Summary
微酸度皿中放射性标记细菌培养物的生长有助于高通量采样,从而允许对核苷酸池丰度进行多种技术和生物复制检测,包括 (p) ppGpp。可以监测生理压力来源引起的生长转变以及压力恢复的影响。
Abstract
(p)ppGpp核苷酸作为细菌的全球调节器,对各种物理和营养压力作出反应。它有一个快速的开始,在几秒钟内,这导致积累的水平接近或超过的GTP池的水平。应力反转场合迅速消失(p)ppGpp,通常半寿命不到一分钟。(p)ppGpp的存在导致细胞基因表达和代谢的改变,以对抗压力的破坏性影响。革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌有不同的反应机制,但都取决于(p)ppGpp浓度。在任何情况下,都需要同时监测许多放射性标记细菌培养物的时间间隔,在临界应力过渡期间,时间间隔可能从 10 秒到数小时不等。此协议解决了这一技术难题。该方法利用温度和摇摇控制微酸盐培养箱,允许平行监测生长(吸收)和均匀磷酸盐放射性标记培养物的快速采样,通过PEI纤维素上的薄层色谱。分析的多重技术和生物复制需要少量样品。复杂的增长过渡,如二次增长和快速(p)ppGpp周转率可以通过这种方法进行定量评估。
Introduction
(p)ppGpp第二信使是一个全球调节器,调节大量基因的表达,包括用于合成核糖体和氨基酸1、2的基因。虽然最初发现在大肠杆菌3,(p)ppGpp可以发现在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,以及在植物叶绿体4,5。对于大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌,(p)ppGpp在6、7、8两个不同位点与RNA聚合酶直接相互作用。在革兰氏阳性,(p)ppGpp抑制GTP丰度,这是由CodY,一种GTP结合蛋白与基因特异性DNA识别主题,导致调控9,10。(p)ppGpp积累,以回应饥饿的不同营养和压力条件,导致缓慢生长和调整基因表达,使适应压力11,12。
ppGpp累积的净量反映了合成酶和水酶活动之间的平衡。在大肠杆菌RelA是一种强合成酶和SpoT是双功能,具有强水酶和弱合成酶,其中每一种可能以不同的方式调节在应力依赖的方式。强RelA合成酶被激活时,通币指定的带电tRNA绑定到核糖体A位点时,它未能跟上蛋白质合成13,14,15的需求。弱孢子(p)ppGpp合成酶被激活,而强(p)ppGpp水解酶被抑制,以响应其他应力条件并通过其他机制。在某些情况下,ACP或Rsd等蛋白质可以结合到SpoT,这也改变了水解和合成16、17之间的平衡。在革兰氏阳性物中,合成和水解反映了单一RelA SpoT同源(RSH)蛋白之间更复杂的平衡,具有很强的合成和水解活性,以及较小的水酶和/或合成酶12。
(p)ppGpp核苷酸首次被发现为不寻常的32P标记点,出现在薄层色谱图(TLC)的自动放射图上,在氨基酸饥饿3引起的严格反应。更详细的标签协议已经审查18。此处描述的协议(图1)是对这些协议的修改,允许监测微小板上多个样品的生长。这有利于对(p)ppGpp丰度变化的多重生物和技术估计,最初是为研究二代移位19而开发的。带有32P 和 TLC 检测的 (p) ppGpp 标签也允许测量 (p) ppGpp 降解率。已开发替代方法来确定(p)ppGpp水平,如质谱、HPLC20、荧光化学传感器21、22和GFP基因融合到受ppGpp23影响的启动子。24.荧光化学传感器目前用途有限,因为结合ppGpp后光谱偏移小,以及ppGpp和ppGpp21之间的问题。该方法在体外检测(p)ppGpp是有效的,但在细胞提取物中却不能。涉及HPLC的方法已经改进了20个,但需要昂贵的设备,并且不能很好地适应高通通。最后,GFP融合可以估计ppGpp依赖激活或抑制,但不测量ppGpp本身。虽然每种替代方法都是有价值的,但它们需要昂贵的设备或大量的动手时间,否则它们不能接受多种动力学采样和后续处理。通过本文所述的方法,96 个样品可在大约 20 分钟(每板 18 个样本)内应用于 6 个 TLC 板,TLC 开发可在几个小时内解决,在几个小时或一夜之间获得定量数据,具体取决于标签强度。
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Protocol
1. 媒体准备
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对于 MOPS (3-(N-morpholino) 丙烷硫酸) 介质25,使用 1/10 体积的 10x MOPS 盐、1/100 体积的 100x 微量营养素溶液、3 mM 磷酸钠用于过夜培养物或 0.2 mM 磷酸钠进行 32 P 均匀标记, 0.2% 葡萄糖和 1 μg/mL 三明(维生素 B1)。如果需要,在40μg/mL下加入氨基酸。
- 对于 MOPS 盐,使用 400 mM MOPS、40 mM Tricine、0.1 mM FeSO 4、95 mM NH4Cl、2.6 mM K2SO4、5μM CaCl2、10.56mM MgCl2和 500 mM NaCl。按写入顺序添加不同的分量以避免降水。使用 KOH 调节至 pH 7.4,并通过过滤进行消毒。
- 对于 100x 微量营养素溶液,使用 3 μM (NH4)6(MO7)24、 0.4 mM H3BO4、30 μM CoCl2、10 μM CuSO4、 80 μM MnCl2和 10 μM ZnSO4。通过高压灭菌进行灭菌。
- 用于葡萄糖 (20%)和磷酸钠(300 mM)溶液,通过高压灭菌作为单独的100x库存进行灭菌。通过过滤对100x的硫酸胺和氨基酸混合物进行消毒。为每个实验准备来自无菌库存溶液的新鲜介质。
2. 贴有32P 的标签
- 用3mM磷酸钠在MOPS培养基中生长一夜培养物。
- 在24孔板中,加入550μL的MOPS介质,含有0.2mM磷酸钠载体和30μL的每种细菌接种(稀释1/20)。这将产生 OD600nm 0.1 的初始接种。使用一口带新鲜介质的井作为无菌控制。
- 将板置于摇动培养箱上,在900 rpm下摇动300分30分钟。用胶带牢固地连接板,以避免倾斜或溢出。在缺少32P 的介质中,使用板读取器并在相同条件下孵育,可并行使用复制板来监控生长。
- 向每口32P 正磷酸盐(5 mCi/mL 库存中 20 μL)添加 100 μCi。
注:放射性的量也可以调整,以满足实验需要。对于低基础水平 100 μCi 与 0.2 mM 载体磷酸盐工作良好,但对于测量 (p) ppGpp 水平,预计将成为等效的 GTP 池,标签可以下降到 25 或 50 μCi。不建议将载波磷酸盐降至0.2 mM以下,以避免磷酸盐水平受到生长限制。
注意:32P 是一种发光同位素,因此请使用适当的屏蔽,以确保安全。所有放射性物质必须妥善处置,采取一切可能的预防措施。 - 在摇动培养箱中生长1至2倍(1小时或更多),使外部标签在诱导压力之前与细胞内核苷酸池基本平衡。
3. 诱发压力或饥饿
-
根据所研究的压力类型,使用您选择的方法诱导压力,例如添加代谢通路抑制剂、温度变化、耗尽所需的营养、转移渗透力变化、诱导氧化应激、添加毒素等。
- 例如,加入100μg/mLL-valine,以诱导大肠杆菌K-12菌株中的乳氨酸饥饿。诱导5分钟后,将观察到ppGpp水平升高。
4. 取样和ppGpp提取
- 将每个标记的细胞样品的20 μL添加到含有20 μL冰冷6M碱酸的0.2 mL PCR管中。
- 立即将样品放入干冰中。
- 通过3个循环的冷冻和解冻提高细胞提取效率。
- 在发现 PEI 纤维素薄层色谱图之前,以最大速度将离心样品以 1 分钟的速度颗粒细胞碎片,以避免在色谱图上发现。
5. 薄层色谱
- 用软铅笔,从 20 厘米 x 20 厘米 PEI-Cellulose TLC 板的边缘标记一条 1 厘米的原点线,该板用剪刀从顶部取下 5 厘米。在每个样品的 PEI 表面将 5 μL 作为水滴。开始提升开发,而不允许此点干燥,通过最小化条纹来提高分辨率。
- 在具有 1.5 M KH2PO4 (pH 3.4) 溶液的罐体中进行提升开发,使液体不会接触原点采样点。用密封密封盖住油箱,让液体升到修剪的纸张顶部,15 厘米。为了达到pH 3.4的1.5M KH2PO4解决方案,有必要调整pH通过增加H3PO4。
- 取出完全开发的色谱图,并在室温下晾干。
- 切割并丢弃含有游空32P 的色谱图的顶部(pH 前部)部分,并将其放入放射性废物中。此部分在图 2中以黄色表示,在紫外光下易于可视化。如果仅测量 (p) ppGpp 核苷酸,其迁移速度低于 GTP,则建议运行 UV 可见的 GTP 标准,然后切割和丢弃较大的上部(高于 GTP 的任何部分,如图2所示)。
- 用荧光粉屏幕在一夜之间曝光自带薄膜。
- 开发影片。使用磷成像器捕获和定量荧光粉屏幕信号。
6. (p)ppGpp 的量化
- 用图像J26,27定量放射性斑点。
注:(p)ppGpp 的量可以归一化为每个样本中观察到的 G 核苷酸总量 (图 2)。如果背景量是同质的,则可以减去一个空白(图2中的框 4 )以更正背景。总 G 是检测到的 GTP + ppGpp = pppGpp 的总和。这种规范化假设GMP和GDP水平可以忽略不计,大肠杆菌也是如此。 给定核苷酸与总G的比例为纠正应用样本量的变化提供了重要方法。
7. ppGpp 衰减率的测量
注:该协议的修改允许测量 ppGpp 衰减率。
- 引发压力或饥饿的时间足以允许ppGpp积累(步骤3),反转应力,以阻止持续的ppGpp合成,从而检测水解率。反转的过程将取决于应力。例如,加入200微克/mL的氯霉素,以扭转任何氨基酸饥饿。
- 衰变率通常很快,但可能有所不同,因此每 20-30 秒采集一次样品,最多 2 分钟。
- 一旦 TLC 得到开发(如步骤 5)和时间过程中获得的 ppGpp 水平,在半对数图上绘制剩余 ppGpp 内容与时间,以允许以直线形式可视化零阶衰减率,并估计 ppGpp 半衰期。
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Representative Results
在大肠杆菌K-12菌株中,添加血管素引起异于明的内源性饥饿,导致5分3秒后ppGpp水平增加。在MOPS中生长的含有除ILV以外的所有氨基酸的细胞,如图1所示,标有32P。 一旦贴上标签,加入6 μL的10毫克/mL-Valine(100微克/mL最终浓度),以产生无盐饥饿。样品在添加静脉曲明后0和5分钟进行。5分钟后(图3A),ppGpp和pppGpp水平增加了2倍和2.5倍。作为阴性对照,使用无细胞标记的样品来检测32P源中非正磷酸盐的可能化合物。此外,包括ppGpp缺陷菌株(βrelA+孢子)作为阴性对照,可以帮助更好地识别斑点。
氯霉素是蛋白质合成的抑制剂,可减少带电的ile-tRNA的消耗,进而恢复高电荷与未充电tRNA的比率,从而逆转无电性饥饿。强RelA介导的ppgpp合成酶的激活被废除,这允许一个ppGpp降解的测量不受残留合成的影响。因此,在饥饿的培养物中加入200微克/mL的氯霉素,此后每隔20秒采集样品。在这种情况下,ppGpp衰减,半衰程约为64 s(图3B)。
图1:按TLC工作流程测量ppGpp。提取ppGpp形成细菌培养物的协议的原理表示及其后检测由TLC。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:代表性TLC分析。使用TLC过夜后,在自光辐射和荧光屏上获得的结果的原理表示。要测量的点以红色显示。还显示了用于计算 ppGpp 小数量的公式。总 G 是指在样品中检测到的 GTP + ppGpp = pppGpp 的总量。黄色带表示在紫外光下可见的 pH 前。剪刀指示我们建议切割色谱图以丢弃大部分放射性的位置。箭头指示使用 1.5 M 磷酸盐缓冲液在提升过程中流动的方向。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:ppGpp的合成和衰减的测量。(A) TLC 对样品0和添加血管后5分钟检测ppGpp。标记与 GTP、ppGpp 和 pppGpp 对应的点。无细胞培养素作为阴性对照(C-)包括在内。(B) 添加氯霉素后ppGpp的衰变,以扭转氨基酸饥饿。ppGpp 的半衰程由虚线表示的指数衰减率确定。错误栏反映重复项中的 SD。Y 轴以半洛格自 (对数2) 刻度表示.请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
实现细胞近乎均匀的标签是该协议的关键步骤。因此,使用定义的介质(如 MOPS 或 Tris 介质)对于允许携带磷酸盐浓度和特定活动的变化至关重要。不能使用磷酸盐缓冲介质,如 M9 或介质 A。大多数未定义的介质含有可变量的磷酸盐,如LB、胰锥酮和卡萨米诺酸。磷酸盐同位素33P是一种较弱的发射体,可以替代32 P。 然而,32 P的更高能量排放大大提高了检测灵敏度。必须强调使用同位素的危险,以及使用适当的屏蔽保护和处置的重要性。最近发现一种能够检测出特别ppGpp28的裂核开关,有朝一日可能会以一种更安全的方式在体外和体内检测ppGpp。如导言所述,存在其他方法,尽管磷酸盐标签的使用仍然是细菌(p)ppGpp 和其他磷酸盐标记化合物(如核糖核酸或核糖核酸或核糖核酸)的通过式测量的一种敏感、直接和快速的方法。脱氧-NTP池、PRPP、PPi或磷酸盐糖。
另一个关键步骤是确保平行培养物(摇动培养箱和板读器)的生长类似。在研究营养衰竭时,如二次移位19,不同文化之间的同步至关重要。标签板和无标记板的生长可比性可以通过OD600测量放射性板上未标记的油井来评估。为了增加测试的样品数量,可以使用96孔板代替19个,但减少蒸发所需的介质量将减少培养性曝气。在 96 井板的生长过程中,由于曝气减少,在 96 井板的生长过程中,基底水平 (p) ppGpp 会略高一些,而 24 孔板则略高。因此,为了测量基础水平,建议24孔板生长。为了测量更强烈诱导 (p) ppGpp 水平的变化,最好使用 96 孔板。24 和 96 孔微子板的选择取决于实验目标。
该协议的变体具有许多针对不同应力条件的潜在应用。最近,我们应用它测量在从葡萄糖到乳糖和其他替代糖的经典二体转移期间ppGpp的积累和衰变。这些研究揭示了葡萄糖饥饿和氨基酸饥饿的牵连19。在这里,我们把大肠杆菌K12菌株中的血管引起的氨基酸饥饿描述为一种更简单、研究良好的应力条件3。在执行更复杂的饥饿情况之前,此示例可用作控件。氨基酸饥饿可以通过添加在生长过程中耗尽的有限数量的氨基酸而引起;添加tRNA氨基细胞化或合成抑制剂(血清氢抗,木皮罗辛,或3-氨基三醇)或大肠杆菌K12在没有异丙氨酸的情况下添加血管素。血清氢酰氨基酯通常用于抑制 tRNASer氨基化,但需要高浓度,这可能导致由于与其他化合物的羟酰亚酯反应性问题。通过添加大量丝氨酸来逆转丝氨酸羟基化酶效应可以产生非期望的效果1。虽然SHX已被证明是有效的诊断ppGpp生产,我们不建议它用于生理研究产生氨基酸饥饿,因为正常(p)ppGpp反馈机制被废除,如生理后果降低多余的活动,但允许激活应力生存调节电路。
为了将非规范调控核苷酸(如(p)ppApp29)与(p)ppGpp的混合样品正确分离,有必要修改此处描述的TLC程序。已经表明,pppApp对ppGpp体外30,31具有对抗作用;因此,未来研究需要更好地分离这两种化合物。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国家卫生研究院尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所(Eunice Kennedy Shriver)内部研究计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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