Summary
Vi tillhandahåller protokoll för kvalitetsbedömning av mesenkymala stamceller isoleras från tandpulpan och prostatacancer cell interaktioner bygger på direkta och indirekta samtidig kultur metoder. Villkor medium och trans-väl membran är lämpliga att analysera indirekta parakrin aktivitet. Seedning differentially är färgade celler tillsammans en lämplig modell för direkta cell-cell interaktioner.
Abstract
Cancer som en utgångsämnet process och komplicerade sjukdom är inte bara regleras av enskilda cellproliferation och tillväxt men också kontrolleras av tumör miljö och cell-cell interaktioner. Identifiering av cancer och stem cell interaktioner, inklusive ändringar i extracellulära miljön, fysiska interaktioner och utsöndrade faktorer, kan möjliggöra upptäckten av nya behandlingsalternativ. Vi kombinerar kända samtidig kultur tekniker för att skapa ett modellsystem för mesenkymala stamceller (MSC) och cancer cell interaktioner. I den aktuella studien undersöktes tandpulpan stamceller (DPSCs) och PC-3 prostatacancer cell interaktioner genom direkta och indirekta samtidig kultur tekniker. Villkor medium (CM) erhålls från DPSCs och 0,4 µm porstorlek storlek trans-väl membran användes för att studera parakrin aktivitet. Samtidig kultur av olika celltyper utfördes tillsammans för att studera direkt cell-cell interaktioner. Resultaten visade att CM ökad cellproliferation och minskade apoptos i prostatacancer cellkulturer. Både CM och trans-väl systemet ökade cell migration kapacitet av PC-3 celler. Celler som färgas med olika membran färgämnen var seedad i de samma odlingskärl och DPSCs deltog i en självorganiserade strukturen med PC-3 celler under detta direkt samarbete kultur tillstånd. Sammantaget visade resultaten att samtidig kultur tekniker kan vara användbar för cancer och MSC interaktioner som modellsystem.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC), med möjlighet till differentiering och bidrag till förnyelse av mesenkymala vävnader såsom ben, brosk, muskler, ligament, senor och adipose, har isolerats från nästan alla vävnader i den vuxna kropp1 , 2. än att tillhandahålla vävnad homeostas genom att producera bosatt celler vid kronisk inflammation eller en skada, de producerar livsviktiga cytokiner och tillväxtfaktorer för att orkestrera angiogenes och immunsystemets vävnad remodeling3. MSCs interaktion med cancer vävnad är inte väl förstått, men ackumulerande bevis antyder att MSCs kan främja tumör initiering, progression och metastaser4.
MSCs målsökande förmåga att skadade eller kroniskt inflammerade området gör dem en värdefull kandidat för stamceller-baserade behandlingar. Men frigöra cancer vävnader, ”aldrig läka sår”, också inflammatoriska cytokiner, proangiogena molekyler och vitala tillväxtfaktorer, som locka MSCs till cancerogenous område5. Medan det finns begränsade rapporterade rapporter visar hämmande effekterna av MSCs på cancer tillväxt6,7, deras cancer progression och metastaser främjande effekter har varit omfattande8. MSCs påverkar direkt eller indirekt carcinogenes på olika sätt inklusive undertrycka immunceller, utsöndrar tillväxtfaktorer/cytokiner som stöder cancer cell spridning och migrering, öka angiogena aktivitet och reglera epitelial-mesenkymala övergången (EMT)9,10. Tumör miljön består av flera celltyper inklusive cancer-associerade fibroblaster (CAFs) eller myofibroblaster, endotelceller, adipocyter och immunceller11. Av dessa är CAFs den vanligast förekommande Celltypen i området tumör som utsöndrar olika chemokiner främjar cancer tillväxt och metastas8. Det har visats att benmärgen-derived MSCs kan differentieras till CAFs i tumör stroma12.
Tandpulpan stamceller (DPSCs), karakteriseras som de första dentala vävnad-derived MSCs av Gronthos et al. 13 år 2000 och sedan allmänt utreds av andra14,15, express pluripotency markörer såsom Oct4, Sox2och Nanog16 och kan differentieras till olika cell linages17. Gen och protein uttryck analys visade att DPSCs producera jämförbara nivåer av tillväxtfaktorer/cytokiner med andra MSCs såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), angiogenin, fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2), interleukin-4 IL-4, IL-6, IL-10, och stamceller faktor (SCF), samt fms-liknande tyrosin Kinas-3 ligand (Flt - 3L) som kan främja angiogenes, modulera immunceller, och stödja cancer cell spridning och migration18,19,20 . Medan interaktionerna av MSCs med cancer miljö har varit väl dokumenterade i litteraturen, har förhållandet mellan DPSCs och cancerceller inte utvärderats ännu. I den aktuella studien etablerat vi samarbete kultur och skick medium behandlingsstrategier för en mycket metastaserande prostatacancer cell fodrar, PC-3 och DPSCs att föreslå potentiella åtgärder av mekanism av dental MSCs i cancer progression och metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftligt informerat samtycke från patienterna erhölls efter godkännande från utskottet för institutionella etik.
1. DPSC isolering och kultur
- Överföra visdomständer som erhållits från unga vuxna i åldern 17 – 20 till 15 mL rör som innehåller komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) [låg glukos DMEM media, kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin / amfotericin (PSA) lösning], inom 8 h efter resektion. Hålla vävnad materialet kall (4 ° C) under överföring till undvika potentiella celldöd.
- Ta bort massa vävnaden av sterila utvinning pincett från mitten av tanden försiktigt, placera massa vävnaden i det kalla kompletta DMEM mediet i 10 cm vävnadsodling rätter och finhacka dem i små bitar (2-3 mm) med skalpell.
Obs: Alla experimentella rutiner bör utföras under sterila förhållanden i LAF. Denna icke-enzymatiska teknik har funnits tidigare använt21,22,23. - Plats lilla massa vävnader inuti vävnaden kultur behandlas 6-bra plattor och tillsätt 200 µL av komplett DMEM media att täcka varje liten massa vävnad bitar.
- Inkubera vävnadsodling brunnarna vid 37 ° C i en fuktad luft atmosfär (80% luftfuktighet) med 5% CO2 för 2 h att ge vävnad fastsättning.
Obs: Detta steg kan förlängas till 3-4 h genom att kontrollera avdunstning av media. - Tillsätt lämplig volym (2-2,5 mL) komplett DMEM medium till brunnarna och inkubera vid 37 ° C i en fuktad luft atmosfär med 5% CO2 för celler att sprida från vävnaden.
Obs: Celler blir synliga efter cirka 4 dagar och når konfluens efter 8-9 dagar. - När celler når 80% konfluens, ta bort medier från 6 brunnar, tvätta med 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 2 mL av trypsin. Inkubera i 2 min i en inkubator vid 37 ° C med fuktad luft atmosfär och 5% CO2. Sedan Tillsätt 2 mL av komplett DMEM medium följt av 2 min inkubering hämma trypsin. Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min till pellet celler.
- Passagen celler till kolvar i komplett DMEM media och butik för ytterligare experiment. Tillsätt 15 mL komplett DMEM media till T-75 kolvar och överföring celler från två brunnar i 6-väl plattan till en T-75 kolvar och inkubera vid 37 ° C med fuktad luft atmosfär och 5% CO2.
2. karakterisering av DPSCs
- Utföra morfologiska analyser.
- Utsäde celler (steg 1,6) i vävnadsodling belagda kolvar (eller 6 brunnar) i komplett DMEM medium för minst 8 passager att iaktta cellmorfologi.
- Visualisera cellerna genom ljusmikroskop och definiera fibroblast-liknande cellmorfologi. Cellerna bör bifoga till kultur rätter och har spindel-liknande cellmorfologi.
Obs: Alternativt celler kan vara odlade som enstaka celler för upp till 14 dagar i väl-plattor att iaktta kolonin bildandet kapacitet som är en specifik egenskap hos fibroblaster och MSCs.
- Utföra ytan markör analyser.
- Trypsinize cellerna från steg 1,7. Ta bort medier från T-75 vävnadsodling kolven, tvätta med 2 mL PBS och tillsätt 2 mL av trypsin. Inkubera i 2 min i en inkubator vid 37 ° C med fuktad luft atmosfär och 5% CO2. Sedan Tillsätt 2 mL av komplett DMEM medium följt av 2 min inkubering hämma trypsin. Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min till pellet celler.
- Fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min i rumstemperatur i 1,5 mL rör och sedan tvätta dem med 500 µL av PBS 3 gånger att ta bort PARAFORMALDEHYD.
- Inkubera fast celler med antikroppar mot CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 och CD73 för 1 h vid 4 ° C i 100 µL av PBS.
Obs: Koncentrationen av antikroppar som används är 0,5 µg/mL. CD34 och CD14 CD45 används som negativa markörer, medan CD29, CD90, CD105, CD166 och CD73 används som positiv cell yta markörer för MSCs. - Tvätta cellerna 3 gånger med PBS och använda respektive sekundära antikroppar såsom fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC), fykoerytrin (PE), etc. för märkning. Inkubera cellerna med 1: 500 utspädd sekundära antikroppar i 100 µL av PBS under 30 minuter vid 4 ° C och tvätta 3 gånger med PBS.
- Hålla prover i mörkret för flödescytometri Flödesanalys och upptäcka positiva och negativa färgning av flödescytometri.
Obs: Använd ofärgade kontroll celler för att ordna framåt och side scatter. Ordna gating av positivt färgade populationer genom att utesluta döda celler, skräp och un-färgade befolkningen. Använd 100 µm munstycke med 45 psi slida tryck och samla 10 000 händelser för att fastställa positiva DPSCs genom att ordna kanaler.
- Utföra differentiering av DPSCs.
- Frö 1 × 104 celler på 24 brunnar i slutföra DMEM media och Inkubera under 24 timmar vid 37 ° C i en fuktad luft atmosfär med 5% CO2.
- Formulera differentiering media med konkurrera DMEM medium som bas media. Förbered osteogent genom att blanda 100 nM dexametason, 10 mM β-glycerofosfat och 0,2 mM askorbinsyra. Förbered chondrogenic genom att blanda 1 × insulin-transferrin-selen (ITS-G), 100 nM dexametason, 100 ng/mL omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β), 14 μg/mL askorbinsyra och 1 mg/mL bovint serumalbumin (BSA). Förbered adipogena genom att blanda 100 nM dexametason, 5 μg/mL insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) och 60 μM indometacin.
Obs: Differentiering media kan förvaras vid 4 ° C i minst en vecka. - Ändra tillväxtmassmedia till osteo - chondro- eller adipo-genic differentiering media och uppdatera media två gånger i veckan under två veckor.
- Bekräfta differentiering av von Kossa och Alcian blå färgning, enzymaktivitet (alkaliskt fosfatas aktivitet), immuncytokemi och kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) analyser enligt protokoll som tidigare beskrivits21.
- Utföra von Kossa och Alcian blå färgningar på celler som korrigeras med 4% PARAFORMALDEHYD i rumstemperatur i 10 min. Tvätta fast cellerna med PBS och färga dem med vonKossa kit enligt tillverkarens rekommendationer att iaktta kalkavlagringar .
- Förbereda Alcian blå färgning lösning genom att lösa 1.00 g Alcian blå färg i 100 mL ättiksyra 3% (v/v) för ytterligare färgning. Tvätta fast cellerna med PBS och fläckar celler för 30 min med Alcian blå lösning. Visualisera de färgade proverna ett ljusmikroskop.
3. upprättande av villkor Medium (CM)
- Ersätta media av celler från steg 1,7 med färska komplett DMEM 24 h innan CM samling.
Obs: Passage 2-4 rekommenderas. - Samla in skick medium (CM) från odlade DPSCs när celler nå 80% konfluens. Centrifugera insamlade media vid 300 x g i 5 min att avlägsna avfall vävnad material och cell skräp.
Obs: Alternativt använda 0,2 µm spruta filter att ta bort skräp från tillstånd medlet. - Samla in supernatanten och förvaras vid-20 ° C för ytterligare experiment.
Anmärkning: Förvara supernatanten vid-80 ° C för långsiktig lagring.
4. behandling av cancerceller med CM
- Utföra cell livskraft analyser.
- Utsäde PC-3 celler (mänsklig prostatacancerceller) på 96 brunnar på en cell densiteten av 5 × 103 celler per brunn i komplett DMEM och inkubera i en fuktig kammare vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
- Behandla celler med 10, 20, 30, 40 och 50% cm (v/v) blandat med komplett DMEM för 24 h.
- Mäta cellviabilitet med hjälp av 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-analysen som beskrivs tidigare24.
- Utföra terminal deoxynucleotidyl transferas dUTP nick slutet märkning (TUNEL) analyser.
- Utsäde PC-3 celler på 6-väl cellkultur plattor på en cell densiteten av 2 × 105 celler/väl och inkubera i en fuktig kammare vid 37 ° C och 5% CO2 över natten.
- Blanda 20% CM (v/v) med komplett DMEM medium och gälla cellerna för 24 h.
- Trypsinize celler och avbryta i 50 μL av TUNEL reaktionsblandningen (märkning lösning + enzym lösning, levereras med kit) och inkubera vid 37 ° C i 60 min i en fuktad och 5% CO2 atmosfär.
Obs: För trypsinization, ta bort medier från 6-väl cell kultur plattor, tvätta med 1 mL PBS och tillsätt 500 µL av trypsin. Inkubera i 2 min i en inkubator vid 37 ° C med fuktad luft atmosfär och 5% CO2. Tillsätt 1 mL av komplett DMEM medium följt av 2 min inkubering hämma trypsin. Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min till pellet celler. - Skölj med PBS och analysera celler i PBS med hjälp av flödescytometri.
- Utföra qPCR analyser.
- Utsäde PC-3 celler på 6-väl cellkultur plattor på en cell densiteten av 2 × 105 celler/väl och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 över natten.
- Blanda 20% CM (v/v) med komplett DMEM medium och gälla cellerna för 24 h.
- Trypsinize celler och samla cellpelleten för RNA isolering och cDNA syntes.
Obs: Ta bort medier från 6-väl cell kultur plattor, tvätta med 1 mL PBS och tillsätt 500 µL av trypsin. Inkubera 2 min i en inkubator vid 37 ° C med fuktad luft atmosfär och 5% CO2. Tillsätt 1 mL av komplett DMEM medium följt av 2 min inkubering hämma trypsin. Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min till pellet celler. - Utföra qPCR experiment enligt de tidigare beskrivna protokollet25.
- Utföra cellmigration av cancerceller.
- Frö 1 × 105 PC-3 celler på 12 brunnar och inkubera i en fuktad inkubator över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Repa celler med en steril 200 μL spets och ändra medium omedelbart med färska medium innehållande olika koncentrationer av CM [e.g., 10, 20, 30, 40 och 50% cm (v/v) blandat med komplett DMEM].
- Observera repor under en inverterade Mikroskop och ta bilder vid olika tidpunkter (0 och 24 h).
- Mäta scratch stängning med hjälp av bild J programvara med hjälp av formeln:
Obs: Öppna scratch bilden med bilden J programvara. Rita en linje som har samma storleksordning som skalstapeln som redan finns i bilden. Klicka på analysera, ange skala och observera avståndet i bildpunkter som förstoringen av den ritade linjen. Skriva storleken på skalstapeln till den kända avstånd delen, ordna enhet (pixlar, cm, etc.) och klicka på ok. Gå till avsnittet analysera igen och klicka på mätningar. Detta ger första storleken på skalstapeln som den valda enheten. Klicka på ena kanten av scratch och dra tills de når den andra änden av scratch. Anteckna värdet för varje tidpunkt (0 h och 24 h). Koppla in dessa värden i formeln ovan och beräkna scratch stängningen.
5. cell Migration genom indirekt kontakt av cancerceller och DPSCs
- Seed 3 × 104 DPSCs på 24-väl plattan skär med 0,4 μm porstorlek och inkubera i en fuktad inkubator över natten vid 37 ° C.
- Utsäde PC-3 celler på 24-väl plattor på en cell densiteten av 5 × 10-4 och inkubera i en fuktad inkubator över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Klösa PC-3 celler med en steril 200 μL spets, ändra medium med färska medium och placera skär bär DPSCs på PC-3 celler.
- Observera celler under ett inverterat Mikroskop och ta bilder vid olika tidpunkter (0 och 24 h) att analysera cellmigration.
6. samarbete kultur Assay och Flow flödescytometri analys
- Etiketterar PC-3 celler och DPSCs med PKH67 (grön) och PKH26 (röd) fluorescerande cell linker färgämnen, respektive26.
- Trypsinize PC-3 och DPSCs celler, respektive. Ta bort medier från T-75 vävnadsodling kolv, tvätta med 2 mL PBS och tillsätt 2 mL av trypsin. Inkubera i 2 min i en inkubator vid 37 ° C med fuktad luft atmosfär och 5% CO2. Tillsätt 2 mL av komplett DMEM medium följt av 2 min inkubering hämma trypsin.
- Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min, Kassera supernatanten och återsuspendera cell pellets i den dye-lösning som beretts i spädningsvätskan-C buffert levereras av kit (se Tabell för material).
- Inkubera cellerna i dye lösningen i 10 min och avsluta färgning reaktionen genom att lägga till 100 µL av FBS. Centrifugera celler vid 300 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med komplett odlingsmedium innan samtidig odling.
- Plattan heter celler (5 × 10-4/väl) på 6-väl pläterar på 1:1 ratio (DPSCs: PC3). Upprätthålla samarbete odlade celler i komplett DMEM.
- Samla in celler efter 24- eller 48 h inkubation perioder genom centrifugering av celler vid 300 x g i 5 min och tvätt med PBS.
- Att resuspendera cellerna i 300 µL av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) buffert i 5 mL rund botten flöde flödescytometri rör. Vortex att skingra cell aggregat precis innan provanalys.
- Använd ett 100 µm munstycke med 45 psi slida tryck.
Obs: Extremt högt flöde kan minska känsligheten för fluorescens upptäckt. - Använd ofärgade kontroll och enda färgade celler för att justera lämpliga framåt och side scatter laser spänning för celltyper och ersättning som tidigare nämnts27.
Obs: Använd gating för levande celler för att utesluta cellfragment, döda celler eller aggregat. - Samla 10 000 händelser (100.000 är att föredra) för att fastställa procent positiva gröna DPSCs och röda PC-3 celler genom att arrangera FL-1 (grön) och FL-2 (röd) kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar allmänna MSC egenskaper DPSCs kultur villkor. DPSCs utöva fibroblast-liknande cellmorfologi efter plätering (figur 1B). MSC ytantigener (CD29, CD73, CD90, CD105 och CD166) uttrycks mycket medan hematopoetiska markörer (CD34 CD45 och CD14) är negativ (figur 1 c). Ändringar på morfologiska och molekylära nivå med osteo-, chondro- och adipo-genic differentiering kan observeras i DPSCs kultur följt av differentiering cocktail tillämpning (figur 1 d).
För att bestämma aktiviteten av utsöndrade molekyler från DPSCs på prostatacancer cell spridning och migration, tillämpat vi CM som samlas in från odlade dental stamceller och analyseras cancer cell spridning och flyttande beteende. CM behandling (20% v/v) valdes baserat på MTS cell livskraft analyser. PC-3 celler behandlas med stamceller CM utsattes för TUNEL assay och qPCR analyserna att bestämma cell död och apoptotiska förordning under kontroll och experimentella förhållanden. Vi slutsatsen att CM behandling ökade cellernas viabilitet och minskad celldöd i PC-3 cellodling. Ex vivo cell migration assay (scratch assay) utfördes för att utvärdera om CM av DPSCs påverkar PC-3 cancer cellmigration. Behandling med koncentrationerna av 10% och 20% CM (v/v) ökade scratch stängning avsevärt i jämförelse med kontrollgruppen på 24 h (figur 2). Likaså inducerad 20% CM (v/v) behandling uppreglering av extracellulär matrix protein genuttryck som kollagen I, Fibronektin och laminin, som spelar en betydande roll i cellmigration.
Vi använde två olika kultur tekniker för att etablera direkta och indirekta samtidig cellkulturer PC-3 och DPSCs ex vivo villkor. Trans-väl system valdes för att skapa en indirekt interaktion miljö för PC-3 cancerceller. PC-3 celler var seedad på undersidan av väl plattan och skär bär DPSCs placerades på toppen. Eftersom vi syftar till att generera en in-direkt interaktion, användes trans-väl membran med 0,4 μm porstorlek för att förhindra fysisk cell rörelse av DPSCs från den övre delen till nedre delen genom membranet. Utsöndrade molekyler från DPSCs ökade scratch stängningen av PC-3 celler betydligt jämfört med kontroll celler. PC-3 celler tillsammans odlade med DPSCs visat en 51% scratch stängning medan kontroll celler hade en 38% stängning efter 24 h (figur 3A). Direkt samarbete kulturer innehållande 1:1 förhållandet mellan DPSCs och PC-3 celler användes för att analysera självorganisering av stamceller och cancerceller. Cellerna var målat med röda och gröna membran färgämnen att skilja olika celltyper under mikroskop. PC-3 celler målat med röd fluorescens färgämne var omgivna av DPSCs i en tub-liknande struktur efter en 24 h inkubationstid. Tillsammans odlade cellerna färgas med fluorescerande färgämnen analyserades av flödescytometri baserat på fluorescens färgning och cell nyckeltal upptäcktes. DPSCs och PC-3 celler skapas en väl organiserad struktur som frodats PC-3 celler snabbt efter 48 h (figur 3B). Även om cellerna var seedad på ett lika förhållande (1:1) för direkt samarbete kultur, bestämdes 62.22% av PC-3 celler efter 48 h inkubation, som visar andelen högre spridning av PC-3 celler.
Figur 1: karakterisering av tandpulpan stamceller (DPSCs). (A) massa vävnad som erhållits från mitten av tanden. (B) Fibroblast-liknande cellmorfologi skalfördelar DPSCs. bar: 100 μm. (C) flöde flödescytometri analyser av DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 och CD 166 är positiva yta markörer, medan CD14, CD34, och CD45 är negativ yta markörer. NC: negativ kontroll (odlingsmedium behandlade celler). (D) differentiering av DPSCs till mesenkymala celltyper bekräftades med von Kossa färgning, Alcian blå färgning, och lipid droppar (skalstapeln: 200 μm). Osteocalcin, kollagen typ II (Col II), och fettsyra-bindande protein 4 (FABP4) immunostainings visade osteo - chondro- och adipogena differentiering av DPSCs. skalstapeln: 200 μm. Denna siffra är anpassade från Dogan o.a. 34. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: samling av villkoret medium (CM) från DPSCs för cell livskraft och scratch analyser. TUNEL positiva celler minskade med 20% CM (v/v) ansökan. Kvantitativ mätning av scratch stängning visade att CM ökad PC-3 cellmigration. CM: luftkonditionerade medium; NC: negativ kontroll (odlingsmedium behandlade celler). * P < 0,05. Denna siffra är anpassade från Dogan o.a. 34. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: metod för trans-väl cell migration assay och samtidig kultur. (A) PC-3 cell scratch stängning i trans-väl samtidig kultur systemet. (B) interaktion mönster av målat DPSCs (grön fluorescens) och PC-3 celler (röd fluorescens) efter 24 och 48 timmar av samtidig kultur (sådd förhållandet 1:1). Högre PC-3 cell nummer upptäcktes med avseende på DPSCs. skalstapeln: 200 μm. Denna siffra är anpassade från Dogan o.a. 34. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bidrag av MSCs till tumör miljö regleras av flera interaktioner inklusive hybrid cell generation via cell fusioner, entosis eller cytokin och chemokine aktiviteter mellan stamceller och cancer celler28. Strukturella organisationen, cell-cell interaktioner och utsöndrade faktorer avgör cancercellers beteende i form av tumör främjande, progression och metastaser till omgivande vävnad. Ordentlig ex vivo modellsystem att undersöka mekanismerna bakom växelverkan mellan bosatta cellpopulationer måste förstå mobilkommunikation för cancer progression och metastasering.
Vi används DPSCs för att skapa ett modellsystem för prostatacancer och dental stamceller interaktioner. Fördelen med denna typ av vuxna stamceller är tillgängligheten av vävnad källa och lätt isolering steg. Däremot, är med endast DPSCs utan jämförelse med välkända vuxna stamceller typer en begränsning av detta protokoll. Nuvarande samarbete kultur metoder kategoriseras in i direkta och indirekta tekniker som inkluderar parakrin signalering av lösliga utsöndrade molekyler och direkta kultur av olika cellpopulationer i samma miljö29,30, 31. CM fullt kännetecknas DPSCs användes för att utvärdera parakrin signalering medierad cancer celltillväxt i kultur. CM ansökan är den enklaste metoden för cell interaktionsstudier och möjliggör observation av lösliga medlare aktiviteter i systemet kultur. CM är inte fullt adekvat modellsystem, är CM ansökan som samtidig kultur metod mycket effektiv att iaktta cell-cell interaktioner ex vivo. CM av DPSCs ökade cellproliferation och migration av prostatacancerceller, som anger förvärvet av metastaserande fenotyp på grund av de faktorer som utsöndras från DPSCs.
En annan modell cell-cell interaktioner är inrättandet av en fysisk barriär som ett trans-väl membran mellan cell populationer30. Trans-väl system är indelade i två typer: de som gör att cellen rörelse genom porerna och de möjliggör överföring av utsöndrade faktorer när hindrar cellen kontakt genom membran samt. Vi brukade trans-brunnar med 0,4 μm porstorlek analysera stängningen av PC-3 repor, avslöjar cancer cell migration högre i gruppen DPSC jämfört med kontroll cellerna.
Även om CM och trans-väl baserat system är fördelaktiga för att enkelt analysera bidrag av en viss cell typ32, behövs direkt odling av olika subpopulations i samma miljö parallellt med indirekta samtidig kultur metoder. Baserat på sådd kan styras och strukturella organisationen av distinkta populationer kan enkelt analyseras genom direkt samarbete kultur av MSC med cancerceller. Vi använde 1:1 förhållandet mellan DPSCs och PC-3 celler målat med grön och röd fluorescens membran färgämnen, respektive. DPSCs omringade PC-3 celler och skapade en tub-liknande struktur i kultur brunnar. PC-3 celler bildas kluster i form av holmar omgiven av kanal-liknande strukturer genereras av DPSCs.
Nyligen, Brunetti et al. visade att DPSCs utsöndrar TNF-relaterade apoptos-inducerande ligand (TRAIL) under osteogent differentiering och påverkar myelom livskraft cancercell, som visar de möjliga interaktionerna av dental stamceller med cancer celler33. Vår studie är den första rapporten som utvärderar interaktioner av dental härledda MSCs och prostatacancerceller som ett ex vivo -modell. Vi använde tre olika indirekt tillvägagångssätt i våra experiment. Spridningen av cancerceller och hög migration priser upptäcktes antingen genom samtidig odling differentially genom CM och trans-väl analyser färgade celler som möjliggör flera interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Yeditepe universitet. Alla uppgifter och siffror som används i den här artikeln var tidigare publicerade34.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
