Summary
Vi tilbyr protokoller for evaluering av mesenchymal stamceller isolert fra tannlegekontoret masse og prostata kreft cellen interaksjoner basert på direkte og indirekte co kultur metoder. Tilstand medium og trans-vel membraner er egnet til å analysere indirekte paracrine aktivitet. Såing ulikt er farget celler sammen en passende modell for direkte celle-celle interaksjon.
Abstract
Kreft som må og innviklet sykdommen er ikke bare av personlige celle spredning og vekst, men også kontrollert av svulst miljø og celle-celle interaksjoner. Identifikasjon av kreft og stamcelleforskningen interaksjoner, inkludert endringer i ekstracellulære miljø, fysisk interaksjon og utskilles faktorer, kan aktivere oppdagelsen av nye terapi alternativer. Vi kombinerer kjente co kultur teknikker for å lage et modellsystem for stamceller (MSCs) og kreft cellen interaksjoner. I denne studien, ble tannlegekontoret masse stamceller (DPSCs) og PC-3 prostatakreft celle interaksjoner undersøkt av direkte og indirekte co kultur teknikker. Tilstand medium (CM) innhentet fra DPSCs og 0,4 µm pore størrelse trans-vel membraner ble brukt til å studere paracrine aktivitet. Co kultur av forskjellige celletyper ble sammen utført for å studere direkte celle-celle interaksjon. Resultatene viste at CM økt celle spredning og redusert apoptose i prostatakreft cellekulturer. Både CM og trans-brønnen systemet økt celle migrasjon kapasiteten på PC-3 celler. Celler med forskjellige membran fargestoffer var frø i samme kultur båtene DPSCs deltok i en Self-organisert struktur med PC-3 celler under problemet direkte co kultur. Samlet indikerte resultatene at co kultur teknikker kan være nyttig for kreft og MSC interaksjoner som modellsystem.
Introduction
Mesenchymal stamceller (MSCs), med mulighet til differensiering og bidrag til regenerering av mesenchymal vev som bein, brusk, muskel, leddbånd, sene og liggende under adipose, har vært isolert fra nesten alle vev i den voksne kropp1 , 2. utenom vev homeostase av produserende bosatt celler ved kronisk betennelse eller en skade, de produserer viktig cytokiner og vekst faktorer for å organisere angiogenese, immunsystemet og vev remodeling3. Samspillet av MSCs med kreft vev er ikke godt forstått, men samler bevis antyder at MSCs kan fremme svulst innvielsen, progresjon og metastasering4.
Homing evne til MSCs til skadde eller kronisk betent gjør dem en verdifull kandidat for stilk cellen-basert behandling. Men frigi kreft vev, "aldri healing sår", også inflammatoriske cytokiner og pro-angiogenic molekyler avgjørende vekstfaktorer, som tiltrekker MSCs til cancerogenous området5. Mens det er begrenset rapportert rapporter viser hemmende effekten av MSCs på kreft vekst6,7, kreft progresjon og metastasering fremme effekter har blitt mye8. MSCs påvirke direkte eller indirekte kreft på ulike måter, inkludert undertrykke immunceller, sekresjon vekstfaktorer/cytokiner som støtter kreft celle spredning og migrasjon, forbedring angiogenic aktivitet og regulere epitel-mesenchymal overgang (EMT)9,10. Svulst miljøet består av flere celletyper, inkludert kreft-assosiert fibroblaster (CAFs) og/eller myofibroblasts, endotelceller, adipocytter og immunceller11. Av disse er CAFs den mest tallrike celle i svulst området som skiller ulike chemokines fremme kreft vekst og metastasering8. Det har vist at Ben margtransplantasjon-avledet MSCs kan skille ut CAFs i svulst stroma12.
Tannlegekontoret masse stamceller (DPSCs), karakterisert som de første dental vev-avledet MSCs av Gronthos et al. 13 i 2000 mye undersøkt av andre14,15, uttrykke pluripotency markører som Oct4, Sox2og Nanog16 og kan differensiere i ulike celle linages17. Gene og protein uttrykk analyse viste at DPSCs gi sammenlignbare nivåer av vekstfaktorer/cytokiner med andre MSCs som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), angiogenin, fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2), interleukin-4 (IL-4), IL-6, IL-10, Stamcelle faktor (SCF), samt fms-lignende tyrosin kinase-3 ligand (Flt - 3L) som kan fremme angiogenese modulerer immunceller og støtte kreft celle spredning og migrasjon18,19,20 . Mens MSCs samhandling med kreft miljøet har vært godt dokumentert i litteraturen, er forholdet mellom DPSCs og kreftceller ikke evaluert ennå. Studien etablert vi co kultur og tilstand middels behandling strategier for en svært metastatisk prostatakreft cellen linje, PC-3 og DPSCs å foreslå potensielle tiltak av mekanismen av dental MSCs i kreft progresjon og metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftlig samtykke av pasientene ble oppnådd etter godkjenning fra den institusjonelle etikk.
1. DPSC isolasjon og kultur
- Overføre visdom tennene fra unge voksne i alderen mellom 17 og 20 til 15 mL rør som inneholder komplett Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) [lav glukose DMEM media, med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin / amfotericin (PSA) løsning], innen 8 timer etter eksisjon. Holde vev materialet kaldt (4 ° C) under overføring til unngå potensielle celledød.
- Fjerne masse vev av sterile utvinning Tang fra midten av tannen nøye plassere masse vevet i kalde komplett DMEM medium i 10 cm vev kultur retter og hakke dem i små biter (2-3 mm) av skalpell.
Merk: Alle eksperimentelle prosedyrer gjennomføres under sterile forhold i laminær strømning panseret. Denne ikke-enzymatisk teknikken har vært brukt21,22,23. - Sted liten masse vev inni vev kultur behandlet 6-vel plater og legge 200 µL av komplett DMEM media å dekke hver liten masse vev stykker.
- Inkuber vev kultur brønnene på 37 ° C i en fuktet luft atmosfære (80% fuktighet) med 5% CO2 for 2t å gi vev vedlegg.
Merk: Dette trinnet kan bli forlenget til 3-4 h ved å kontrollere fordampning av media. - Legg til riktig volum (2-2.5 mL) komplett DMEM middels fordelt og ruge på 37 ° C i en fuktet luft atmosfære med 5% CO2 for cellene å spre fra vevet.
Merk: Cellene blir synlige etter ca 4 dager og nå confluency etter 8-9 dager. - Når celler når 80% confluency, Fjern medier fra 6-og plater, vask med 2 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) og legge 2 mL av trypsin. Inkuber 2 minutter i en inkubator på 37 ° C med fuktet luft atmosfære og 5% CO2. Deretter Legg 2 mL av komplett DMEM medium etterfulgt av 2 min incubation å hemme trypsin. Sentrifuge cellene på 300 x g for 5 min til pellets celler.
- Passasjen celler til flasker i fullstendig DMEM media og butikken for ytterligere eksperimenter. Legge til 15 mL fullfører DMEM media i de T-75 flasker og overføring fra to brønner av 6-vel plate til en T-75 flasker og ruge på 37 ° C med fuktet luft atmosfære og 5% CO2.
2. karakterisering av DPSCs
- Utføre morfologiske analyser.
- Frø celler (trinn 1.6) i vev kultur belagt flasker (eller 6-vel plater) i fullstendig DMEM medium for minst 8 passeringer å observere celle morfologi.
- Visualisere celler ved lys mikroskop og definere fibroblast som celle morfologi. Cellene skal knytte til kultur retter og har som spindel celle morfologi.
Merk: Alternativt celler kan kultivert som enkeltceller i opptil 14 dager i godt-plater å observere kolonien formasjon kapasitet som en bestemt egenskap fibroblaster og MSCs.
- Utføre overflaten markør analyser.
- Trypsinize cellene fra trinn 1.7. Fjern medier fra T-75 vev kultur kolbe, vaske med 2 mL PBS og legge 2 mL av trypsin. Inkuber 2 minutter i en inkubator på 37 ° C med fuktet luft atmosfære og 5% CO2. Deretter Legg 2 mL av komplett DMEM medium etterfulgt av 2 min incubation å hemme trypsin. Sentrifuge cellene på 300 x g for 5 min til pellets celler.
- Fastsette cellene med 4% paraformaldehyde etter 20 min i romtemperatur i 1,5 mL rør og deretter vaske dem med 500 µL PBS 3 ganger å fjerne paraformaldehyde.
- Inkuber fast celler med antistoffer mot CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 og CD73 1t på 4 ° C i 100 µL av PBS.
Merk: Konsentrasjonen av antistoff brukes er 0,5 µg/mL. CD34 og CD14 CD45 brukes som negative markører, mens CD29, CD90, CD105, CD166 og CD73 brukes som positive celle overflate markører for MSCs. - Vask celler 3 ganger med PBS og bruke respektive sekundære antistoffer som fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), etc. for merking. Inkuber celler med 1:500 utvannet sekundære antistoffer i 100 µL av PBS i 30 min på 4 ° C og vask 3 ganger med PBS.
- Holde prøver i mørket flyt cytometri analyse og oppdage positive og negative farging av flowcytometri.
Merk: Bruk unstained kvinne kontroll celler for å arrangere fremover og side scatter. Ordne gating av positivt farget bestander av unntatt døde celler, avfall og un farget befolkningen. Bruke 100 µm munnstykke med 45 psi skjede press og samle 10.000 hendelser for å fastslå positiv DPSCs ved å arrangere kanaler.
- Utføre differensiering av DPSCs.
- Frø 1 × 104 celler på 24-og plater i fullstendig DMEM media og ruge 24 h på 37 ° C i en fuktet luft atmosfære med 5% CO2.
- Formulere differensiering media bruker konkurrere DMEM medium som base media. Forberede osteogenic media ved å blande 100 nM deksametason 10 mM β-glycerophosphate og 0.2 mM askorbinsyre. Forberede chondrogenic media ved å blande 1 × insulin-transferrin-selen (ITS-G), 100 nM deksametason, 100 ng/mL transformere vekstfaktor beta (TGF-β), 14 μg/mL askorbinsyre og 1 mg/mL bovin serum albumin (BSA). Forberede adipogenic media ved å blande 100 nM deksametason, 5 μg/mL insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) og 60 μM indomethacin.
Merk: Differensiering media kan oppbevares på 4 ° C i minst en uke. - Endre vekst medier osteo-, chondro-eller adipo-genic differensiering media og Oppdater medier to ganger i uken i to uker.
- Bekreft differensiering av von Kossa og Alcian blå flekker, enzym aktivitet (alkalisk fosfatase aktivitet), immunocytochemistry og kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) analyser ifølge protokollene tidligere beskrevet21.
- Utføre von Kossa og Alcian blå stainings på celler som er løst med 4% paraformaldehyde ved romtemperatur for 10 min. vask fast cellene med PBS og stain dem med vonKossa kit i henhold til produsentens anbefalinger å observere kalsium innskudd .
- Forberede Alcian blå flekker løsning av oppløsende 1.00 g Alcian blå fargestoff i 100 mL av 3% (v/v) eddiksyre for ytterligere flekker. Vask fast cellene med PBS og flekken celler for 30 min med Alcian blå løsning. Visualisere farget prøvene av lys mikroskop.
3. forberedelse av tilstand Medium (CM)
- Erstatt media celler fra trinn 1.7 med fersk komplett DMEM 24 h før CM samling.
Merk: Avsnitt 2-4 anbefales. - Samle tilstand medium (CM) fra kulturperler DPSCs når celler når 80% confluency. Sentrifuge samlet medier på 300 x g i 5 min å fjerne avfall vev og celle rusk.
Merk: Alternativt bruke 0,2 µm sprøyte filtre for å fjerne rusk fra tilstand medium. - Samle nedbryting og lagre på 20 ° C for videre studier.
Merk: Hold nedbryting på-80 ° C for langtidslagring.
4. behandling av kreftceller med CM
- Utføre celle levedyktighet analyser.
- Frø PC-3 celler (menneskelig prostata kreftceller) på 96-brønns plater på en celle tetthet 5 × 103 celler/godt i fullstendig DMEM og ruge i en fuktet kammer på 37 ° C og 5% CO2 24 h.
- Behandle celler med 10, 20, 30, 40 og 50% av CM (v/v) blandet med komplett DMEM 24 h.
- Måle celle levedyktighet ved hjelp av 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-analysen som beskrevet tidligere24.
- Utføre terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick slutten merking (tunnel) analyser.
- Frø PC-3 celler på 6-vel cellekultur plater på en celle tetthet 2 × 105 celler/godt og ruge i en fuktet kammer på 37 ° C og 5% CO2 over natten.
- Bland 20% CM (v/v) med komplett DMEM medium og gjelder celler for 24 timer.
- Trypsinize celler og avbryte 50 μL av tunnel reaksjonsblandingen (merking løsning + enzym løsning, leveres med kit) og ruge på 37 ° C for 60 min i en fuktet og 5% CO2 atmosfære.
Merk: For trypsinization, Fjern medier fra 6-vel celle kultur platene vask med 1 mL av PBS og legge til 500 µL av trypsin. Inkuber 2 minutter i en inkubator på 37 ° C med fuktet luft atmosfære og 5% CO2. Legg 1 mL av komplett DMEM medium etterfulgt av 2 min incubation å hemme trypsin. Sentrifuge cellene på 300 x g for 5 min til pellets celler. - Skyll med PBS og analysere celler i PBS ved hjelp av flowcytometri.
- Utføre qPCR analyser.
- Frø PC-3 celler på 6-vel cellekultur plater på en celle tetthet 2 × 105 celler/godt og ruge i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2 over natten.
- Bland 20% CM (v/v) med komplett DMEM medium og gjelder celler for 24 timer.
- Trypsinize celler og samle celle pellet for RNA isolasjon og cDNA syntese.
Merk: Fjern medier fra 6-vel celle kultur plater, vask med 1 mL av PBS og legge 500 µL av trypsin. Inkuber 2 minutter i en inkubator på 37 ° C med fuktet luft atmosfære og 5% CO2. Legg 1 mL av komplett DMEM medium etterfulgt av 2 min incubation å hemme trypsin. Sentrifuge cellene på 300 x g for 5 min til pellets celler. - Utføre qPCR eksperimenter i henhold til tidligere beskrevet protokollen25.
- Utføre celle migrasjon av kreftceller.
- Frø 1 × 105 PC-3 celler på 12-vel tallerkener og ruge i en fuktet inkubator overnatting på 37 ° C og 5% CO2.
- Scratch-cellene med sterilt 200 μL tips og endre medium umiddelbart med fersk medium som inneholder ulike konsentrasjoner av CM [f.eks10, 20, 30, 40 og 50% av CM (v/v) blandet med komplett DMEM].
- Observere riper under en invertert mikroskop og ta bilder med ulike tidsintervaller (0 og 24 timer).
- Måle scratch nedleggelsen ved hjelp av Image J programvare bruker formelen:
Merk: Åpne scratch bildet med bilde J programvare. Tegne en linje som har samme størrelsesorden som skala bar som allerede finnes i bildet. Klikk analysere, angi skala og observere avstanden i piksler som forstørrelsen av tegnet linjen. Skrive størrelsen på baren skala til delen kjent distanse, ordne enhet (piksler, cm, etc.), og klikk ok. Gå til delen analysere igjen og klikk på målinger. Dette vil først gi størrelsen på baren skala som den valgte enheten. Klikk på en av kantene på bunnen og dra fram den andre enden av scratch. Note verdien for hvert punkt (0t og 24t). Koble disse verdiene i formelen ovenfor og beregne scratch nedleggelsen.
5. celle migrasjon av indirekte kontakt av kreftceller og DPSCs
- Frø 3 × 104 DPSCs på 24-vel platen setter inn med 0,4 μm pore og ruge i en fuktet inkubator overnatting på 37 ° C.
- Frø PC-3 celler på 24-vel plater på en celle tetthet 5 × 104 og ruge i en fuktet inkubator overnatting på 37 ° C og 5% CO2.
- Scratch PC-3 celler med et sterilt 200 μL tips, endre medium med fersk medium og plassere innsatser bærer DPSCs på PC-3 celler.
- Observere celler under en invertert mikroskop og ta bilder med ulike tidsintervaller (0 og 24 h) til å analysere celle migrasjon.
6. co kultur analysen og Flow cytometri analyse
- Etiketten PC-3 celler og DPSCs ved hjelp av PKH67 (grønn) og PKH26 (rød) fluorescerende celle koblingsfunksjonalitet fargestoffer, henholdsvis26.
- Trypsinize PC-3 og DPSCs celler, henholdsvis. Fjern medier fra T-75 vev kultur kolbe, vaske med 2 mL PBS og legge 2 mL av trypsin. Inkuber 2 minutter i en inkubator på 37 ° C med fuktet luft atmosfære og 5% CO2. Legg 2 mL av komplett DMEM medium etterfulgt av 2 min incubation å hemme trypsin.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min forkaste nedbryting og resuspend celle pellets i dye løsningen i fortynner-C Formatnavnbufferen av kit (se Tabell for materiale).
- Inkuber celler i dye løsningen for 10 min og avslutte flekker reaksjonen ved å legge til 100 µL av FBS. Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min, forkaste nedbryting og vaske cellene med komplett oppblomstringen medium før co dyrking.
- Plate merket celler (5 × 104/vel) på 6-vel plater på 1:1 ratio (DPSCs: PC3). Opprettholde co kulturperler celler i hele DMEM.
- Samle celler etter 24 timer eller 48t inkubasjon perioder med sentrifugering av celler på 300 x g for 5 min og vask med PBS.
- Resuspend celler i 300 µL fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) buffer i 5 mL rundt bunnen flyt cytometri rør. Vortex å spre celle aggregater rett før eksempel analysen.
- Bruk en 100 µm munnstykke med 45 psi skjede press.
Merk: Ekstremt høy flyt kan redusere følsomheten til fluorescens gjenkjenning. - Bruk unstained kvinne kontroll cellene og én farget for å justere siden scatter laser spenning for celletyper og kompensasjon som nevnt tidligere27og riktig frem.
Merk: Bruk gating for levende celler for å utelate celle rusk, døde celler eller aggregat. - Samle 10.000 hendelser (100.000 anbefales) for å finne prosent positive grønne DPSCs og røde PC-3 celler ved å arrangere FL-1 (grønn) og FL-2 (rød) kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser de generelle MSC egenskapene til DPSCs under kultur forhold. DPSCs utøve fibroblast-lignende celle morfologi etter plating (figur 1B). MSC overflaten antigener (CD29, CD73, CD90, CD105 og CD166) er svært uttrykt mens blodkreft markører (CD34, CD45 og CD14) er negativt (figur 1 c). Endringer på morfologiske og molekylære relatert til osteo-, chondro- og adipo-genic differensiering er observert i DPSCs kultur etterfulgt av differensiering cocktail program (figur 1 d).
For å bestemme aktiviteten til utskilles molekyler fra DPSCs på prostatakreft celle spredning og migrasjon, brukt vi CM som er samlet inn fra kulturperler dental stamceller og analysert kreft celle spredning og vandrende atferd. CM behandling (20% v/v) ble valgt basert på MTS celle levedyktighet analyser. PC-3-cellene behandlet med stilk cellen CM ble utsatt for tunnel analysen og qPCR analysene å bestemme cellen død og apoptotisk regulering under kontroll og eksperimentelle forhold. Vi konkluderte med at CM behandling økt celle levedyktighet og redusert celledød i PC-3 cellekultur. Ex vivo celle migrasjon analysen (scratch analysen) ble utført for å vurdere om CM av DPSCs påvirker PC-3 kreft celle migrasjon. Behandling med konsentrasjonen av 10% og 20% CM (v/v) økt scratch nedleggelse betydelig sammenlignet med kontrollgruppen på 24 h (figur 2). Tilsvarende indusert 20% CM (v/v) behandling oppregulering av ekstracellulær matrix proteiner genet uttrykk som kollagen jeg, fibronectin og laminin, som spiller viktige roller i celle migrasjon.
Vi brukte to forskjellige kultur teknikker for å etablere direkte og indirekte co kulturer av PC-3 celler og DPSCs under ex vivo forhold. Trans-brønnen systemet ble valgt til å skape et indirekte samhandling miljø for PC-3 kreftceller. PC-3 celler var frø på bunnen av godt platen og setter inn bærer DPSCs ble plassert på toppen. Fordi vi som mål å generere i direkte samhandling, ble trans-og membraner med 0,4 μm porestørrelse brukt til å forhindre fysiske celle bevegelse av DPSCs fra øverst til nederst gjennom membran. Utskilles molekyler fra DPSCs økt scratch nedleggelse av PC-3 celler vesentlig sammenlignet kontroll celler. PC-3 celler co kultivert med DPSCs viste en 51% scratch nedleggelse mens kontroll cellene hadde en 38% nedleggelse etter 24 h (figur 3A). Direkte co kulturer som inneholder 1:1 forholdet mellom DPSCs og PC-3 celler ble brukt til å analysere selv-organisering av stilk celler og kreftceller. Celler var farget med røde og grønne membran fargestoffer å skille ulike celletyper under mikroskop. PC-3 celler med røde fluorescens fargestoff var omgitt av DPSCs i en rør-liknende struktur etter en 24-timers inkubasjonstid. Co kulturperler celler med fluorescerende fargestoffer ble analysert av flowcytometri basert på fluorescens flekker, og cellen prosenter ble oppdaget. DPSCs og PC-3 celler opprettet en godt organisert struktur som PC-3 celler proliferated raskt etter 48 h (figur 3B). Selv om cellene var frø på en like forhold (1:1) for direkte co kultur, var 62.22% av PC-3 celler bestemmes etter 48t inkubasjon indikerer høyere spredning frekvensen av PC-3 celler.
Figur 1: karakterisering av tannlegekontoret masse stamceller (DPSCs). (A) masse vev innhentes fra midten av tannen. (B) Fibroblast-lignende celle morfologi DPSCs. skala bar: 100 μm. (C) flyt cytometri analyser av DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 og CD 166 er positiv overflate markører, mens CD14, CD34, og CD45 negative overflate markører. NC: negativ kontroll (oppblomstringen medium behandlet celler). (D) differensiering av DPSCs til mesenchymal celletyper ble bekreftet med von Kossa flekker, Alcian blå flekker, og lipid dråper (skala bar: 200 μm). Osteocalcin, collagen type II (Col II), og fettsyrer bindende protein 4 (FABP4) immunostainings viste osteo-, chondro- og adipogenic differensiering DPSCs. skala bar: 200 μm. Dette tallet er tilpasset fra Dogan et al. 34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: samling av tilstand medium (CM) fra DPSCs for celle levedyktighet og bunnen analyser. TUNNEL positiv celler ble redusert med 20% CM (v/v) program. Kvantitativ måling av scratch nedleggelse viste at CM økt PC-3 celle migrasjon. CM: betinget medium; NC: negativ kontroll (oppblomstringen medium behandlet celler). * P < 0,05. Dette tallet er tilpasset fra Dogan et al. 34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: metodikk for trans-vel celle migrasjon analysen og co kultur. (A) PC-3 celle scratch nedleggelse i trans-vel co kultur-systemet. (B) interaksjon mønsteret av farget DPSCs (grønn fluorescens) og PC-3 celler (rød fluorescens) etter 24 timer og 48 h co kultur (seeding forholdet 1:1). Høyere PC-3 celle nummer ble oppdaget med hensyn DPSCs. skala bar: 200 μm. Dette tallet er tilpasset fra Dogan et al. 34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bidrag av MSCs svulst miljøet er regulert av flere interaksjoner inkludert hybrid celle generasjon via cellen fusjoner, entosis eller cytokin og chemokine aktiviteter mellom stamceller og kreft celler28. Strukturelle organisasjon, celle-celle interaksjoner og utskilles faktorer bestemmer kreft cellen virkemåte svulst forfremmelse, progresjon og metastasering til omkringliggende vev. Riktig ex vivo modellsystemer undersøke mekanismene bak samhandling bosatt celle populasjoner må forstå cellular kommunikasjon for kreft progresjon og metastasering.
Vi brukte DPSCs til å opprette et modellsystem for prostatakreft og dental stamceller interaksjoner. Fordelen med denne typen voksen stilk cellen er tilgjengeligheten av vev kilde og lett isolasjon skritt. På den annen side, er bruker bare DPSCs uten sammenligning med kjente voksen stilk celletyper en begrensning av denne protokollen. Gjeldende co kultur metoder er inndelt i direkte og indirekte teknikker inkluderer paracrine signalering løselige utskilles molekyler og direkte kultur av ulike celle populasjoner i samme miljø29,30, 31. CM fullt preget DPSCs ble brukt til å evaluere paracrine signalnettverk mediert kreft cellevekst i kultur. CM programmet er den enkleste metoden for cellen samhandling studier og lar for observasjon av løselig megler aktiviteter i kultur-systemet. Selv om CM ikke er en helt adekvat modellsystem, er CM program som co kultur svært effektiv å observere celle-celle interaksjoner ex vivo. CM av DPSCs økt celle spredning og migrering av prostata kreftceller, indikerer oppkjøpet av metastatisk fenotypen faktorene skilles ut fra DPSCs.
En annen modell av celle-celle samhandling er etableringen av en fysisk barriere som en trans-vel membran mellom celle populasjoner30. Trans-vel systemer er delt inn i to typer: de som cellen beveger gjennom porene, og de muliggjør overføring av utskilles faktorer samtidig hindre celle kontakt gjennom membranen også. Vi brukte trans-brønner med 0,4 μm porestørrelse analysere nedleggelse av PC-3 riper, avslørende høyere kreft celle migrasjon rate i gruppen DPSC forhold til kontroll cellene.
Selv om CM og trans-vel-baserte systemer er fordelaktig for bare analysere bidrag fra en bestemt celle type32, er direkte dyrking av ulike subpopulasjoner i samme miljø nødvendig parallelt med indirekte co kultur metoder. Seeding forholdet kan kontrolleres og strukturelle organiseringen av forskjellige befolkningsgrupper lett kan analyseres av direkte co kultur av MSC kreftceller. Vi brukte 1:1 ratio DPSCs og PC-3 celler beiset med grønne og røde fluorescens membran fargestoffer, henholdsvis. DPSCs omkranset PC-3 celler og opprettet en rør-liknende struktur i kultur brønner. PC-3 celler dannet klynger i form av holmer omgitt av kanal-lignende strukturer generert av DPSCs.
Nylig viste Brunetti et al. at DPSCs skiller TNF-relaterte apoptose-inducing ligand (TRAIL) under osteogenic differensiering og påvirker myelom kreft cellen levedyktighet, som angir mulig samhandling dental stamceller med kreft celler33. Vår studie er den første rapporten som evalueres interaksjoner dental avledede MSCs og prostata kreftceller som en ex vivo -modell. Vi brukte tre ulike direkte/indirekte tilnærminger i vårt forsøk. Spredning av kreftceller og høy overføring priser ble oppdaget ved CM og trans-og analyser eller ved co dyrking ulikt farget celler som tillater flere interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Yeditepe University. Alle data og tall brukes i denne artikkelen ble tidligere publisert34.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
