Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58652
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Locus coeruleus nöronlar fizyolojik süreçleri çeşitli ilgili küçük bir kümesidir. Burada, biz fare beyin bölümleri çalışmalar proteinler ve bu çekirdek metal analizleri hazırlamak için bir protokol tanımlamak.

Abstract

Locus coeruleus (LC) fizyolojik fonksiyonları bir dizi modüle nöronlar üreten norepinefrin önemli bir merkezidir. LC yapısal veya fonksiyonel anormallikleri korteks, Hipokampus ve beyincik de dahil olmak üzere çeşitli beyin bölgeleri etkileyen ve depresyon, bipolar bozukluk, anksiyete, hem de Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı için katkıda bulunabilir. Bu bozuklukların genellikle metal dengesizliğe ile ilişkili, ama metaller LC rolü yalnızca kısmen anlaşılmaktadır. Akkreditivin morfolojik ve fonksiyonel çalışmalar insan patolojiler ve metaller katkısını daha iyi anlamak için ihtiyaç vardır. Fareler yaygın olarak kullanılan bir deneysel model, ancak fare LC küçük (~0.3 mm çap) ve sigara bir uzman için tanımlamak zor. Burada, biz fare beynindeki LC yerelleştirmek için adım adım bir immünhistokimya tabanlı protokol tanımlamak. Dopamin-β-hidroksilaz (DBH) ve alternatif olarak, tirozin hidroksilaz (TH), son derece LC ifade edilen her iki enzim immunohistokimyasal işaretleyicilerini beyin dilimler olarak kullanılır. LC içeren bölümler için bitişik bölümleri Histoloji morfolojik araştırmalar, metabolik test, hem de metal görüntüleme için de dahil olmak üzere daha fazla analiz, x-ışını Floresans mikroskobu (XFM) tarafından kullanılabilir.

Introduction

Locus coeruleus (LC) beyin sapı ve norepinefrin (NE) üretim1büyük bir sitenin önemli bir ülkedir. LC korteks, Hipokampus ve beyincik3 projeksiyonlar beyin2 boyunca gönderir ve sirkadiyen ritim4,5, dikkat ve bellek6dahil olmak üzere önemli fizyolojik süreçleri düzenler, 7, Bilişsel süreçler8ve duygu9,10stres. Disfonksiyon Akkreditivin Parkinson hastalığı12,13,14, Alzheimer hastalığı14, depresyon15 de dahil olmak üzere nörolojik ve nöropsikiyatrik bozukluklar11' de karıştığı olmuştur ,16,17, bipolar bozukluk18,19ve anksiyete20,21,22,23, 24. bu roller göz önüne alındığında, LC analizleri kendi işlev ve disfonksiyon eğitim için çok önemlidir.

Fareler fizyolojik ve Etyopatogenezi süreçleri çalışmaları için yaygın olarak kullanılır. Kendi küçük boyutu nedeniyle fareyi LC ~ 300 mikron, yapısı bulma zorluk için önde gelen bir ortalama çapındadır. Beyin kesit sırasında LC kolayca koronal veya sagittal bölümlerindeki özledim. Mevcut çalışmalar LC tanımlaması hayvanlarda açıklayan adım adım bir protokol sağlamıyorsa olmayan bir uzman1,25takip edebilirsiniz. Böylece, LC lokalizasyonu için rehberlik sunmak, biz çeşitli uygulamalar (şekil 1, Şekil 2, şekil 3) için fare beynindeki bu bölgeyi bulmak için geliştirdiğimiz bir protokol tanımlamak. Protokol dikkatle incelenmiş beyin kesit ve immunohistokimyasal olarak algılanmasını DBH26,27, ya da alternatif olarak TH24, son derece içinde LC28zenginleştirilmiş her iki enzim geçerlidir. LC immünhistokimya tarafından bulunan sonra bitişik beyin dilimleri için daha fazla çalışmalar, morfolojik ve metabolik analizleri, aynı zamanda x-ışını Floresans mikroskobu (XFM)29ile metal görüntüleme çalışmaları da dahil olmak üzere kullanılabilir. Bir örnek olarak bu Protokolü (şekil 3) XFM açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çalışmalar hayvanların Johns Hopkins Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı (ACUC) iletişim kuralı numarası M017M385 tarafından onaylanmış.

1. beyin Dilimleme

  1. Hareketsiz için % 3 isoflurane uygulama tarafından fareler anestezi.
    1. Bir pamuk topağı isoflurane damlaları ile ıslatın ve bir 15 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Hayvanın burun tüp içine yerleştirin ve isoflurane nefes sağlar. Anestezi derinliği için yanıt-e doğru ayak parmağı-çimdik eksikliği tarafından kontrol.
  2. Hayvan sırtında yerleştirin ve yoluyla onun kol ve bacaklar bir T iğne ile onun karın erişimine süre hareketsiz.
  3. Ekran alıntısını karın deriden yaparak hayvan Cerrahi makas ile kesme ve göğüs bölgesinde deri yoluyla kesti. Cilt T iğne kullanarak pin. Peritoneal membran Toraks kadar çiğnemek. Kalp, göğüs boşluğuna çatlama ve diyafram kesme maruz.
  4. Kan hayvan dışarı akışını sağlamak için sağ atrium kesti. Bir 10 mL şırınga ile 25'lik iğne sol ventrikül yerleştirin ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 10 mL sıvı.
    Not: Bu çözüm sistemik dolaşım ve çıkış akış sağlar Sağ atrium sayesinde.
  5. 10 mL şırınga çıkarıp 60 mL şırınga bağlı 25 lik bir iğne yerleştirin. Buz soğuk %4 paraformaldehyde (PFA) 50 mL ile sol ventrikül arasında sıvı.
    1. % 10 PFA H2O çözümde sulandrarak ve nihai % 4 İngiltere'de yılın çözüm 4 ° C'de soğuk buz soğuk % 4 İngiltere'de yılın çözüm hazırlayın
  6. Fare başkanı yalıtmak ve beyin kafatasından kaldırın.
    1. Boynuna deriden kesilmiş ve kafatası ortaya çıkarmak için gözleri doğru kesti. Kafatası burnuna boyun ve o zaman diğer bir gözü çatlamak. Kafatası dışarı kabuğu ve tüm beyin tüketim.
  7. %4 beyinde kuluçkaya PFA 4 ° C'de 24 h için
  8. Beyin Forseps ile 25 mL % 30 Sükroz çözeltisi ile dolu bir 50 mL konik tüp içine aktarın. Beyin tüp altına batar kadar 48-72 saat için 4 ° C'de sakla.
  9. Bir yetişkin fare beyin dilimleyici ile beyin matris koronal orta (bregma in ~ 3 mm arka) aracılığıyla kesilmiş. Beyin içeren beyin bölümü tutma.
    Not: Bu iki beyin bölümde-korteks (kesme anterior) ve bir beyin sapı/beyincik (kesme arka) içeren bir içeren çoğu neden olur. Beyin sapı bölümü için aşağıdaki adımları kullanın.
  10. En uygun kesme sıcaklığı ile bileşik (Ekim); çevrili bir gömme kalıp altına yerleştirilir kesme yüzeyi ile beyin sapı bölüm katıştırma Katıştırılmış beyin-80 ° C dondurucu taşımak ve en az 12 h için-daha fazla kullanılmasını kadar dondurma.
  11. Cryostat kesme: gömme kalıp beyin Ekim cryostat; içeren yer cryostat cryostat olan için beyin blok sıcaklığını ayarlamak birkaç saat içinde kuluçkaya.
  12. Beyin içeren OCT blok duyurmak için gömme kalıp peel Away.
  13. Tıraş bıçağı, Ekim aşırı beyin dokunmadan blok yüzeyinden kaldırmak için kullanın.
  14. OCT blok beyin önüne doğru kesme yüzeyinin açığa cryostat, chuck bağlama.
  15. Beyin kesilmiş yüzeyine paralel olarak cryostat razorblades yönelik şekilde ayarlayın.
  16. Rostrally 100 µm bölümleri kesme medulla başlayan beyin kırpın.
  17. Serebellum ve beyin sapı sürekli bir dilim kesmek kadar rostrally kırpın. Dilimler, 50 µm kalınlık toplama başlar.
    Not: bir rostrally medulla kırpar gibi beyin ve beyincik iki ayrı bölümde kesecek. Rostral bölümlerde, beyin ve beyincik sonunda 4th ventrikül düzeyinde birleştirir. 4th ventrikül lateral kenarlarına doğru biçimli olduğunda, sonra serebellum ve beyin sapı bir sürekli dilim ortaya çıkar.
    1. Forseps ile OCT çevrili beyin dilim toplamak ve bir de PBS (şekil 2a) ile dolu bir 24-şey plaka yerleştirebilirsiniz. Serebellum ve aşağı olacaklar ~-5.52 mm bregma (Şekil 1b) posterior tanılmaktadır LC en önemli olacaktır.
      Not: bir kez beyincik tam kesitli ve artık ~-5.34 mm bregma (şekil 1 c) posterior, aşağı olacaklar çevreleyen LC en ön bölümü kaybolacaktır.

2. immünhistokimya dopamin β-hidroksilaz veya tirozin hidroksilaz (Şekil 2) için

  1. Gün 1
    1. Seçili dilimleri 5 min için üç kez PBS içinde yıkayın.
    2. Deterjan (PBSD) 4 ° C'de % 0.5 tamponlanmış fosfat serum içinde 24 h için permeabilize
      1. 125 µL deterjan PBS 25 ml seyreltik.
  2. 2. gün
    1. Dilimleri 5 min için üç kez yıkamak %0,5 PBSD.
    2. 1:500 %0,5 seyreltme birincil antikor, anti-DBH veya anti-TH 18 h için ekleyin PBSD 4 ° C'de
  3. 3. gün
    1. Dilimleri 10 min için üç kez yıkamak %0,5 PBSD.
    2. 1: 1000 %0,5 seyreltme istediğiniz ikincil antikor (488 eşek Anti-tavşan yeşil floresan için) eklemek için 16 h PBSD.
    3. Alüminyum ve yer 4 ° C'de 24 iyi plaka şal
    4. Dilimleri 5 min için üç kez yıkamak %0,5 PBSD.
    5. 5 dakika içinde PBS için yıkama.
    6. Dilimleri bir kalem fırça ile bir su kabı aktarın.
    7. Şarj edilmiş slaytlarda suda yüzen dilimleri bağlayın.
    8. Coverslip bölümleri hard-set montaj medya (olmadan DAPI) ile.
    9. Oda sıcaklığında 30 dk için bağlı beyin bölümleri kuru.
    10. Görüntü ayarları uygun ikincil antikor fluorophore dalga boyu sinyalini tespit etmek için confocal veya floresan mikroskop, beyin dilimleri.
    11. Mikroskop için beyin dilim odak düzlemi ayarlamak ve 10 X büyütme tek bir görüntü alır.
    12. Olası bir LC bölgenin beyin dilimi bulmak için kullandığı yöndür 4th ventrikül kullanın; beyincik ventrikül yer alır, pons ve beyin sapı30altında bulunur.
    13. LC bulmak için 4th ventrikül lateral kenarlarında odak; 4th ventrikül ve pons doğru puan kenarlarını LC kaynaklandığı / beyin bölgesi (şekil 2b, 2 c).
    14. Aşağıdaki görüntüleme ve yerelleştirme belirli beyin dilimleri içinde Akkreditivin depolamak 4 ° C'de beyin dilimler içeren slayt

3. beyin dilimleri içinde LC tespiti

  1. LC içeren beyin bölümü bulun, yukarıda açıklandığı gibi fare beyin dilim ve PBS bölümlerde toplamak için 24 iyi yemekler, şekil 2agösterildiği gibi dolu.
    1. Bir beyin bölümü LC uygun yerelleştirme için izin vermek için iyi başına yerleştirin.
  2. İmmunostained beyin başına olacak 48 beyin dilimleri toplam toplamak.
    Not: Tüm kuyu şekil 2a gösterildiği iki tabak beyin dilimleri bir hayvan içerir.
  3. Immunostain her üçüncü beşinci dilim DBH veya TH. Tercihen, immünhistokimya denetlesinler o bitişik olan bu beyin dilimleri gerçekleştirmek (yolu ile x-ışını Floresans mikroskobu, XFM) daha fazla.
    Not: Bu yordam son tahlil dilimleri içinde Akkreditivin tam yerelleştirme için izin verir (şekil 2a; sayılar kuyular arasında taşır).
  4. Merkezi ve LC veya kaba bir yaklaşım kenarı tam konumunu ihtiyaçları olup olmadığını immunostained örneğin, uygulamaya bağlı olan beyin dilim sayısını ayarlayın.
  5. İmmünhistokimya, her iki ifade 4th ventrikül (şekil 2b, 2 c) karakteristik bir desen ile LC içeren beyin dilimleri tespit. Büyütme ardışık beyin dilimleri LC DBH sinyal şekil 2B, 2eiçinde gösterilir; TH gösterildiği için bu lekeli LC büyütülmüş görüntü şekil 2f.
  6. Daha fazla çalışmalar - içeren bu LC bitişik bölümleri XFM için metal düzeyleri (şekil 3) ölçmek için bu durumda kullanın.
  7. XFM gerçekleştirmek için 10-30 µm (Kurulum) bağlı olarak ince koronal beyin dilimleri ile hangi onlar örnek tutucular monte edilebilir ve sinkrotron yansıma ince polimer film toplamak.
  8. Mağaza beyin dilimleri üzerinde hazırlanan polimer film XFM için oda sıcaklığında ince ve XFM gerçekleştirmek.

4. LC XFM üzerinden metal görüntüleme

  1. Yukarıda açıklandığı gibi örnek fare beyin dilim, LC belirlemek ve metal düzeylerinden LC içeren bu beyin dilimler XFM üzerinden ölçmek.
  2. Görüntü beamline 2-ID-E gelişmiş foton kaynak (Argonne Ulusal Laboratuvarı, Argonne Il), elemental dağıtımlarında.
  3. Kaydetmek veri 'anında'31daha önce açıklandığı gibi.
  4. Beyin dilimleri kullanarak program haritalar32,33LC içeren Elemental konsantrasyonlarda belirlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Değişiklikleri (örneğin, Cu, Fe, Zn ve Mn) metal homeostazı kez LC34,35değişiklikler dahil olmak üzere nörolojik hastalıklarda gözlenir. Böylece, beyindeki metal düzeylerini belirleme hastalığı mekanizmaları anlamak için gereklidir. Açıklanan protokolü kullanılarak oluşturulan beyin bölümleri LC diğer metaller ve Cu seviyesini ölçmek ve onları LC dışındaki bölgelerde düzeylere karşılaştırmak için kullanılabilir. (Şekil 3). Bizim örnekte, LC, fosfat, potasyum, kesilmiş beyin dilim klorür ve bakır ölçülür. Sadece bakır özellikle içinde LC yükselmiş. Daha yüksek çözünürlük XFM görüntüleme (burada gösterilmeyen) da hücre altı dağıtım metal düzeylerinin tespiti için gerçekleştirilebilir. Daha fazla mümkün Bu protokol bolluk ve hücre içi dağıtım DBH (şekil 2b2d, 2e), TH (Şekil 2 c, 2f) ve diğer proteinlerin LC içinde ayrı ayrı ya da algılama uygulamaları deneyleri, LC morfoloji ve nöronal yoğunluk co boyama.

Figure 1
Şekil 1: LC fare beyin içinde lokalizasyonu. (bir) LC yerelleştirmek için kesitli beyin bölgesinin gösteren şematik. serebellum ve inferior olacaklar (bregma,-5.52 mm arka) tanılmaktadır (b) dayalı Paxinos ve Franklin beyin atlas30, LC en önemli olacaktır. Sol görüntü sağ görüntü LC Nisl boyama yoluyla 4th ventrikül lateral kenarlarında yerelleştirilmesini gösterir LC kesip bir koronal bölümü göstermektedir. bir kez beyincik tam kesitli ve artık aşağı olacaklar (bregma,-5.34 mm arka) çevreleyen LC (c) en ön bölümü kaybolacaktır. Doğru görüntü üzerinde boyama Nisl LC sadece marjinal koronal bu dilimi mevcut olduğunu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: LC immunostaining beyin tarafından algılanmasını dilimler DBH veya TH. için (bir) bir fare beyin beyin sapı etrafında 50 μm kalınlığında dilimler halinde kesitli ve iki 24 iyi yemekleri toplanan. Her 5th 8inci toplanan beyin dilim için film kaplı coverslip XFM üzerinden görüntüleme için monte edilmiştir. Bu dilimler kuyular arasında mavi sayılarla etiketlenir. Bitişik dilimler PBS içinde yüzen DBH LC (Kızıl Haç wells üzerinde etiketlenir) tespit etmek için immunostained olduğunu. Yeşil daireler DBH sinyal için dilimleri olumlu belirtmek ve böylece LC içerir. (b) A koronal beyin dilim LC içeren immunostained DBH ile yapıldı ve üzerinde confocal mikroskop görüntüsü. Görüntü güçlü sinyal LC (içinde yeşil) gösterir. (c) A koronal dilim LC içeren immunostained tirozin hidroksilaz (TH) için yapıldı ve üzerinde floresan mikroskop görüntüsü. Görüntü sağ ve sol LC için güçlü sinyal gösterir. (d) dilimleri DBH için immunostained vardı ve dilimleri 7 (solda) ve 9 (sağda) LC yer. Bitişik bölümleri XFM analiz için seçildi. (e) dilim 10 Ayrıca LC gösterdi. Sağdaki LC onun en ön kenarında ele geçirildi ise bu bölümde, sol LC Merkezi kesilmiş. (f) A kesiti LC immunostained TH için yapıldı ve üzerinde confocal mikroskop görüntüsü. Resimde yeşil etiketli LC nöronlarda ifade TH gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: görüntüleme metal düzeyleri LC. Bir erkek 12-hafta-yaşlı fare beyin Cu-ışınlama ATP7B nakavt ile izole ve bu protokol için açıklandığı gibi hazır. Dilimleri LC içeren bölümler için bitişik sigara lekeli alındı ve metal düzeyleri XFM yolu ile ölçüldü. Cu düzeyleri özellikle arttı (sarı oklarla etiketli) LC içinde beyin çevresini, süre diğer karşılaştırıldığında öğeleri (K, P ve Cl) değişmez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Düzgün örnek yönlendirme bu iletişim kuralı çok önemli bir adımdır. LC (beyincik ve aşağı olacaklar arasında sınır) bulmak için beyin dorsal yüzeyi anatomik özellikleri kullanmakta olduğunuz için bölümleri düzgün uyumlu önemlidir. Bu fare beyin dilimleyici matris beyin arızalı özen gerektirir. Anterior ve posteiror LC çekirdek eksik önlemek için daha fazla doku ~ 500 mikron kesme tavsiye ediyoruz. En yaygın hata LC tamamen eksik sonuçları çok az bölümleri azaltmak olduğunu. Böylece, bu protokol sonrası kişinin ilk kez, gerekenden daha fazla bölümleri kesme öneririz. Dikkatli bir çalışma boyama önce beyin atlas görüntülerin çok yararlıdır. Kayda değer her birkaç yüz mikron beyin görünümünü değiştirir ve biraz tecrübe ile sadece makroskopik görünüm tarafından boyama değer bölümler hangileri olduğunu mümkündür.

LC yerelleştirme işlemi sırasında ne kadar iyi beyin kesit sırasında odaklı bağlı olarak sinyal değişimler olabilir. LC Merkezi aracılığıyla kesme sinyali parlak olduğunu ve bir sinyal olarak-ecek sırıtmak içinde daha küçük bir alanına LC kenarı ile karşılaştırıldığında daha büyük bir alanı kapsar. Koronal dilimler biraz olur, hareket ettirildiğinde 4th ventrikül bir yüzünün LC belirgin olabilir ve durumda olan diğer tarafta yalnızca bitişik bir slayt içinde görülebilir. Böylece, bir her zaman bir beyin dilim içinde en fazla yoğunluk itibariyle iki LC bölge görünümünü bekleyemezsin. Bu artifact, beyin tam olarak koronal fare beyin dilimleyici matrisinde kesip dikkatle beyin OCT ile kübik gömme kalıp içine gömme önlenebilir.

Immunostaining, en azından Anti-tirozin hidroksilaz antikor ile son derece bağışlayıcı ve deneyim, inşaat üstünde ilâ 100 mikron kalınlıkta, bölümleri. Bulduğumuz çözüm engelleme yüksek sinyal gürültü maliyet azaltma ve LC bulmak için gereken süreyi azaltarak LC, boyama için gerekli değildir. Deneyim, boyama protokolü-de olsa bir LC (yerinin belirlenmesinde sadece ilgi ise kalite ve alellerle boyama-2 h, 8 h için birincil antikor ve 2 h. için ikincil antikor permeabilization Ayrıca, azaltarak az olan hızlandırdı bir virüs/izleyici enjeksiyon doğrulamak için örneğin), sabit bir beyin bölümleri üzerinde bir vibratome 100 mikron kalınlığı, kes.

Bu iletişim kuralı bir sınırlama, tasarım gereği, hayvan ötenazi ve beyin kaldırma gerektirmesidir. Bu nedenle, (örneğin, electrophysiologic kayıtları) içinde vivo yerelleştirme için yararlı değildir. Bu iletişim kuralı olan doku doğal durumunu değiştirmek PFA fiksasyon gerektirir başka bir kısıtlamadır. Bu değişiklikleri, bakır, kalsiyum, demir ve çinko36gibi temel içerik ekleyin. Metal dağıtım PFA fiksasyon tarafından neden gerçek İLETİMLERİNİZE paralel bir sabit olmayan örnek olarak çalıştırabilirsiniz bir örnek test. Bu iki örnek arasındaki metal dağıtım karşılaştırılması ilgi belirli bir çalışma metal dağılımı üzerinde İngiltere'de yılın tespit etkisi kanıt sağlayacaktır. İngiltere'de yılın fiksasyon kaçınılmalıdır, bu Protokolü (LC immunostaining tarafından bulma ve izleme denemeleri için bitişik bölümleri kullanarak) genel prensibi donmuş bölümlerine fiksasyon olmadan Genişletilebilir.

Bu iletişim kuralı bir arıtma büyük ölçüde bu sorunu çözmek için mevcut yöntemlerden olduğunu unutmayın. Yenilik bir çok küçük, kolayca cevapsız çekirdek bulmak için önceki yaklaşımlar terzilik bulunmaktadır. Bu iletişim kuralı kolayca değiştirilebilir ve temel alınarak gerek (immunostaining önlemek için Transjenik hayvanlar LC fluorophores ifade kullanarakörneğin,) genişletilmiş olduğunu bekliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri.

Acknowledgments

Biz Abigael Muchenditsi fare koloni bakımı için teşekkür ederim. ABD Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler, sözleşme numarası altında tarafından desteklenen Argonne Ulusal Laboratuvarı Gelişmiş foton kaynak kullanımı: DE-AC02-06CH11357. Biz Olga Antipova ve Dr. Stefan Vogt kullanıcı desteği ve gelişmiş foton kaynağında yardım için teşekkür ederiz. Bu eser SL için Ulusal Sağlık Enstitüsü grant 2R01GM101502 tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mouse brain slicer matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) Thermo Fisher Scientific A-21206
Charged glass slides Genesee 29-107
Confocal microscope Zeiss LSM 800
Cryostat Microm GmbH HM 505E
Cryostat cutting blades Thermo Fisher Scientific MX35
Scissors Mini, 9.5cm Antech Diagnostcs 503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) B. Eipper -
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) Cell Signaling 8586
Falcon tubes, 50ml USA Scientific 339652
Forane (isofluorane) Baxter NDC 1019-360-60
Forceps Micro Adson Antech Diagnostcs 501245
Hardset mounting media EM sciences 17984-24
Microscope Pascal LSM 5
Multi-well plates, 24 wells Thermo Fisher Scientific 930186
Optimal cutting temperature compound (OCT) VWR/ tissue tech 102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% Fisher Scientific SF98-4
Peel-A-Way disposable embedding molds Polysciences Inc. 18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS) Life Tech 14190250
Razor blades Amazon ASIN: B000CMFJZ2
Spatulas Antech Diagnostcs 14374
T pins Office Depot 344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition Amazon ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD) Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) EMD Millipore AB152
Ultralene thin film for XRF SPEX Sample Prep 3525
Wide-field fluorescent microscope Zeiss Axio Zoom.V16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
  2. Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
  3. Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
  4. Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
  5. Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
  6. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
  7. Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
  8. Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
  9. Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
  10. File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
  11. Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
  12. Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
  13. Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
  14. Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
  15. Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
  16. Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
  17. Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
  18. Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
  19. Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
  20. Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. Neuroscience. 373, 7-19 (2018).
  21. Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
  22. McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
  23. Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
  24. Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
  25. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
  26. Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
  27. Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
  28. Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
  29. Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
  30. Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Franklin, K. B. J. , Boston, Amsterdam. (2013).
  31. Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
  32. Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
  33. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
  34. Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
  35. Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, London, England. 565-574 (2016).
  36. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).

Tags

Neuroscience sayı: 145 beyin locus coeruleus metaller immünhistokimya x-ışını Floresans mikroskobu norepinefrin bakır DBH TH ATP7A ATP7B

Erratum

Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M.,… More

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter