Summary
والهدف من هذا البروتوكول إظهار كيفية حمل الثغور متفاوت المسافات في cotyledons شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر بمحلول متوسطة المحتوية على السكر وكيفية مراقبة هياكل داخل الخلايا مثل المعايشة والليزر microtubules في الخلايا الحرس متفاوت المسافات باستخدام [كنفوكل] مجهرية.
Abstract
حركة stomatal يتوسط تبادل الغازات في النبات، هو أمر ضروري لعملية التمثيل الضوئي والرشح. ستوماتال فتح وإغلاق يتم إنجازه بزيادة كبيرة وانخفاض في حجم الخلية الحرس، على التوالي. نظراً لحدوث النقل المكوكية من الأيونات والماء بين خلايا الحرس وخلايا البشرة المجاورة أكبر أثناء حركة ستوماتال، يعتبر توزيع الثغور النباتية متباعدة توزيع أمثل لحركة ستوماتال. نظم تجريبية لزعزعة نمط متباعدة من الثغور مفيدة لدراسة أهمية على نمط تباعد. وقد حددت عدة الجينات الرئيسية المرتبطة بتوزيع ستوماتال متباعدة، والثغور متفاوت المسافات يمكن أن يتسبب تجريبيا بتغيير هذه الجينات. بدلاً من ذلك، يمكن أن يتسبب أيضا الثغور متفاوت المسافات بالعلاجات الخارجية دون التعديل الوراثي. في هذه المقالة، يصف لنا نظام تعريفية بسيطة الثغور متفاوت المسافات في شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. لدينا طريقة سهلة وتسري مباشرة على خطوط المحورة وراثيا أو المسخ. وترد المعايشة أكبر كعلامة مميزة خلية بيولوجية الناجمة عن السكروز خلايا الحرس متفاوت المسافات. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر صورة مجهرية [كنفوكل] ممثل microtubules القشرية كمثال للمراقبة داخل الخلايا من خلايا الحرس متفاوت المسافات. يتم الاحتفاظ باتجاه شعاعي microtubules القشرية في مجمع الحرس الخلايا كما هو الحال في خلايا الحرس متباعدة في ظروف السيطرة.
Introduction
ستوما النباتات جهازا أساسيا لتبادل الغازات لعملية التمثيل الضوئي والرشح، وهو إنجاز حركة ستوماتال بتغييرات كبيرة في خلايا الحرس عن طريق امتصاص أيون يحركها والإفراج عن المياه. تحت مجهر، يمكننا أن نلاحظ نمط توزيع متباعدة من الثغور على أسطح الأوراق والسيقان. ويعتبر هذا التوزيع متباعدة من الثغور للمساعدة في حركة ستوماتال، والتي يتم تنظيمها بواسطة تبادل الأيونات والماء بين خلايا الحرس والمجاورة لخلايا البشرة1،2. نظم تعريفية تجريبية الثغور متفاوت المسافات مفيدة للتحقيق أهمية توزيع الثغور متباعدة.
وأفيد أن التكتل المكاني من الثغور يمكن أن يتسبب بالتعديل الوراثي للجينات الرئيسية لحراسة الخلية التمايز3،4 أو العلاج مركب الكيميائي5. كذلك أبلغنا أن تستكمل العلاج الغمر بمحلول متوسطة مع السكريات بما في ذلك السكروز، الجلوكوز، وتسبب سكر تجميع ستوماتال في كوتيليدونس من شتلات نبات التمويل 6. ولوحظ كالوسي انخفاض في جدران الخلايا الجديدة فصل ميريستيمويدس وخلايا البشرة في البشرة المعالجة السكروز كوتيليدون، مما يوحي بأن السكروز الحل الغمر العلاج يؤثر سلبا على جدار الخلية، مما يمنع التسرب و العمل خارج الرحم من منتجات الجينات الرئيسية لتمايز خلية الحرس (مثل عوامل النسخ) نحو المتاخمة البشرة الخلايا6. واقترح إليه مماثلة من الدراسات على gsl8/تشور طفرات7،8. لدينا نظام تجريبي لاستنساخه بتحريض من الثغور متفاوت المسافات باستخدام الحلول المتوسطة التي تحتوي على السكروز سهلة ورخيصة جداً. يمكن استخدامه أيضا التحقيق فيها الهياكل داخل الخلايا مثل العضيات وسيتوسكيليتون في خلايا الحرس متفاوت المسافات عند تطبيقه على خطوط المعدلة وراثيا معربا عن علامات نيون أن تسمية هياكل داخل الخلايا9، 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد موراشيجي 1/2-سكوغ متوسطة 3% الحل التي تحتوي على السكروز
- إضافة 1.1 غ أملاح Murashige سكوغ المتوسطة و 15 ز السكروز إلى كوب.
- إضافة 490 مل ماء المقطر ويخلط جيدا باستخدام شريط إثارة.
- قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.8 استخدام كوه.
- نقل الحل في زجاجة متوسطة وتمييع إلى 500 مل بالماء المقطر.
- تعقيم الحل بالتعقيم (121 درجة مئوية، 20 دقيقة). إذا لم تستخدم مباشرة، قد أبقى هذا الحل في 4 درجات مئوية بعد التعقيم.
2-تنظيم دورات تعريفية الثغور متفاوت المسافات التي تحتوي على السكروز الحل المتوسط الغمر العلاج
- تعقيم البذور.
- إعداد الحل التعقيم بإضافة 500 ميليلتر من 5% كلور نشط الحل ناكلو و 1 ميليلتر من 10% X-100 تريتون إلى 500 ميليلتر الماء المعقم.
- ضع ca. 50 المعدلة وراثيا بذور التمويل (أ) تحمل علامة نيون مثل CT-التجارة والنقل11 أو12 من TUB6 التجارة والنقل في أنبوب 1.5 مل.
- أضف 1 مل من محلول الإيثانول 70% ومزيج جيد بعكس خمس مرات. إجازة لمدة 1 دقيقة.
- سوف تنزل البذور إلى الجزء السفلي من الأنبوب. على مقاعد البدلاء نظيفة، بلطف إزالة الإيثانول 70% استخدام ميكروبيبيتي، وإضافة 1 مل من محلول التعقيم. مزيج جيد من قبل عكس خمس مرات، وتترك لمدة 5 دقائق.
- تغسل البذور. لا تزال تعمل تحت ظروف معقمة على مقاعد البدلاء نظيفة، بلطف إزالة الحل باستخدام ميكروبيبيتي، وإضافة 1 مل الماء المعقم. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
- إضافة 1.5 مل من تعقيم 3% يحتوي على السكروز 1/2 Murashige سكوغ المتوسط محلول لكل بئر من صفيحة 24-جيدا على مقاعد البدلاء نظيفة.
- إضافة اثنين من بذور معقمة في كل بئر. الشريط غطاء على لوح 24-جيدا باستخدام طبقتين من بارافيلم.
- نقل لوحة 24-جيدا لمجموعة دائرة نمو عند 23.5 درجة مئوية مع دورة الضوء الظلام 12-ح/12-ح استخدام µmol 100 م2 ق1 بيضاء خفيفة واحتضان لمدة 14 يوما.
3-الملاحظة مجهرية من الثغور متفاوت المسافات
- ميليلتر مكان 30 3% التي تحتوي على السكروز 1/2 Murashige سكوغ المتوسطة الحل من بئر لصفيحة 24-جيدا في وسط شريحة زجاجية (الحجم: 76 × 26 مم، سمك: 1.0-1.2 مم).
- إزالة كوتيليدون من شتلات عمره 14 يوما استخدام مقص تشريح. تطفو في كوتيليدون مع الجانب المراقبة مواجهة على إسقاط الحل.
- تحضير العينة كوتيليدون وفقا لأن الأسلوب السابق13. أساسا، بوضع 30 ميليلتر من الحل في وسط الزجاج غطاء (حجم: 18 × 18 مم، سمك: 0.12-0.17 ملم). اقلب الزجاج غطاء ووضعه على كوتيليدون برفق. تمحو الزائد المخزن المؤقت باستخدام أنسجة خالية من الوبر.
- تعيين عينة على مرحلة مجهر الليزر [كنفوكل] وحدد خلايا الحرس متفاوت المسافات للمراقبة باستخدام الإضاءة الحقل مشرق.
- الحصول على الصور [كنفوكل] هياكل داخل الخلايا فلوريسسينتلي توسم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، تم عرض البروتوكول المتعلق بأسلوب بسيط لحمل المجموعات ستوماتال مع الحل المتوسطة التي تحتوي على السكروز في التمويل ألف شتلة. خلايا الحرس متفاوت المسافات نمت في الحل المتوسط الذي يحتوي على السكروز (الشكل 1ب) لها المعايشة أكبر من خلايا الحرس نمت في ظروف خالية من السكروز التحكم (الشكل 1أ). وأكد توسيع المعايشة مع الأشعة المقطعية-التجارة والنقل11، وعلامة ستروما بلاستيدات الخضراء، والكلوروفيل أوتوفلوريسسينسي (الشكل 1ج-F)، مما يوحي بأن المعاملة السكروز أسفر عن تراكم الحبوب النشا في الجبيلة عبر السكروز حل الامتصاص. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت المراقبة [كنفوكل] للتجارة والنقل-TUB612 أن ميكروتوبوليس القشرية موجه إشعاعيا حتى في معاملة السكروز مجمع الحرس الخلايا، مثل تلك الموجودة في خلايا الحرس متباعدة في ظروف خالية من السكروز التحكم (الشكل 2). هذه الملاحظات توحي بأن الخلايا التي يسببها السكروز الحرس متفاوت المسافات اتجاه طبيعي microtubules القشرية و microfibrils السليلوز لتمكين فتح stomatal استجابة لمنبهات البيئة9.
الشكل 1 : المعايشة في مجمع الحرس الخلايا تعامل مع الحل المتوسطة التي تحتوي على السكروز. حقل مشرق (أ، ب)وعلامة ستروما بلاستيدات الخضراء CT-التجارة والنقل (ج، د)والكلوروفيل أوتوفلوريسسينسي الصور (ه، و) خلايا الحرس نمت في ظروف السكروز الشروط (أ، ج، ه) و 3% (ب، د، و)التحكم خالية من السكر. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : ميكروتوبوليس القشرية في مجمع الحرس الخلايا تعامل مع محلول السكروز. شروط microtubules القشرية المسمى مع بروتينات فلورية خضراء-TUB6 guard cells في التحكم خالية من السكر (A) وخلايا الحرس متفاوت المسافات في السكروز 3% (ب). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد قدمنا البروتوكولات لتحريض الثغور متفاوت المسافات في التمويل ألف شتلة بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. كما هو موضح هنا، هذا الأسلوب بسيط جداً ويتطلب أي مهارة متخصصة لكن يمكن حمل كفاءة الثغور متفاوت المسافات. تتجمع أكثر من 45 في المائة خلايا الحرس مع 3% السكروز المحتوية على الحل المتوسط (قيم المتوسط الحسابي للملاحظات مستقلة أكثر من 20)6. وعلاوة على ذلك، هذا النظام التجريبي يمكن تطبيقها مباشرة على خطوط المحورة وراثيا أو متحولة كما هو موضح لخطوط المعدلة وراثيا معربا عن الأشعة المقطعية-التجارة والنقل (الشكل 1) أو بروتينات فلورية خضراء-TUB6 (الشكل 2). على الرغم من أن يتم عرض صور اللقطة فقط هنا، أيضا سيكون من الممكن لتنفيذ الملاحظات مرة متتالية خلال التنمية stomatal.
لاحظ أن هذا الأسلوب يستند علاج اكسوجينيوس اصطناعية، حيث لا يمكننا أن نستبعد احتمال أن الظواهر التي لا تتصل مباشرة بتوزيع stomatal سببها السكروز الحل الغمر العلاج. في الواقع، يتم توسيع الخلية حراسة المعايشة بالمعاملة (الشكل 1). قد يكون هذا بسبب تراكم الحبوب النشا في استيعاب الحل عن طريق المعايشة السكروز. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أصغر فتحه ستوماتال في خلايا الحرس متفاوت المسافات التي يسببها السكروز9، مما يوحي بأن الإجهاد الملين السكروز بوساطة قمعت فتح ستوماتال. ومع ذلك، استمر اتجاه شعاعي microtubules القشرية (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، يزيد الفتحة stomatal خلايا الحرس متفاوت المسافات إلى حد كبير استجابة للعلاج فوسيكوكسين، كما في حالة الثغور متباعدة9. وهكذا، على الرغم من أنه سيكون من الضروري أن نحكم بدقة ما إذا كان هذا النظام النموذج التجريبي مفيد تبعاً لأغراض البحث الخاصة بك، نظامنا سيوفر المعلومات الثاقبة بشأن العلاقة بين توزيع ستوماتال والاستجابة.
وكما ذكر في المقدمة، قد يخفض السكر الحل العلاج سلامة جدار الخلية، أسفر عن تسرب منتجات الجينات الرئيسية للتمايز ستوماتال (مثل عوامل النسخ) إلى خلايا البشرة المجاورة. ونحن نفترض أن التعريب حمل خارج الرحم التي يسببها السكروز من هذه المنتجات الجينات يسبب الثغور متفاوت المسافات. ومع ذلك، هذه فرضية عمل غير معتمدة بما فيه الكفاية من الأدلة البيولوجية الجزيئية. الكشف عن طفرات غير متحسسة للسكر سيكون وسيلة واعدة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء السكر الناجمة عن حل stomatal التكتل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للبروفيسور سيشيرو هاسيزاوا على دعمه الكريم لعملنا. أيد هذا العمل المنح المقدمة من "الجمعية اليابانية" لأرقام كاكينهجرانت النهوض بالعلوم (JSPS) 17 ك 19380 ومنح 18 ح 05492، من مؤسسة سوميتومو للحصول على منح "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" رقم 160146، و "مؤسسة كانون" T.H. ووضعت هذا النظام التجريبي تحت دعم المالي من عدد كاكينهجرانت JSPS 26891006 إلى أ. ك. ونحن نشكر روبي لويس، ماجستير، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
