinglez les pattes de la souris à un comité de mousse de polystyrène extrudé à l’aide d’aiguilles 23 G pour que la souris a son abdomen vers le haut. Fixer et puis pulvériser l’abdomen avec l’éthanol à 70 %.
- À l’aide de ciseaux et une pince stérile, couper à travers la peau, agir sur la peau du revêtement péritonéal avec les ciseaux et coupe ouverte une zone rectangulaire de l’aine au sternum et côté gauche sur côté droit. Retirer toute fourrure du péritoine.
- Passer à une nouvelle paire d’outils stériles pour couper à travers le péritoine, faire une ouverture rectangulaire, comme l’a fait pour la peau, commutation outils si ceux utilisés le contact de la peau.
- Identifier le caecum, qui devrait être exécuté à gauche à droite à travers le corps. Perturber le tissu conjonctif pour identifier les branches des intestins caecum et couper le caecum de l’intestin. Placez le caecum sur une feuille stérilisée de pesée papier.
NOTE : Un poids de papier peuvent être stérilisé en vaporisant avec de l’éthanol 70 % sur les deux côtés et laisser sécher, ou par irradiation aux rayons UV. Par ailleurs, le caecum peut être disséqué sur une plaque de Petri stérile.
- Extrusion de contenu cæcale
- Dans un baccalauréat, utiliser des outils stériles pour couper à travers les deux extrémités du caecum.
- Tenez le milieu du caecum avec une pince stérile et utilisez une spatule métallique plat stérile doucement pousser le contenu cæcal hors de la coupe se termine, à l’aide d’un mouvement de roulement et d’éviter un mouvement de grattage qui pourrait déchirer l’épithélium. Recueillir le contenu et les placer dans un tube à centrifuger prépesé 15 mL.
- Centraliser le contenu cæcal d’un maximum de cinq souris dans le même tube. Peser à nouveau le tube une fois que tous les contenus ont été ajoutés.
Remarque : S’attendre à une moyenne de 300 mg et jusqu'à 390 mg de lisier caecum par souris, exigeant 1,8 à 2,4 mL de D5W pour remise en suspension par souris ; Donc, à l’aide de plus de cinq souris au cours de cette étape peut entraîner un remplissage excessif du tube à centrifuger 15 mL. - Nettoyer les outils avec un essuietout de papier arrosée à l’éthanol et les restériliser en répétant les étapes 1,2 à 1,6.
- Filtration de lisier caecum
- Peser le tube à centrifuger rempli de contenu caecal et calculer le montant de D5W à ajouter au contenu cæcal en divisant le poids du contenu cæcal par la concentration désirée stock en milligrammes par millilitre, comme dans l’équation ci-dessous.
- Dans un baccalauréat, ajouter la quantité requise de D5W glacée dans le tube à centrifuger 15 mL contenant le contenu du caecum.
- Vortex le 15 mL centrifuger le tube verticalement et horizontalement pendant 30 s. Recherchez les particules de plus de 1-3 mm de diamètre et s’il est présent, poursuivre vortex jusqu'à ce que toutes les grandes particules a visiblement disparu.
- Placez une passoire de cellule stérile 70 µm dans un tube à centrifuger 50 mL qui est mis dans la glace. Pipetter 4 mL de lisier caecum resuspendue dans la crépine de la cellule et, ensuite dans le tube de prélèvement. Remettre en suspension les particules de pipetage et descendre 2 x x-3. Doucement extruder des bulles pour augmenter la vitesse de filtrage en remuant le contenu avec l’embout de la pipette jusqu'à ce qu’il n’y a aucun gouttelettes plus filtrés.
Remarque : Lors du mélange, il y a peut-être particules assez grand pour brancher la pipette de 5 mL. Dans ce cas, répétez le vortex de l’étape 2.5.3 et si la solution encore ne rompt pas apart, utiliser la pipette pour appuyer sur les particules contre la paroi du tube à centrifuger. - Répétez l’étape 2.5.4, changeant les crépines de la cellule entre chaque tube de lisier caecum et piscine tout le contenu dans le tube de prélèvement de centrifugeuse 50 mL même gardé sur glace ou dans un deuxième tube à centrifuger 50 mL si le volume du filtrat dépasse le niveau de la glace dans la glacière.
- Peser le tube à centrifuger rempli de contenu caecal et calculer le montant de D5W à ajouter au contenu cæcal en divisant le poids du contenu cæcal par la concentration désirée stock en milligrammes par millilitre, comme dans l’équation ci-dessous.
- Aliquoter le lisier caecal.
- Le cas échéant, combiner plusieurs tubes de filtrat lisier caecum 50 mL de l’étape 2.5.5 dans un plus grand récipient stérile (par exemple, une bouteille de stockage de 1 000 mL). Puis, vortex pour 15 s et verser 20 mL dans un tube à centrifuger de nouveau 50 mL.
- Vortex du stock de lisier caecum qui est dans le tube à centrifuger 50 mL pour 5-10 s et aliquote 500 µL dans trois fioles cryogéniques de 2 mL qui ont un joint en caoutchouc, pour éviter une évaporation au fil du temps. Placer immédiatement le maître stock et aliquoté flacon cryogénique sur glace.
- Répétez les étapes 2.6.1 et 2.6.2 jusqu'à ce que toute la boue caecale a été aliquotés, vortex le stock principal après chaque trois fioles cryogéniques pour prévenir l’installation de toute particule et maintenir le mélange homogène.
- Geler les aliquotes de lisier caecum à-80 ° C.
Remarque : S’attendre entre trois ou quatre flacons stocks à 500 µL de chacune des souris adultes. Chaque flacon de stock devrait être à peu près assez de défi une litière de huit souris 7 DOL.
3. défi septicémie de souris néonatales âgées de 7 jours
- Séparer, identifier et peser souris néonatales.
- Dans un baccalauréat, transférer les souris néonatales à une nouvelle cage pour garder les souris loin du barrage et à réduire le stress jusqu’au barrage.
- Retirez et frotter la partie de la matière de nidification avec des gants de transférer l’odeur de la cage aux gants. Ensuite, le moule le matériaux de nidification dans un petit nid et placez-le dans une nouvelle cage sans le barrage.
- Transférer les souris néonatales dans le matériaux de nidification dans la nouvelle cage.
- Transfert de matériaux de nidification plus pour faire un deuxième nid vide dans la nouvelle cage.
- Fermer et enlever la cage du barrage de la hotte pour que le barrage n’est pas stressé d’entendre de la détresse de la souris néonatales.
- Pour suivre chaque souris néonatales dans la litière au fil du temps, utilisez un marqueur de l’éthanol à l’épreuve pour marquer un à cinq points à l’avant ou l’arrière de la queue, réappliquer toutes les 12 à 24 h selon les besoins.
- Peser chaque souris qui sera mise au défi, plaçant chacun dans le secondaire nid après avoir pesé et répétez cette opération pour toutes les souris.
- Retourner la litière entière jusqu’au barrage avant de préparer le défi de lisier caecum aliquot.
- Calculer les doses individuelles de poids ajusté de lisier caecum et dilution requise avec D5W en exécution de cette étape pour chaque portée séparément, en utilisant les calculs ci-dessous ou à l’aide de la feuille de calcul fourni (voir Dossier supplémentaire).
- Calculer la milligrammes de caecum lisier (un), qui sera administrée à chaque souris en multipliant le poids de la souris en grammes (b) de la dose de défi désiré en milligrammes de lisier caecum par gramme de souris (c).
- Calculer le volume individuel de lisier cæcale non dilué stock requis par souris en microlitres (d) en divisant la milligrammes de lisier caecum nécessaire par la souris de l’étape 3.2.1 (un) par la concentration de stock lisier caecal, 160 mg de lisier caecum par millilitre de D5W (e) et en multipliant par 1 000 µL par millilitre pour convertir millilitres en microlitres.
- Moyenne du stock volume de lisier caecum exigé par souris (g) en additionnant le volume du stock de lisier caecum (d) par souris dans une litière de souris n , divisé par le nombre de souris (n).
- Calculer le facteur de dilution moyenne pour le stock de lisier caecum (h) en divisant le volume d’injection moyenne (100 µL) par le volume de stock moyen de lisier caecum requis par souris (g).
- Calculer le volume d’injection spécifique de chaque souris en microlitres (j) en multipliant le volume de chaque souris de lisier caecum stock requis (d) par le facteur de dilution moyenne (h) et ensuite arrondir aux dix plus proche (pour correspondre à la 10 µL par incréments de la seringue d’injection).
- Calculer le volume nécessaire moyen de D5W pour diluer le stock de lisier caecum (k) en soustrayant le stock moyen de lisier caecum (g) du volume moyen d’injection (100 µL).
- Calculer le montant total du stock de lisier caecum en microlitres (l) en multipliant la boue caecum stock moyenne par souris en microlitres (g) par le nombre de souris dans cette litière (n) et en multipliant par 1,4 pour créer supplémentaire.
- Calculer le montant total de D5W en microlitres (m) pour diluer le stock de lisier caecum en multipliant le volume requis moyen de D5W (k) par le nombre de souris (n) et en multipliant par 1,4 pour créer supplémentaire.
- Calculer la milligrammes de caecum lisier (un), qui sera administrée à chaque souris en multipliant le poids de la souris en grammes (b) de la dose de défi désiré en milligrammes de lisier caecum par gramme de souris (c).
- Préparer l’aliquote de défi après avoir calculé la quantité de boue caecum stock requis (l étape 3.2.7). Dans un baccalauréat, décongeler le nombre requis de flacons stock caecum de boue à température ambiante, pipetage son contenu pour mélanger.
- Lorsqu’il n’y a pas plus visibles cristaux de glace présents dans la boue caecum décongelée, transférer le montant calculé du stock de lisier caecum (l étape 3.2.7) dans un tube de microcentrifuge stérile de 1,8 mL.
- Diluer à la concentration requise en ajoutant D5W glacee tel que calculé à l’étape 3.2.8 (m). Stocker l’aliquote de défi sur la glace.
- Avant de charger la seringue, mélanger le tube de microcentrifuge de pichenette il x 20, suivi de 3 x d’élaboration et d’expulser les 300-500 µL de lisier caecum avec une seringue à insuline cc 28 G ½ pouce 500.
- Aspirer à peu près 150 µL de lisier caecum dilué dans la même seringue.
- Feuilleter la seringue pour déloger les bulles du plongeur, tirer légèrement sur la seringue et puis expulser les bulles.
- Distribuer la boue excédentaire caecum dans le tube de microcentrifuge jusqu'à la bonne quantité de lisier caecum pour une souris, comme a été calculé pour souris individuels à l’étape 3.2.5 (j), est chargé dans la seringue.
- Par voie intrapéritonéale injecter coulis caecal, conformément aux directives pertinentes animalier local institution, ou suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Dans un baccalauréat, séparer les souris néonatales du barrage comme indiqué au point 3.1.
- SCRUFF la souris par l’arrière du cou, en utilisant le pouce et l’index.
- Sécurisées queue de la souris sur le dos de la moyenne et l’annulaire, ou sur le front des doigts anneau et pinky.
- Pour limiter les fuites, incliner la souris néonatale afin qu’elle soit face vers le bas et insérer le biseau de l’aiguille de l’aiguille vers le haut, entre la jambe et les organes génitaux, gardant l’aiguille sous-cutanée et peu profondes.
- Lorsque l’aiguille est insérée sur 1 cm, pressez vers le bas et vers l’avant pour sentir l’aiguille perforation du péritoine. Appuyer lentement sur le piston, en gardant la pointe de l’aiguille aussi immobile que possible, car les mouvements latéraux risqueraient d’endommager les organes de la souris.
- Retirer délicatement l’aiguille pendant 5-10 s, suivant le même itinéraire sur comme, en relaxant le doigt du milieu lors de l’enlèvement pour réduire la tension dans le corps de la souris.
- Pour vérifier les fuites, maintenez la souris pendant quelques secondes après le retrait de l’aiguille laisser le temps pour le site d’injection fermer et observer toute fuite ou gonflement au site d’injection, à quel point la souris ne doit pas être utilisée dans l’analyse.
Remarque : Gonflement de la peau au point d’injection indique une injection intrapéritonéale a échoué, avec la quelle en sous-cutané. - Placez la souris sur du papier absorbant et laisser la souris de franchir une étape. Si la souris est immobile pendant 5 s, puis appuyez légèrement sur la queue.
- Soulevez la souris et vérifier l’étanchéité du caecum lisier au site d’injection. S’il y a une fuite, exclure la souris de l’analyse et euthanasier la souris.
4. souris surveillance
- Surveiller les souris régulièrement pour vérifier leur permettant d’arriver à un point de terminaison sans cruauté.
- Observer les souris postchallenge 2 h pour des complications liées à l’injection.
- Contrôler la souris 12 h postchallenge morbidité liée à la septicémie et l’identification des souris, à un point de terminaison sans cruauté (voir étapes 4.2 et 4.3 pour les critères).
- Par la suite surveiller toutes les 4-6 h pour les 2 premiers jours, sauf pour les 8 h pendant la nuit, quand les souris néonatales sont sans surveillance.
- Au-delà de 2 jours postchallenge, surveiller 1 x x-2 par jour. Si malade souris ou souris dont le score santé diminue sont observés, puis augmentez la fréquence des contrôles à tous les 4-6 h.
- Surveillance de souris néonatales
- Pour toute procédure impliquant des souris néonatales, transfert de la matière à une nouvelle cage de literie comme indiqué au point 3.1 (pour les mêmes raisons comme mentionné il). Vérifiez soigneusement les nouveau-nés qui sont déplacées du nid tout en soins infirmiers. Les souris qui sont traînés hors de la litière, tandis que les infirmières ne sauraient être injecté souris.
- Lorsque vous retirez le haut du nid, identifier toute dispersion des souris néonatales soit loin du nid ou coincé dans le matériaux de nidification, mais loin de leur portée, à l’exception de la souris a éloigné la litière tout en soins infirmiers. Se référer au point de terminaison sans cruauté critères à l’étape 4.5 si une souris est trouvée dispersées.
- Mesurer les réflexes de redressement des souris et la mobilité.
- Sur une serviette en papier, placez la souris sur le dos et surveiller pour sa capacité à droite elle-même dans un délai maximum de 4 s. Lorsqu’il est placé sur le dos, la souris va tomber à gauche ou à droite, c'est-à-dire lorsque le nombre de s 4 commence.
Remarque : Pour être classés dans le groupe « Droits », la souris doit être en mesure d’obtenir au moins trois des quatre patte tampons sur la serviette en papier pour 1 s. Il est toujours groupé comme étant capable de droit elle-même si elle tombe.- Si la souris peut lui-même à droite, puis attendez 8 s pour déterminer son niveau de mobilité.
- Classer la souris « Droits-mobile » s’il peut lui-même à droite et explorer son environnement en prenant des mesures multiples dans une rangée.
- Classer la souris comme « Droits-léthargique » s’il peut lui-même à droite et prendre quelques précautions pour explorer son environnement. Les souris de ce groupe peuvent tomber pendant que vous prenez une étape, regarder fragiles sur leurs pieds et faire une pause entre les étapes.
- Classer la souris comme « Droits-Nonmobile » s’il peut lui-même droit mais ne se déplace pas beaucoup. Il peut encore tomber, et si elle ne prend pas des mesures au sein de 8 s, il est énuméré comme droits-Nonmobile.
- Si la souris ne pourrait pas droite elle-même, puis classer sa mobilité basée sur le mouvement de hanche observé.
Remarque : Ne pas répéter la surveillance ou augmentation de la longueur de temps que la souris passe sur le dos parce que cela pourrait affecter le système de notation et le point de terminaison sans cruauté, comme une souris qui n’ont pas directement lui-même 4 s peut parfois faire s’accorder plus de temps.- Classer la souris comme « ne parviennent pas à droite (FTR)-Mobile » si elle ne parvient pas à droite elle-même et affiche le mouvement de la hanche qui est supérieure à angle de 90° de l’horizontale. Certaines souris peuvent eux-mêmes droit si donné plus de 4 s, mais devrait toujours être qualifié de FTR, avec des scores de mobilité basées sur le mouvement de hanche.
- Classer la souris comme « FTR-léthargique » si elle ne parvient pas à droite elle-même et affiche des mouvement de hanche sous l’angle de 90° de l’horizontal.
- Classer la souris comme « FTR-Nonmobile » s’il ne parvient pas à droite elle-même et a des jambes qui secouer ou vibrent, mais aucun mouvement de hanche. Membres peuvent étendre ou rétracter mais ne pas avoir de mouvement latéral. La souris est visiblement malade et a atteint le point de terminaison sans cruauté.
- Sur une serviette en papier, placez la souris sur le dos et surveiller pour sa capacité à droite elle-même dans un délai maximum de 4 s. Lorsqu’il est placé sur le dos, la souris va tomber à gauche ou à droite, c'est-à-dire lorsque le nombre de s 4 commence.
- Répétez l’étape 4.3 de l’autre côté de la souris, enregistrement des deux côtés.
Remarque : Consultez le Fichier supplémentaire pour l’enregistrement des observations. - Déterminer si la souris est à un point de terminaison sans cruauté et exige l’euthanasie comme indiqué dans le tableau 1et en dessous.
- Classer des souris dans un redressement différent et des niveaux de mobilité basées sur les observations de suivi il est indiquées dans les étapes 4.3 et 4.4. La mobilité de la souris est mesurée pour chaque côté, et le comportement mobile est utilisé pour déterminer si la souris requiert l’euthanasie.
- Assigner une souris avec un redressement réflexes de b FTR-Nonmobile ou (b) FTR-léthargique et trouvés séparé du nid à un point de terminaison sans cruauté.
- Dans le suivi des points dans le temps au-delà de postchallenge de 20 h, classer une souris avec un réflexe de redressement de « l’échec à droite » sur les deux côtés comme étant à un point de terminaison sans cruauté, parce que les données présentées prédisent avec une grande précision, que ces souris finit par succombent à la maladie et ne sont pas récupérer.
- Souris distincts qui devront être euthanasiés, tel que déterminé à l’étape 4.5. Si la souris surveillée n’est pas considérée comme à un point de terminaison sans cruauté, placez-le dans le second nid vide dans la nouvelle cage sans le barrage et continuer avec les autres souris néonatales.
- Une fois que la litière entière a été surveillée, déplacer la moitié de la matière de nidification dans la cage avec le barrage, réformer un nid avec la pièce au milieu pour les souris néonatales.
Remarque : Un nid mal formé pourrait causer les souris à disperser et de réduire la quantité de soins disponibles que le barrage peut offrir. - Transfert des souris néonatales dans la cage avec le barrage.
- Placez la litière dans le nid en plaçant le restes de matériaux de nidification au cours de la litière et il pincer doucement autour du couvercle pour garantir le matériaux de nidification en place.
- Euthanasier les souris néonatales séparés à l’étape 4.6 selon les exigences de l’institution locale.
5. titrage du lisier caecum
- Contester les souris à la dose de défi désiré (section 3) et de surveiller les résultats (article 4).
- Observer si le résultat final se traduit par la LD désirée et si pas, répétez les sections 3 et 4 avec une nouvelle portée à une dose de provocation supérieur ou inférieur, ajustant, de 5 à 10 %.
Remarque : Des doses peuvent être semblable à la Figure 1 b mais doivent être titré dans chaque établissement et de la souche de souris. - En outre, observer si les souris atteint un critère d’évaluation humaine plus rapide ou plus lent que la cinétique attendue dans la Figure 1 bet répétez les sections 3 et 4 avec une nouvelle portée à une dose de provocation supérieur ou inférieur, ajustant, de 5 à 10 %.
Representative Results
Viabilité de caecum lisier stockée à-80 ° C peut être testée au fil du temps par dilution en série et de placage aliquotes de stock de lisier caecum sur gélose trypticase soja au sang de mouton 5 % suivie par 24 h d’incubation en aérobiose à 37 ° C. A posteriori de comptage de la teneur en unité (CFU) cultivables formatrices d’une préparation de lisier caecum n’a ne pas pour changer sur une période de 6 mois, et la viabilité n’est pas affectée par un stockage prolongé à-80 ° C (Figure 2). La souris de chaque donateur a entraîné, en moyenne, assez lisier caecum de contester les trois ou quatre portées (données non présentées).
Souris soumises au DOL 7 à lisier caecum pour induire infection polymicrobienne a commencé à atteindre le point de terminaison sans cruauté dans les 12 h de la contestation, et infection polymicrobienne a été résolue pour la plupart par postchallenge de 48 h, tel qu’observé dans une courbe de survie de Kaplan-Meier combinée de données provenant de plus de 200 souris contestées (Figure 1 a). La létalité était dépendante de la dose déclenchante administrée, avec un changement de 5 % de la dose de provocation ayant pour résultat un à peu près 15 % de différence dans les taux de survie (Figure 1 b). Le poids de corps de la souris a été mesuré à chaque visite de suivi. Perte de poids a été observée chez tous les animaux handicapés, être non discriminatoires entre souris qui a fini de survivre et ceux qui ne pas pendant les premiers 24 h postchallenge (Figure 1). Après 24h, animaux plus survivants ont commencé à regagner leur poids, tandis que tous survécu a continué à perdre du poids et s’installe à leur point de terminaison sans cruauté. Toutefois, une faible proportion des animaux qui avaient conservé leur réflexe de redressement a également continué à perdre du poids ou n’a pas de gain de poids, jusqu'à la fin de l’expérience, même perdre autant que 20 % de leur poids corporel initial dans les 40 h du défi survivants. Car il y avait un chevauchement de perte de poids entre les souris qui a fini de survivre et ceux qui n’ont pas, le changement de poids ou un seuil de perte de poids ne pourrait pas être utilisé comme critère pour point de terminaison sans cruauté tout en conservant l’objectif de diviser avec précision les survivants de survécu.
Le comportement de souris a été suivi comme indiqué dans le protocole et dans le tableau 2. Instantanés de la santé, les catégories sont affichent (Figure 3 a- C). Ces photos montrent les catégories santé différentes de souris qui a échoué à droite eux-mêmes après avoir été placé sur le dos et exposer brièvement la différence entre FTR-Mobile et FTR-léthargique, qui est une distinction importante. Chez la souris incontestée de cet âge ne s’affichent pas activité FTR-léthargique ; par conséquent, cette catégorie de la santé est un marqueur de la maladie et une réponse au défi. Malade souris affichent FTR-léthargique symptômes (Figure 3 b) et pourraient régresser vers FTR-Nonmobile (Figure 3), où le haut de la jambe reste parallèle à la jambe inférieure, avec peu ou zéro hanche bascule le mouvement, qui est l’un des critères de point de terminaison sans cruauté. Les souris pourraient aussi récupérer, gagne une mouvement de hanche et devenir FTR-Mobile (Figure 3 a). Le réflexe de redressement et les scores de mobilité ont été déterminées pour le gauche et le côté droit de chaque souris, et le score le plus élevé a été utilisé pour déterminer si la souris avait atteint un point de terminaison sans cruauté. Behavioral renseignements ont été recueillis parmi plus de 240 animaux soumises à une dose létale 60 (LD60) de lisier caecum et 144 points limites ont été observés (Figure 3D-F et tableau 1). Cette approche axée sur les éléments de preuve a été utilisée pour définir et affiner le point de terminaison sans cruauté à travers quatre étapes de la maladie, catégorisés par les expérimentateurs basées sur les différences de comportement entre les survivants et survécu et par la fraction de points limites atteint au cours de chaque période. Au cours de premières expériences, souris FTR-Nonmobile qui n’avaient aucun mouvement de hanche trouvées constamment épuisée au bout de 4 à 6 h de ce comportement observé. Dans la collection des informations présentées, un score d’intégrité FTR-Nonmobile a été utilisé comme critère pour un point de terminaison sans cruauté. De postchallenge 12-21 h, tandis que les souris FTR-Nonmobile ont été euthanasiés, éteintes et survivants animaux affichent des comportements très similaires et ne pouvaient être distingués de toute autre manière (Figure 3D). Postchallenge 21-48 h, la majorité des survivants de souris retrouvé leur réflexe de redressement, tandis que moins de 1 % des comportements FTR observés chez les animaux qui iraient à survivre à l’expérience (Figure 3E). Ainsi, les souris qui n’ont pas eux-mêmes à droite des deux côtés est devenu un critère supplémentaire pour le point de terminaison sans cruauté pendant cette période. Entre 12 et 20 h postchallenge, 12,5 % du nombre total de points limites ont été observés, contre 80,5 % entre 20 et 48 h et 7 % après 48 h (tableau 1). Des traits distinctifs entre souris qui a fini qui survivent et qui finalement s’est aggravée à un point de terminaison sans cruauté a été la perte du réflexe de redressement, indépendant de la mobilité de hanche (Figure 3F). En effet, entre 20 et 48 h après le défi, un total de 121 souris n’ont pas eux-mêmes à droite des deux côtés, avec 116 de ces souris progresse finalement à un point de terminaison sans cruauté (ce qui représente un 96 % de précision dans l’identification des souris qui ne récupérerait pas). Au-delà de 48 h après le défi, 11 souris ont été observés à l’échec à droite eux-mêmes des deux côtés et 10 de ces ont progressé à un point de terminaison sans cruauté (une précision de 91 %). Au-delà de 20 h après le défi, le nombre de souris qui a perdu le réflexe de redressement pour les deux parties a prédit le résultat final avec une précision de plus de 90 % ; par conséquent, ceci a été ajouté aux critères de point de terminaison sans cruauté, pour identifier plus tôt les souris nonrecovering et réduire les souris souffrant (tableau 1).
La fréquence que les souris ont besoin de surveillance change au fil du temps, en raison des différents taux de postchallenge de la mort et est décrit dans le tableau 1. Une souris était censée être à son point de terminaison sans cruauté à tout moment si elle n’avait pas droit lui-même et indiqués non mobile mouvement de hanche des deux côtés, ou si la souris a été trouvée dispersés du nid, n’a pas pu lui-même à droite et mouvement de hanche léthargique. Souris avec l’autre de ces conditions ne s’attendait pas à pouvoir rejoindre la litière et ont été observés à FTR-Nonmobile au sein de 4 à 6 h. à partir de 20 h après le défi, un nouveau point de terminaison sans cruauté a été ajouté parce que les informations présentées montrent que la vaste majorité des souris qui FTR des deux côtés finit par succomber à la maladie.
Les vidéos, les tables et les ressources présentés dans ce manuscrit sont une ressource pédagogique efficace pour l’affectation correcte comportementale de souris contestées. Sept expérimentateurs ont été invités à regarder la vidéo de formation et de lire le protocole et les tableaux avant d’assigner des comportements à 60 animaux contestée. L’identification de la cession de point de terminaison sans cruauté était exacte tant pour distinctif FTR-Nonmobile souris de la souris qui affiche les autres comportements (Figure 4 a) et des souris FTR des souris qui ont pu eux-mêmes droit dans le délai autorisé ( Figure 4 b).
Figure 1 : Courbe de survie Kaplan-Meier, titration de dose de lisier caecum et le changement de poids après le défi de lisier caecal. (A) résultat de la survie de souris C57BL/6J néonatales avec une injection intrapéritonéale de lisier caecum à 7 DOL. Les données pour cette figure ont été combinées d’expériences indépendantes à l’aide de multiples défi doses, de 0,7 à 1,3 mg de lisier caecum par gramme de poids corporel a été administrés à ces souris. (B) souris néonatales soumises à 0,80 à 0,95 mg de lisier caecum par gramme de poids corporel d’une préparation de lisier caecum affichent une relation dose-dépendante entre la quantité de boue caecum étant donné et le pourcentage de survie. ()C) la variation en pourcentage du poids par rapport au poids de défi, avec la ligne pointillée indiquant une perte de 20 % du poids de l’époque de la contestation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Concentration d’UFC en stock caecum lisier stocké à-80 ° C ne change pas pendant une période de 6 mois. L’effet de l’âge du caecum de boue sur la concentration de l’UFC a été testé à l’aide de la régression linéaire. Chaque point représente une aliquote de la préparation de lisier caecal, en série, dilué et plaqué sur une période de 6 mois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Catégories de mobilité des souris qui ne parviennent pas à droite eux-mêmes et des comportements animaux à divers temps postchallenge de la hanche. Souris qui ont été contestées avec septicémie, lorsqu’il est placé sur le dos, affiche des signes de morbidité qui peut être mesurée par le degré de mouvement de hanche. (A) A fail à droite (FTR)-souris Mobile montre hip mouvement de balancement de leur patte supérieure à angle de 90 ° de l’horizontale. (B) An FTR-léthargique spectacles hip bascule le mouvement de la souris mais ne dépasse pas l’angle de 90 ° de l’horizontal à tout moment au cours de la 4 s de surveillance. (C) certains FTR-Nonmobile souris seront étendra leur jambe, flexion au niveau du genou, mais montrent très peu (moins que les angles de 10 °) à zéro à bascule mouvement et les jambes des hanches restent parallèle entre eux. Postchallenge de 12 à 21 h (D) les comportements animaux montrent que seuls les comportements FTR-Nonmobile séparent survivants de survécu. (E) du 21 au postchallenge de 48 h, seulement 4 sur les comportements FTR observées 592 (0,67 %) appartiennent aux survivants, ce qui permet le redressement réflexe pour prédire le résultat final et être utilisée comme un critère nouveau point de terminaison sans cruauté. (F) au-delà de 48 h après l’infection, les souris de 6 sur 131 (4,55 %) qui avaient un réflexe de redressement sont devenue partie du groupe FTR et ont été sacrifiés par la fin de l’expérience, justifiant une surveillance soutenue tout au long de la récupération. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Ressources pédagogiques entraînent une classification comportementale précise par les expérimentateurs indépendants. Expérimentateurs formés en regardant la vidéo qui accompagne le présent protocole classés en vidéos de 60 souris néonatales en groupes différents santé. (A) la capacité de distinguer un point de terminaison sans cruauté a été déterminée et une moyenne de 97 % des comportements a été correctement classée comme FTR-Nonmobile ou non, tandis que seulement 1 % des souris FTR-Nonmobile ont été identifiés. Deux pour cent des souris ont été faussement identifiés comme FTR-Nonmobile. (B) l’identification du point de terminaison sans cruauté deuxième critérium de distinguer correctement les souris FTR ou celles ayant la capacité de droite eux-mêmes au sein de 4 s d’être placés sur le dos a été correctement assignés dans 97 % des arrangements, alors que seulement 0,96 % des souris ont été incorrectement assignés comme se redresser et 2 % des souris ont été incorrectement assignés comme FTR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Stade de la maladie | A: une morbidité élevée, aucun cas de mortalité | B: forte morbidité, mortalité faible | C: forte morbidité, mortalité élevée | D: faible morbidité, faible mortalité |
| Heures après défi | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Fréquence des contrôles | défi post 2 h | chaque h 4−6 | Chaque 4−6 h, 8 h, du jour au lendemain sans surveillance | 1−2 fois par jour, plus si nécessaire |
| Proportion du totales points limites observées | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Pourcentage de points limites observées | 0 % | 12,5 % | 80,5 % | 7 % |
| Critères de point de terminaison sans cruauté | 1. FTR−Nonmobile des deux côtés | 1. FTR−Nonmobile des deux côtés | ||
| 2. dispersés du nid et est FTR−Lethargic | 2. dispersés du nid et est FTR−Lethargic | |||
| 3. FTR à gauche ou à droite (avec un score de mobilité) | ||||
Tableau 1 : fréquence des critères de point de terminaison de surveillance et humain aux différents stades de la maladie. Fréquence de surveillance, points limites observées, le pourcentage des points limites et des critères de point de terminaison sans cruauté au cours des différents stades de la maladie.
| Réflexe de redressement | Mobilité | Délai à droite après avoir été placé sur le dos | Date limite de mesure de quantité de mouvement (mobile / léthargique / non mobile) | Critères de notation de mobilité |
| Droits | Mobile | 4 s | Une supplémentaire 8 s | La souris prend plusieurs étapes d’affilée, soutenir l’élan vers l’avant et explore son environnement. Chiot ne tombera pas. |
| Léthargique | La souris peut prendre mais sera arrêter et faire une pause avant de prendre une autre. Chiot peut tomber. | |||
| Nonmobile | La souris ne prend pas des mesures après redressement lui-même. Chiot peut tomber. | |||
| Ne parviennent pas à droite | Hanches mobiles | Les 4 mêmes s utilisé pour mesurer le réflexe de redressement | A énergique mouvement de hanche avec la cuisse faisant tourner au-delà de 90° de l’horizontal au moins une fois tous les 4 s. | |
| Hanches léthargiques | Mouvement de hanche jusqu'à mais pas au-delà de 90° de l’horizontale. | |||
| Hanches non mobiles | Membres peuvent se déplacer en étendant et en rétractant mais les hanches ne tournera pas. Chiot semble très malade. |
Tableau 2 : suivi de tableau et les critères de calcul de la note de santé des souris. Les critères fournis ont été utilisées pour définir des groupes de catégories de santé à des souris et de réduire la variance individuelle dans l’attribution de scores d’intégrité.
Discussion
Postnatals souris néonatales ont très limité de mobilité et ne parviennent pas à eux-mêmes droit après avoir été placé sur le dos, même quand incontesté. Par DOL 7, l’âge de la souris dans ce modèle, une gamme de mouvement qui s’étend de droits-Mobile à FTR-Mobile a été observée chez les souris non contestés, avec une différence importante, à savoir qu’une souris incontestée à cet âge ne manifestaient pas de comportement léthargique-FTR. Seule souris présentant une infection polymicrobienne ont été observés à devenir FTR-léthargique ; par conséquent, cette réponse peut être un marqueur de gravité de la maladie. Être attentif à la coupure d’un angle de 90° de l’horizontal pour mouvement de hanche permet l’affectation cohérente et précise du mouvement de hanche léthargique ou mobile chez la souris. Le délai de 4 s pour voir si une souris peut droite elle-même a été choisi car souris incontestés ont pu eux-mêmes droit systématiquement dans ce laps de temps. Répété de mesure de la même souris a été évitée, alors que le temps à droite eux-mêmes et la mesure de la mobilité de hanche a été limitée à 4 s, pour éviter de trop fatiguer la souris, ce qui pourrait autrement affecter sa capacité à obtenir des aliments et la chaleur et pourraient affecter sa pronostic à aller mieux. Lui-même de redressement de la gauche et de droite ont été observés, et le plus élevé des scores a été utilisé pour déterminer si la souris a été à un point de terminaison sans cruauté, parce que certaines souris ont été trouvés pour afficher FTR-Nonmobile sur un côté encore une plus grande mobilité sur l’autre côté et b e en mesure de récupérer par la suite.
Le système de notation utilisé pour évaluer la santé de la souris s’est appuyé sur l’application des seuils de catégoriques à ce qui est une gamme de mouvement et sera donc sujets aux préjugés individuels. Le personnel a été formé ensemble pour s’assurer que chaque personne a marqué les souris identiques ; Cependant, il restera probablement un niveau de subjectivité conduisant à des variations. La cohérence de la notation a été évaluée par la présence de sept chercheurs qui n’avaient pas précédemment effectué le suivi de souris néonatale apprendre aux exigences énoncées dans le présent protocole et de la vidéo, puis, indépendamment attribuer des comportements et déterminer sans cruauté point de terminaison. Une précision de 97 % a été observée avec la notation effectuée sur 60 souris contestées, ce qui suggère que la partialité individuelle ne joue pas un rôle substantiel dans les affectations comportementales de ce modèle. Le protocole de surveillance comportemental présenté repose sur l’observation d’animaux a contesté sur 7 DOL, pourtant souris âgés de moins de 6 jours dans un état sain non contesté ne peut pas systématiquement droit eux-mêmes. Ainsi, les critères du point de terminaison sans cruauté décrits ne pourraient pas être appliqués directement sur souris plus jeunes. Si les souris plus jeunes sont utilisés dans ce modèle expérimental, ou si un modèle différent de défi avec des cinétiques différentes maladies est appliqué, puis critères de point de terminaison approprié sans cruauté doivent être développés et mis à l’essai pour éviter l’euthanasie des souris qui auraient sinon, éventuellement, récupérer. Le système de notation affiche une méthode robuste d’améliorer le classement de point de terminaison sans cruauté qui, de dépistage et de confirmation, pourrait potentiellement s’appliquer à d’autres modèles.
Chaque préparation de lisier caecum ou l’utilisation d’une nouvelle souche de souris requis la retitration de la dose de lisier caecum à administrer pour atteindre une dose létale similaire. Chaque préparation a été standardisée par la lecture d’intérêt, soit de survie, plutôt que de donner la même teneur en bactéries. Concentration de bactéries viables de chaque préparation boue caecum varie légèrement, potentiellement en raison des différences dans les bactéries commensales du donateur ou en raison des variations dans le poids à gauche dans la crépine de la cellule de la postfiltration stock de lisier caecale. Pendant le titrage du lisier caecal, les deux premières portées ont été divisées en deux groupes, et chaque moitié de la portée ont été contestés avec l’une des deux doses afin que chacune des doses serait testé dans deux portées. Si le taux de survie qui en résulte ne correspondait pas au niveau requis, puis la dose déclenchante a été augmentée ou diminuée de 5 à 10 % et l’expérience répétée. Plusieurs portées ont été utilisées pour tenir compte des différences de litière à la litière qui provoquent une résistance ou une sensibilité accrue aux septicémie à travers une litière. Il était important d’avec précision le titre le stock de lisier caecum avec chaque nouvelle préparation pour s’assurer que le nouveau titrage du caecum lisier était comparable aux précédentes préparations caecum de lisier. Périodes d’excès bruit et vibrations, particulièrement pendant le compactage de l’asphalte et la construction d’un immeuble voisin et de la route, ont été observés à augmenter le stress chez les mères. Cette corrélation avec les taux accrus de cannibalisation et affecté le taux de mortalité des expériences de survie, touchant même les souris incontestés, indiquant qu’il peut y avoir des répercussions étrangères sur la survie néonatale qui doivent aussi être contrôlés pour.
Méthodes antérieures pour préparation de lisier caecum versé l’utilisation du lisier caecum fraîche ou la préparation de boue de caecum congelé, à l’aide de diverses méthodes, y compris le stockage en glycérol qui serait inévitablement transférée pendant le défi. Bien que l’utilisation du lisier caecum frais offre l’avantage d’avoir une composition bactérienne plus proche de l’original contenu cæcal, il y a le risque de variation entre la souris donneuse en raison de la variation de bactéries commensales. Tandis que ceci a été minimisé en utilisant caecum donateurs auprès du même fournisseur avec un minimum de temps entre l’arrivée et la progression de l’expérience, cela pourrait devenir une option coût prohibitif pour certains laboratoires et présenté un autre défi logistique de chronométrage en ayant souris même âge disponibles lorsque commençant une boue caecum experiment en souris néonatales qui étaient vieux de 7 jours. Une méthode alternative à l’utilisation de lisier caecum frais a été utilisée, où contenu cæcal multiples donateurs adultes ont été regroupées, resuspendu dans D5W, congelés à-80 ° C sans glycérol et décongelé une aliquote à la fois pour des expériences. L’utilisation du lisier caecum de donneurs adultes pour étudier la septicémie néonatale pourrait potentiellement transférer des espèces de bactéries présentes dans la boue caecum qui la souris néonatale n’a pas été exposée à, mais c’est une stratégie qui permet l’étude de septicémie chez les souris néonatales et a été utilisée pour étudier la biologie de souris néonatales dans les dernières13,14,15. Caecum lisier a été dilué dans D5W pour lui fournir des éléments nutritifs pour les bactéries, ce qui a permis la mise en place d’une infection active une fois que les bactéries ont été injectés et a été fait pour imiter la disponibilité des nutriments dans la cavité péritonéale pendant nécrosante entérocolite nécrosante. Glycérol n’a pas été incluse comme agent stabilisant dans la congélation des bactéries en raison d’effets secondaires négatifs potentiels qui pourraient découler d’injection de glycérol seule. Si glycérol avait été inclus dans la préparation de lisier caecal, alors les dommages potentiels que le glycérol seul pouvait induire sera nécessaire doit être testée en incluant un glycérol seule (manque caecum lisier) injection chez la souris, ce qui aurait augmenté de souris utilisation. La viabilité des bactéries des stocks caecum lisier a été testée après congélation le stock de lisier caecum sans glycérol et s’est avérée constant, sans variation de la concentration de bactéries en aliquotes distinctes de la même préparation caecum lisier stockée à-80 ° C sur un 6 période du mois. Ceci suggère que le stockage sans glycérol est faisable en fournissant un résultat biologique cohérent. L’utilisation d’un vrac préparés congelés stock caecum de boue a également permis pour l’utilisation de souris race interne, réduisant le coût et en utilisant des souris mâles qui seraient autrement excès de l’élevage, donc réduisant le gaspillage de la souris.
L’identification des défis ayant échouées chez la souris a été importante d’éviter d’ajouter du bruit supplémentaire au système. Après avoir subi une injection intrapéritonéale de lisier caecal, les souris ont été observées pour la présence d’un renflement sous la peau, ce qui indiquait une injection défaillante qui a été effectivement sous-cutanée. Souris ont été observées des fuites au point d’injection, aussi bien immédiatement après le retrait de l’aiguille et après ce qui leur permet de franchir une étape après l’injection, parce que les souris seraient parfois (rarement) fuite seulement après le déplacement de la branche du site d’injection en prenant une étape. La présence d’un renflement ou une fuite suite à l’injection a entraîné en supprimant la souris de l’analyse. Après tout, aucun des deux pourrait entraîner un résultat différent en raison de la quantité incorrecte de caecum coulis injecté car une différence de 5 % de la dose déclenchante a été observée à affecter la survie ultérieure.
Défi de lisier caecum expérimente souvent requis variable cible des doses létales avec diverses doses ajustées au poids. Pour cette raison, volumes d’injection peuvent varier à partir d’aussi peu que 20 µL et jusqu'à 100 µL. L’erreur expérimentale proportionnée associé avec aiguille mort volume change également ainsi que le volume d’injection, plus difficile pour comparer directement les différentes doses. Avec la modification simple de normaliser le volume d’injection, cette source de variance est enlevée de l’expérience.
Système de surveillance comportementale de la souris néonatales utilisé dans le présent protocole est le premier de son genre. Intention de chercheurs effectuant des recherches éthiques avec les souris nouveau-nées sont souvent confrontés à la difficile manque de ressources pour évaluer le bien-être de l’animal à cet âge. Le système de contrôle intuitif et cohérent présenté commence à combler cette lacune. Ce qui est important, cette approche axée sur les éléments de preuve non seulement augmente la qualité des données expérimentales obtenues mais, en même temps, permet également de réduire la souffrance des animaux de laboratoire.
Disclosures
Dr James Wynn bénéficie du soutien de la National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Sciences médicales générales (R01GM128452) et le NIH /Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) () R01HD089939).
Acknowledgments
Merci à Claire Harrison et l’Animal Care Facility à du British Columbia Children Hospital Research Institute (BCCHR) pour leur soutien aux travaux animale, ainsi qu’au Dr Po-Yan Cheng pour leurs conseils et de se prononcer sur la surveillance animale et le bien-être.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
