Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.
Abstract
Movimiento estomático media intercambio del gas de la planta, que es esencial para la fotosíntesis y la transpiración. Apertura estomática y el cierre se logran por un aumento significativo y disminución en el volumen de la célula de guardia, respectivamente. Porque transporte transporte de iones y de agua se produce entre las células del protector y las células epidérmicas vecinas más grandes durante el movimiento estomático, la distribución espaciada de los estomas de la planta se considera una distribución óptima para el movimiento estomático. Sistemas experimentales para perturbar el patrón espaciado de estomas son útiles para examinar la importancia del patrón de espaciamiento. Se han identificado varios genes principales asociados con la distribución estomática espaciada y estomas agrupados pueden ser inducidas experimentalmente mediante la alteración de estos genes. Por otra parte, estomas agrupados pueden ser también inducidas por tratamientos exógenos sin modificación genética. En este artículo, describimos un sistema de inducción simple para estomas agrupados en Arabidopsis thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Nuestro método es fácil y directamente aplicables en líneas transgénicas o mutantes. Cloroplastos más grandes se presentan como un sello biológico celular de células de guardia agrupados inducida por sacarosa. Además, una imagen microscopio confocal representativa de los microtúbulos corticales se muestra como un ejemplo de observación intracelular de células agrupadas de guardia. Se mantiene la orientación radial de los microtúbulos corticales en agrupado células de guardia como en las células de guardia espaciadas en condiciones de control.
Introduction
El estoma de la planta es un órgano esencial para el intercambio de gases para la fotosíntesis y la transpiración, y movimiento estomático se logra por cambios significativos en las células del protector a través de la absorción de iones y la liberación de agua. Bajo el microscopio, se observa un patrón de distribución espaciada de estomas en la superficie de hojas y tallos. Esta distribución espaciada de estomas se considera a movimiento estomático, que está regulado por el intercambio de iones y agua entre las células de guardia y los vecinos de las células epidérmicas1,2. Inducción experimental para estomas de clusters son útiles para investigar la importancia de la distribución espaciada de estomas.
Se ha reportado que el agrupamiento espacial de los estomas puede ser inducida por modificación genética de los genes clave para protector de celular diferenciación3,4 o tratamiento con un compuesto químico5. También nos informan que el tratamiento de inmersión con una solución de medios complementadas con azúcares como sacarosa, glucosa, y fructosa causada agrupamiento estomático en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana 6. Reducción callosa en las paredes celulares de nuevo separar meristemoides y las células epidérmicas se observó en la epidermis de cotiledón tratado con sacarosa, lo que sugiere que el tratamiento de inmersión en solución de sacarosa afecta negativamente la pared celular, que impide la fuga y acción ectópico de productos gen clave para la diferenciación de protector de la célula (e.g. factores de transcripción) hacia el lado epidérmico células6. Un mecanismo similar fue sugerido de estudios gsl8/chor mutantes7,8. Nuestro sistema experimental para la inducción reproducible de estomas agrupados utilizando solución de medio que contiene la sacarosa es bastante fácil y barato. También puede ser utilizado para investigar las estructuras intracelulares como orgánulos y el citoesqueleto en las células de guardia agrupados cuando se aplica a líneas transgénicas expresando marcadores fluorescentes que etiqueta las estructuras intracelulares9, 10.
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Protocol
1. preparación de medio solución de 3% que contengan sacarosa 1/2 Murashige-Skoog
- Añadir 1,1 g de sales medio Murashige-Skoog y 15 g de sacarosa en un vaso.
- Añadir 490 mL de agua destilada y mezclar bien con una barra de agitación.
- Ajustar el pH a 5,8 con KOH.
- Diluir a 500 mL con agua destilada y transferir la solución en una botella mediana.
- Esterilizar la solución por autoclave (121 ° C, 20 min). Si no se utiliza inmediatamente, esta solución puede conservarse a 4 ° C después de la esterilización.
2. inducción de estomas agrupados por que contengan sacarosa solución medio tratamiento de inmersión
- Esterilizar las semillas.
- Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 μl de 5% de cloro activo solución de NaClO y 1 μl de 10% Tritón X-100 a 500 μl de agua estéril.
- Colocar aprox. 50 transgénicos semillas de a. thaliana llevando un marcador fluorescente GFP CT11 como GFP-TUB612 en un tubo de 1,5 mL.
- Añadir 1 mL de solución de etanol 70% y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 minuto.
- Las semillas se hundirán hasta el fondo del tubo. En una mesa de trabajo limpia, suavemente Quite el etanol al 70% usando una micropipeta y añadir 1 mL de solución de esterilización. Mezclar bien por inversión del tubo cinco veces y dejar durante 5 minutos.
- Lave las semillas. Sigue trabajando bajo condiciones asépticas en un banco limpio, suavemente retirar la solución con una micropipeta y añadir 1 mL de agua estéril. Repita este paso cinco veces.
- Añadir 1,5 mL de esterilizado que contenga sacarosa 1/2 Murashige-Skoog medio solución de 3% en cada pocillo de una placa de 24 pocillos en una mesa de trabajo limpia.
- Añadir dos semillas esterilizadas en cada pozo. Cinta de la tapa sobre la placa de 24 pocillos usando dos capas de parafilm.
- Transferencia de la placa de 24 pocillos a un conjunto de cámara de crecimiento a 23,5 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12-h/12-h con 100 μmol m−2 s−1 blanca luz e incubar durante 14 días.
3. microscopio Observación de estomas agrupados
- Lugar 30 μl de solución 3% sacarosa que contiene 1/2 Murashige-Skoog medio de un pozo de la placa de 24 pozos en el centro de un portaobjetos de vidrio (tamaño: 76 x 26 mm, grueso: 1.0-1.2 mm).
- Quitar un cotiledón de una plántula de 14 días de edad con unas tijeras de disección. Flotar el cotiledón con la observación hacia arriba en la gota de la solución.
- Prepare la muestra de cotiledón según nuestra anterior método13. Esencialmente, coloque 30 μl de la solución en el centro de una cubierta de vidrio (tamaño: 18 × 18 m m, grueso: 0.12-0.17 mm). Voltee el vidrio de la cubierta y colóquela suavemente sobre el cotiledón. Limpie el exceso de tampón usando un paño libre de pelusas.
- Configure a un espécimen en el escenario de un microscopio láser confocal y seleccione agrupadas protector de las células para la observación con iluminación de campo claro.
- Adquirir imágenes confocales de fluorescencia con estructuras intracelulares según instrucciones del fabricante del microscopio.
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Representative Results
Aquí, se presenta el protocolo para un simple método de inducir agrupamiento estomático que contengan sacarosa solución media en a. thaliana plántulas. Las células de guardia agrupadas en solución media que contienen sacarosa (figura 1B) tienen más cloroplastos que el protector de las células cultivadas en condiciones de control libre de sacarosa (figura 1A). La ampliación de los cloroplastos fue confirmada con CT-GFP11, un marcador de tejido conectador del cloroplasto y la autofluorescencia de la clorofila (figura 1C-F), sugiriendo que tratamiento con sacarosa dio lugar a la acumulación de granos de almidón en la cloroplastos vía sacarosa solución la absorción. Además, observación confocal de GFP-TUB612 reveló que los microtúbulos corticales eran radialmente orientados incluso en sacarosa agrupadas protector células tratadas, como los de espaciados protector de las células en condiciones de control libre de sacarosa (figura 2). Estas observaciones sugieren que las células de guardia agrupadas sacarosa inducida tienen una orientación normal de microtúbulos corticales y microfibrillas de celulosa para permitir la apertura estomatal en respuesta a señales ambientales9.
Figura 1 : Cloroplastos en clusters protector de las células trataron con solución medio que contengan sacarosa. Campo brillante (A, B), marcador de tejido conectador del cloroplasto CT-GFP (C, D)y (clorofila Autofluorescencia E, F) imágenes de protector de las células cultivadas en condiciones (A, C, E) y el 3% de control sin azúcar sacarosa las condiciones (B, D, F). Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Microtúbulos corticales en clusters protector de las células trataron con solución de sacarosa. Los microtúbulos corticales con GFP-TUB6 de guard cells en el control sin azúcar (A) y las células de guardia agrupadas en 3% de sacarosa condiciones (B). Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos presentado los protocolos para la inducción de estomas agrupados en a. thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Como se muestra aquí, este método es muy simple y no requiere ninguna habilidad especializada pero puede inducir eficientemente estomas agrupados. Más del 45% de las células de guarda son agrupado con 3% que contiene sacarosa solución medianas (valores promedio de más de 20 observaciones independientes)6. Por otra parte, este sistema experimental puede ser aplicada directamente a líneas transgénicas o mutantes como se muestra por líneas transgénicas expresando CT-GFP (figura 1) o GFP-TUB6 (figura 2). Aunque aquí se muestran sólo imágenes, también sería posible realizar observaciones tiempo alternativamente durante el desarrollo estomática.
Tenga en cuenta que este método se basa en un tratamiento de aproximación artificial, por lo que no podemos excluir la posibilidad de que los fenómenos que no están directamente relacionados con la distribución estomática son causados por el tratamiento de inmersión en solución de sacarosa. De hecho, protector celular cloroplastos están agrandados por el tratamiento (figura 1). Esto puede ser debido a la acumulación de granos de almidón en la cloroplastos vía sacarosa solución de la absorción. Además, una menor apertura estomática se observó en la inducida por sacarosa agrupado células de guardia9, sugiriendo que estrés mediada por sacarosa hiperosmóticos había suprimido apertura estomática. Sin embargo, la orientación radial de los microtúbulos corticales fue mantenida (figura 2). Además, la apertura estomática de las células de guardia agrupadas aumenta significativamente en la respuesta al tratamiento fusicoccin, como en el caso de estomas separados9. Así, aunque es preciso juzgar cuidadosamente si este sistema de modelo experimental es útil dependiendo de sus propósitos de investigación, nuestro sistema de proporcionar valiosa información acerca de la relación entre distribución estomática y la respuesta.
Como se mencionó en la introducción, tratamiento de solución de azúcar puede disminuir la integridad de la pared celular, dando por resultado la salida de los productos gen clave para la diferenciación estomática (e.g. factores de transcripción) a las células epidérmicas adyacentes. Asumimos que la localización ectópica de estos productos del gen inducida por sacarosa provoca estomas agrupados. Sin embargo, esta hipótesis de trabajo no está suficientemente apoyada por evidencia biológica molecular. Detección de mutantes insensibles azúcar sería un camino prometedor para aclarar los mecanismos moleculares subyacentes agrupamiento estomático inducido por solución de azúcar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Prof. Seiichiro Hasezawa su amable apoyo de nuestro trabajo. Este trabajo fue financiado por donaciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHgrant números 19380 K 17 y 18 H 05492, desde la Fundación de Sumitomo para una subvención para proyectos de investigación de ciencia básica otorgar número 160146 y la Fundación de Canon a T.H. Este sistema experimental fue desarrollado bajo un apoyo financiero desde el número de las páginas JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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