Summary
O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.
Abstract
Movimento estomático Medeia troca gasosa planta, que é essencial para a fotossíntese e transpiração. Estomática de abertura e fechamento são realizados por um significativo aumento e diminuição do volume das células de guarda, respectivamente. Porque o transporte de transporte de íons e água ocorre entre as células guarda e células epidérmicas vizinhas maiores durante o movimento estomático, espaçada distribuição dos estômatos da planta é considerada uma distribuição ideal para o movimento estomático. Sistemas experimentais para perturbar o espaçamento padrão dos estomas são úteis para examinar o significado do padrão de espaçamento. Foram identificados vários genes chaves associados à distribuição estomática espaçada, e estômatos em cluster podem ser induzidos experimentalmente, alterando estes genes. Alternativamente, estomas em cluster podem ser também induzidas por tratamentos exógenos sem modificação genética. Neste artigo, descrevemos um sistema simples de indução para estomas clusterizados em plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Nosso método é fácil e diretamente aplicável às linhas transgénicas ou mutantes. Cloroplastos maiores são apresentados como uma célula biológica marca registrada de induzida em sacarose clusterizadas células guarda. Além disso, uma imagem microscópica confocal representativa de microtúbulos corticais é mostrada como um exemplo de observação intracelular de células de guarda em cluster. A orientação radial de microtúbulos corticais é mantida nas células de guarda em cluster como em células de guarda espaçadas em controlar as condições.
Introduction
O estoma de planta é um órgão essencial para a troca de gás para a fotossíntese e a transpiração e movimento estomático é realizado por mudanças significativas nas células de guarda a íon-driven captação e liberação de água. Sob um microscópio, podemos observar um padrão de distribuição espaçada de estômatos nas superfícies das folhas e caules. Esta distribuição espaçada de estomas é considerada para ajudar o movimento estomático, que é regulamentado pela troca de íons e água entre as células guarda e vizinhos células epidérmicas1,2. Sistemas de indução experimental de estomas em cluster são úteis para investigar a importância da distribuição espaçada dos estomas.
Tem sido relatado que a aglomeração espacial dos estomas pode ser induzida por modificação genética de genes-chave de3,de diferenciação celular guarda4 ou o tratamento com um composto químico5. Também informamos que tratamento de imersão com uma solução meio suplementado com açúcares, incluindo a sacarose, glicose, e frutose causou clusters estomática em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana 6. Callose reduzida em novas paredes celulares separando meristemoids e células epidérmicas foi observada na epiderme cotilédone tratados com sacarose, sugerindo que o tratamento de imersão de solução de sacarose afeta negativamente a parede celular, que impede o escapamento e ação ectópica de produtos do gene chave para diferenciação de célula guarda (por exemplo, fatores de transcrição) em direção ao lado epidérmica células6. Um mecanismo semelhante foi sugerido de estudos sobre gsl8/chor mutantes7,8. Nosso sistema experimental para indução pode ser reproduzido dos estomas em cluster usando sacarose, contendo solução média é bastante fácil e barato. Também pode ser usada para investigar as estruturas intracelulares como organelas e o citoesqueleto nas células guarda em cluster quando aplicado às linhas transgênicas expressando marcadores fluorescentes que rótulo estruturas intracelulares9, 10.
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Protocol
1. preparação da solução médio de 1/2 Murashige-Skoog 3% sacarose, contendo
- Adicione 1,1 g de sais médios Murashige-Skoog e 15 g de sacarose para um copo.
- Adicione 490 mL de água destilada e misture bem, usando uma barra de agitação.
- Ajuste o pH a 5.8 usando KOH.
- Diluir para 500 mL com água destilada e transferir a solução para um frasco médio.
- Esterilize a solução por autoclave (121 ° C, 20 min). Se não usado imediatamente, esta solução pode ser mantida a 4 ° C após a esterilização.
2. indução de estomas agrupadas por sacarose, contendo solução médio tratamento de imersão
- Esterilize as sementes.
- Preparar a solução de esterilização adicionando 500 µ l de cloro ativo 5% solução de NaClO e 1 µ l de 10% Triton X-100 de água estéril de 500 µ l.
- Coloque ca. 50 transgênicos sementes da . thaliana carregando um marcador fluorescente como CT-GFP11 ou GFP-TUB612 em um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 1 mL de solução de etanol 70% e misturar bem invertendo-se cinco vezes. Deixe por 1 min.
- As sementes vão afundar até o fundo do tubo. Sobre uma bancada limpa, suavemente remover o etanol 70%, utilizando uma micropipeta e adicionar 1 mL de solução de esterilização. Misture bem invertendo-se cinco vezes e deixar por 5 min.
- Lave as sementes. Ainda trabalhando sob condições assépticas em uma bancada limpa, suavemente remover a solução usando uma micropipeta e adicionar 1 mL de água estéril. Repita essa etapa cinco vezes.
- Adicione 1,5 mL de 3% de sacarose, contendo 1/2 Murashige-Skoog média solução esterilizada a cada poço de uma placa de 24 sobre uma bancada limpa.
- Adicione duas sementes esterilizadas para cada poço. Fita a tampa sobre a placa de 24 usando duas camadas de parafilme.
- Transferir a placa de 24 para um conjunto de câmara de crescimento a 23,5 ° C, com um ciclo de claro-escuro de 12/12-h-h usando 100 µmol m− 2 s− 1 branco luz e incubar durante 14 dias.
3. observação microscópica dos estomas em cluster
- Lugar 30 µ l de 1/2 3% de sacarose, contendo Murashige-Skoog média solução de um poço da placa 24-bem no centro de uma lâmina de vidro (tamanho: 76 × 26 mm, espessura: 1.0-1.2 mm).
- Remova um cotilédone de uma muda de 14 dias de idade com uma tesoura de dissecação. Flutue o cotilédone com o lado de observação voltada para cima sobre a gota de solução.
- Prepare a amostra de cotilédone de acordo com nossos anteriores método13. Essencialmente, coloque 30 µ l da solução no centro de uma tampa de vidro (tamanho: 18 × 18 mm, espessura: 0,12-0,17 mm). Vire o tampa de vidro e coloque-o delicadamente sobre o cotilédone. Limpe o excesso buffer usando um pano livre de fiapos.
- Definir um espécime no palco de um microscópio confocal laser e selecionar as células de guarda em cluster para observação usando iluminação de campo claro.
- Adquira imagens confocal de estruturas intracelulares fluorescente rotuladas de acordo com as instruções do fabricante do microscópio.
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Representative Results
Aqui, foi apresentado o protocolo para um método simples de induzir estomática clusters com sacarose, contendo solução média em mudas da . thaliana . As células de guarda em cluster cultivadas em solução média contendo sacarose (Figura 1B) possuem cloroplastos maiores que guarda cultivados em condições de controle isento de sacarose (Figura 1A). O alargamento dos cloroplastos foi confirmado com CT-GFP11, um marcador de estroma do cloroplasto e autofluorescência de clorofila (Figura 1C-F), sugerindo que o tratamento de sacarose resultou em acúmulo de grãos de amido na cloroplastos através de sacarose solução absorção. Além disso, observação confocal de GFP-TUB612 revelou que os microtúbulos corticais foram radialmente orientados mesmo em tratados com sacarose em cluster guarda células, como nas células de guarda espaçadas em condições de controle isento de sacarose (Figura 2). Estas observações sugerem que as células de guarda em cluster induzida em sacarose têm uma orientação normal por microtúbulos corticais e microfibrilhas de celulose para permitir a abertura estomática em resposta a sinais ambientais9.
Figura 1 : Cloroplastos nas células de guarda em cluster tratadocom com solução de médio contendo sacarose. Campo claro (A, B), marcador de estroma do cloroplasto CT-GFP (C, D)e clorofila autofluorescência (E, F) imagens de guarda células cultivadas em condições de sacarose de condições (A, C, E) e 3% de controle sem açúcar (B, D, F). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Microtúbulos corticais em cluster guarda células tratadocom com solução de sacarose. Condições de microtúbulos corticais rotulados com GFP-TUB6 de guard cells no controle do açúcar (A) e células de guarda em cluster em 3% de sacarose (B). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos protocolos para indução dos estomas em cluster em mudas da . thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Como mostrado aqui, esse método é muito simples e não requer nenhuma habilidade especializada mas eficiente pode induzir estomas em cluster. Mais de 45% das células guarda estão agrupadas com 3% de sacarose, contendo solução média (valores médios de mais de 20 observações independentes)6. Além disso, este sistema experimental pode diretamente ser aplicado às linhas transgénicas ou mutantes como mostrado por linhas transgênicas expressando CT-GFP (Figura 1) ou GFP-TUB6 (Figura 2). Embora apenas imagens de instantâneo são mostradas aqui, também seria possível realizar observações sequencial de tempo durante o desenvolvimento estomático.
Observe que esse método é baseado em um tratamento de exogeneous artificial, assim não podemos excluir a possibilidade de fenômenos que não estão diretamente relacionados com a distribuição estomática são causados por tratamento de imersão de solução de sacarose. Na verdade, célula guarda cloroplastos são ampliados pelo tratamento (Figura 1). Isto pode ser devido ao acúmulo de grãos de amido na captação de solução cloroplastos através de sacarose. Além disso, observou-se uma menor abertura estomática na induzida em sacarose clusterizado guarda células9, sugerindo que o estresse mediada por sacarose hiper-osmóticos suprimido abertura estomática. No entanto, a orientação radial de microtúbulos corticais foi mantida (Figura 2). Além disso, a abertura estomática das células guarda em cluster aumenta significativamente em resposta ao tratamento fusicoccin, como no caso dos estomas espaçadas9. Assim, embora seja necessário avaliar cuidadosamente se este sistema de modelo experimental é útil dependendo de seus propósitos de pesquisa, nosso sistema forneceria informação esclarecedora sobre a relação entre distribuição estomática e a resposta.
Como mencionado na introdução, o tratamento da solução de açúcar pode diminuir a integridade da parede celular, resultando em vazamento de produtos de genes chave para diferenciação estomática (por exemplo, fatores de transcrição) de células epidérmicas adjacentes. Partimos do princípio que a localização ectópica induzida em sacarose destes produtos do gene causa estomas em cluster. No entanto, esta hipótese de trabalho não é suficientemente suportado pela evidência biológica molecular. Triagem para diferenciação de açúcar mutantes seria um caminho promissor para esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes açúcar induzida por solução estomática cluster.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nós estamos gratos ao Prof Seiichiro Hasezawa pelo seu apoio gentil do nosso trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHgrant números 17 19380 K e 18 H 05492, da Fundação de Sumitomo para um subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica conceder número 160146 e a Fundação da Canon a T.H. Este sistema experimental foi desenvolvido sob um apoio financeiro do número JSPS KAKENHgrant 26891006 para K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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