Summary
Das Wachstum von radioaktiv markierten Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht eine Probenahme mit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replizierungen von Nukleotid-Pool-Überfluss ermöglicht, einschließlich der von (p)ppGpp. Die Auswirkungen von Wachstumsübergängen, die durch Quellen physiologischen Stresses sowie Erholung von Stress hervorgerufen werden, können überwacht werden.
Abstract
Das (p)ppGpp-Nukleotid fungiert als globaler Regulator bei Bakterien als Reaktion auf eine Vielzahl von körperlichen und ernährungsphysiologischen Belastungen. Es hat einen schnellen Beginn, in Sekunden, die zu einer Anhäufung von Ebenen führt, die sich denen von GTP-Pools nähern oder übertreffen. Stressumkehr gelegentlich ein schnelles Verschwinden von (p)ppGpp, oft mit einer Halbwertszeit von weniger als einer Minute. Das Vorhandensein von (p)ppGpp führt zu Veränderungen der zellulären Genexpression und des Stoffwechsels, die den schädlichen Auswirkungen von Stress entgegenwirken. Gram-negative und gram-positive Bakterien haben unterschiedliche Reaktionsmechanismen, aber beide hängen von (p)ppGpp-Konzentration ab. In jedem Fall ist es notwendig, gleichzeitig viele radioaktiv markierte Bakterienkulturen in Zeitintervallen zu überwachen, die während kritischer Stressübergangsperioden von 10 Sekunden bis Stunden variieren können. Dieses Protokoll behebt diese technische Herausforderung. Die Methode nutzt temperatur- und schüttergesteuerte Mikrotiter-Schalen-Inkubatoren, die eine parallele Überwachung des Wachstums (Absorption) und eine schnelle Probenahme von einheitlich phosphatradioaktiv markierten Kulturen ermöglichen, um Nukleotidbecken durch Dünnschichtchromatographie auf PEI-Zellulose. Für mehrere technische und biologische Wiederholungen von Analysen werden geringe Probenmengen benötigt. Komplexe Wachstumsübergänge wie diauxisches Wachstum und schnelle (p)ppGpp-Fluktuationsraten können mit dieser Methode quantitativ bewertet werden.
Introduction
Der (p)ppGpp zweite Bote ist ein globaler Regulator, der die Expression einer großen Anzahl von Genen moduliert, einschließlich Genen zur Synthese von Ribosomen und Aminosäuren1,2. Obwohl zunächst in Escherichia coli3entdeckt, (p)ppGpp kann sowohl in Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien als auch in pflanzende Chloroplasten4,5gefunden werden. Bei E. coli und anderen Gram-negativen Bakterien interagiert (p)ppGpp direkt mit RNA-Polymerase an zwei verschiedenen Stellen6,7,8. In Gram-Positiven hemmt (p)ppGpp die GTP-Fülle, die von CodY wahrgenommen wird, einem GTP-bindenden Protein mit genspezifischen DNA-Erkennungsmotiven, die zur Regulation9,10führen. p)ppGpp sammelt sich als Reaktion auf den Hunger todbringend für verschiedene Nährstoffe und Stressbedingungen an, was zu langsamem Wachstum und Anpassungen der Genexpression führt, um eine Anpassung an Stress11,12zu ermöglichen.
Der netto angesammelte ppGpp spiegelt ein Gleichgewicht zwischen Synthetase- und Hydrolaseaktivitäten wider. In E. coli RelA ist eine starke Synthetase und SpoT ist bifunktional, mit einer starken Hydrolase und einer schwachen Synthetase, die jeweils unterschiedlich in einer stressabhängigen Weise reguliert werden könnten. Die starke RelA-Synthetase wird aktiviert, wenn die Verfügbarkeit von codon-spezifizierter geladener tRNA an die ribosomale A-Stelle gebunden ist, wenn sie nicht mit den Anforderungen der Proteinsynthese13,14,15Schritt hält. Die schwache SpoT (p)ppGpp-Synthetase wird aktiviert, während die starke (p)ppGpp-Hydrolase als Reaktion auf andere Stressbedingungen und durch andere Mechanismen gehemmt wird. Unter bestimmten Bedingungen können Proteine wie ACP oder Rsd an SpoT binden, was auch das Gleichgewicht zwischen Hydrolyse und Synthese16,17verändert. In Gram-Positiven spiegeln Synthese und Hydrolyse ein komplexeres Gleichgewicht zwischen einem einzelnen RelA SpoT-Homolog (RSH)-Protein mit starken Synthese- und Hydrolyseaktivitäten sowie kleineren Hydrolasen und/oder Synthetasen12wider.
Die (p)ppGpp-Nukleotide wurden zuerst als ungewöhnliche 32P-markierte Flecken entdeckt, die auf Autoradiogrammen von Dünnschichtchromatogrammen (TLC) während einer strengen Reaktion durch Aminosäurehunger3erschienen sind. Detailliertere Kennzeichnungsprotokolle wurden überprüft 18. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1) ist eine Änderung dieser Protokolle, die es ermöglicht, das Wachstum mehrerer Proben auf Mikrotiterplatten zu überwachen. Dies erleichtert mehrere biologische und technische Schätzungen von (p)ppGpp-Überflussänderungen und wurde ursprünglich für Studien von diauxischen Schichten19entwickelt. Die Kennzeichnung von (p)ppGpp mit 32P und die Detektion durch TLC ermöglicht auch Messungen von (p)ppGpp Abbauraten. Es wurden alternative Methoden entwickelt, um (p)ppGpp-Spiegel wie Massenspektrometrie, HPLC20, fluoreszierende Chemosensoren21,22und GFP-Genfusionen an Promotoren zu bestimmen, die von ppGpp23betroffen sind, 24. Fluoreszierende Chemosensoren haben derzeit aufgrund kleiner Spektralverschiebungen nach Bindung ppGpp sowie Problemen bei der Unterscheidung zwischen ppGpp und pppGpp21einen begrenzten Einsatz. Diese Methode ist effizient, um (p)ppGpp in vitro zu erkennen, aber nicht in zellulären Extrakten. Die Methoden mit HPLC wurdenum 20 verbessert, erfordern aber teure Geräte und sind nicht gut an hohe Durchsatz angepasst. Schließlich können GFP-Fusionen eine Schätzung der ppGpp-abhängigen Aktivierung oder Hemmung ergeben, messen jedoch ppGpp selbst nicht. Obwohl jede dieser alternativen Methoden wertvoll ist, erfordern sie teure Ausrüstung oder eine erhebliche Praktische Zeit, oder sie sind ansonsten nicht für mehrere kinetische Probenahmen und nachfolgende Verarbeitungen geeignet. Mit dem hier beschriebenen Verfahren können 96 Proben auf sechs TLC-Platten in etwa 20 min (18 Proben pro Platte) aufgebracht werden, die durch TLC-Entwicklung in weniger als ein paar Stunden gelöst werden, wobei quantitative Daten nach mehreren Stunden oder über Nacht, je nach Etikettierung, intensität.
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Protocol
1. Medienvorbereitung
-
Für MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonsäure) media25, verwenden Sie 1/10 Volumen von 10x MOPS Salzen, 1/100 Volumen von 100x Mikronährstofflösung, 3 mM Natriumphosphat für Nachtkulturen oder 0,2 mM Natriumphosphat zur gleichmäßigen Kennzeichnung mit 32P, 0,2% Glukose und 1 g/ml Thiamin (Vitamin B1). Fügen Sie bei Bedarf Aminosäuren mit 40 g/ml hinzu.
- Für MOPS-Salze verwenden Sie 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mM NH4Cl, 2,6 mM K2SO4, 5 'M CaCl2, 10.56 mM MgCl2und 500 mMN NaCl. Fügen Sie die verschiedenen Komponenten in der Reihenfolge hinzu, die geschrieben wurde, um Niederschläge zu vermeiden. Mit KOH auf pH 7,4 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
- Für 100x Mikronährstofflösung verwenden Sie 3 m (NH4)6(MO7)24, 0,4 mM H3BO4, 30 m CoCl2, 10 'M CuSO4, 80 m MnCl2und 10 'M ZnSO4. Sterilisieren durch Autoklavieren.
- Für Glukose (20%) und Natriumphosphat (300 mM) Lösungen, sterilisieren als separate 100x Bestände durch Autoklavieren. Sterilisieren Sie 100-fache Bestände an Thiamin- und Aminosäuremischungen durch Filtration. Bereiten Sie frische Medien aus sterilen Lagerlösungen für jedes Experiment vor.
2. Etikettierung mit 32P
- Übernachtkulturen in MOPS-Medien mit 3 mM Natriumphosphat anbauen.
- In einer 24-Well-Platte 550 l MOPS-Medien mit 0,2 mM Natriumphosphatträger und 30 l jedes bakteriellen Inokulums (Verdünnung 1/20) hinzufügen. Dadurch entläuft sich ein anfängliches Inokulum von OD600nm 0.1. Verwenden Sie eine gut mit frischen Medien als Sterilitätskontrolle.
- Legen Sie die Platte auf einen Schüttelinkubator bei 37 °C Schütteln bei 900 Rpm für 30 min. Kulturen werden von unten erhitzt und Schütteln sorgt für Belüftung. Befestigen Sie die Platte fest mit Klebeband, um Kippen oder Verschütten zu vermeiden. Das Wachstum kann mit einer Replizierungsplatte parallel in Medien ohne 32P mit einem Plattenleser und Inkubation unter den gleichen Bedingungen überwacht werden.
- Fügen Sie jedem Bohrgut mit 32P Orthophosphat (20 l aus einem 5 mCi/ml-Bestand) 100 Ci hinzu.
HINWEIS: Die Radioaktivität kann auch an den experimentellen Bedarf angepasst werden. Bei niedrigen Basalwerten funktionieren 100 -Ci mit 0,2 mM Trägerphosphat gut, aber für die Messung (p)ppGpp-Werte, die voraussichtlich den GTP-Pools entsprechen, kann die Kennzeichnung auf 25 oder 50 C/Ci gesenkt werden. Eine Senkung des Trägerphosphats unter 0,2 mM wird nicht empfohlen, um zu vermeiden, dass der Phosphatgehalt für das Wachstum begrenzt wird.
VORSICHT: 32P ist ein emittierendes Isotop, also verwenden Sie die richtige Abschirmung, die für die Sicherheit angegeben ist. Das gesamte radioaktive Material muss unter Allen möglichen Vorsichtsmaßnahmen ordnungsgemäß entsorgt werden. - Wachsen Sie im Schüttelinkubator für 1 bis 2 Verdoppelungen (1 h oder mehr), damit externe Etiketten weitgehend mit intrazellulären Nukleotidbecken gleichsetzen können, bevor Stress entsteht.
3. Induktion von Stress oder Hunger
-
Induzieren Sie Stress mit einer Methode Ihrer Wahl, abhängig von der Art des untersuchten Stresses, z. B. Zugabe von Stoffwechselweginhibitoren, Temperaturänderung, erschöpfende benötigte Nährstoffe, Verschiebung der Osmolaritätsverschiebungen, Induzieren von oxidativem Stress, Zugabe von Toxinen usw.
- Fügen Sie z. B. 100 g/ml L-Valin hinzu, um Isoleucin-Hunger in E. coli K-12-Stämmen zu induzieren. Erhöhte ppGpp-Spiegel werden nach 5 Minuten Induktion beobachtet.
4. Probenahme und ppGpp-Extraktion
- Fügen Sie 20 l jeder beschrifteten Zellprobe in ein 0,2 ml PCR-Rohr mit 20 l eiskalter 6 M Ameisensäure hinzu.
- Die Proben sofort in Trockeneis geben.
- Verbessern Sie die Effizienz der zellulären Extraktion durch 3 Zyklen des Einfrierens und Auftauens.
- Kurz vor der Erkennung pei Zellulose Dünnschicht Chromatogramme, Zentrifugenproben für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit, um Zellablagerungen zu pellet, um zu vermeiden, dass es auf Chromatogrammen zu erkennen.
5. Dünnschicht-Chromatographie
- Markieren Sie mit einem weichen Bleistift eine Ursprungslinie 1 cm vom Rand der 20 cm x 20 cm PEI-Cellulose TLC Platte, die mit einer Schere 5 cm von der Oberseite entfernt wurde. Für jede Probe 5 l als Tröpfchen in der PEI-Oberfläche auftragen. Beginnen Sie die aufsteigende Entwicklung, ohne diesen Punkt trocknen zu lassen, wodurch die Auflösung durch Minimierung von Streaking verbessert wird.
- Führen Sie die aufsteigende Entwicklung in einem Tank mit einer Schicht von 1,5 M KH2PO4 (pH 3.4) Lösung flach genug, so dass Flüssigkeit nicht berühren die Ursprungsprobe Punkt. Bedecken Sie den Tank mit einer luftdichten Dichtung und lassen Sie den flüssigen Aufstieg an die Oberseite des getrimmten Blattes, 15 cm, zu. Um pH 3,4 für eine 1,5 M KH2PO4 Lösung zu erreichen, ist es notwendig, den pH-Wert durch Zugabe von H3PO4einzustellen.
- Entfernen Sie das ausgereifte Chromatogramm und trocknen Sie die Luft bei Raumtemperatur.
- Schneiden und entsorgen Sie den oberen (pH-Front) Teil des Chromatogramms, das die freien 32P enthält, in radioaktiven Abfall. Dieser Teil wird in Abbildung 2 in gelber Farbe dargestellt und unter UV-Licht leicht visualisiert. Wenn nur (p)ppGpp-Nukleotide gemessen werden, die langsamer als GTP migrieren, wird empfohlen, einen UV-sichtbaren GTP-Standard auszuführen und dann einen größeren oberen Teil (alles über GTP, wie in Abbildung 2dargestellt) zu schneiden und zu verwerfen.
- Stellen Sie autoradiografische Filme über Nacht mit einem Phosphorbildschirm aus.
- Entwickeln Sie den Film. Erfassen und quantitieren Sie das Phosphor-Bildschirmsignal mit einem Phosphoimager.
6. Quantifizierung von (p)ppGpp
- Quantitieren Sie radioaktive Flecken mit Bild J26,27.
HINWEIS: Die Menge an (p)ppGpp kann auf die Gesamtmenge der in jeder Stichprobe beobachteten G-Nukleotide normalisiert werden (Abbildung 2). Wenn die Hintergrundmenge homogen ist, kann ein einzelnes Rohling (Feld 4 aus Abbildung 2) subtrahiert werden, um den Hintergrund zu korrigieren. Total G ist die Summe der ermittelten GTP + ppGpp + pppGpp. Diese Normalisierung setzt voraus, dass der GMP- und das BIP-Niveau vernachlässigbar sind, was für E. coligilt. Das Verhältnis eines gegebenen Nukleotids zu Gesamt-G bietet eine wichtige Möglichkeit, Variationen des angewendeten Probenvolumens zu korrigieren.
7. Messung der Rate des ppGpp-Zerfalls
HINWEIS: Eine Änderung dieses Protokolls ermöglicht Messungen von ppGpp-Zerfallsraten.
- Nach einer Zeit, die ausreichte, um eine ppGpp-Akkumulation zu ermöglichen (Schritt 3), um die Spannung umzukehren, um die fortgesetzte ppGpp-Synthese zu blockieren, die den Nachweis hydrolytischer Raten ermöglicht. Das Verfahren zur Umkehrung hängt von der Belastung ab. Fügen Sie z. B. 200 g/ml Chloramphenicol hinzu, um den Hunger der Aminosäure umzukehren.
- Zerfallsraten sind in der Regel schnell, können aber variieren, so nehmen Sie Proben alle 20-30 s bis zu 2 min. Prozessproben wie in Schritt 4.
- Sobald der TLC entwickelt ist (wie in Schritt 5) und die während des Zeitverlaufs erhaltenen ppGpp-Ebenen, zeichnen Sie den Rest-ppGpp-Inhalt auf einem semilogarithmischen Diagramm vs. Zeit, um die Visualisierung von Null-Order-Zerfallsraten als gerade Linie und die Schätzung der ppGpp-Halbwertszeit zu ermöglichen.
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Representative Results
Bei E. coli K-12-Stämmen provoziert die Zugabe von Valin einen endogene Hunger von Isoleucin, was zu einer Erhöhung des ppGpp-Spiegels nach 5 min3führt. Zellen, die in MOPS angebaut wurden und alle Aminosäuren mit Ausnahme von ILV enthielten, wurden mit 32P gekennzeichnet, wie in Abbildung 1angegeben. Nach der Etikettierung wurden 6 l mit 10 mg/ml L-Valin (100 g/ml Endkonzentration) zugegeben, um Isoleucin-Hunger zu erzeugen. Die Proben wurden 0 und 5 min nach Zugabe von Valin entnommen. Nach 5 min (Abbildung 3A) trat ein 2- und 2,5-facher Anstieg der ppGpp- und pppGpp-Spiegel auf. Als Negativkontrolle wurde eine zellfreie etikettierte Probe verwendet, um mögliche Verbindungen zu erkennen, die in der 32P-Quelle nicht orthophosphat waren. Auch die Aufnahme einer ppGpp-Mangelstamm -Sorte (-relA-SpoT) als Negativkontrolle könnte zu einer besseren Identifizierung der Flecken beitragen.
Die Umkehrung des Isoleucin-Hungers kann durch Chloramphenicol erreicht werden, einem Inhibitor der Proteinsynthese, der den Verbrauch von geladener Ile-tRNA reduziert und wiederum hohe Verhältnisse von geladener zu ungeladener tRNA wiederherstellt. Die Aktivierung der starken RelA-vermittelten ppGpp-Synthetase wird abgeschafft, was ein Maß der ppGpp-Degradation ungestört durch Restsynthese ermöglicht. Daher wurden den ausgehungerten Kulturen 200 g/ml Chloramphenicol zugesetzt, und anschließend wurden Proben in 20 s Abständen entnommen. In diesem Fall verfiel ppGpp mit einer Halbwertszeit von etwa 64 s (Abbildung 3B).
Abbildung 1: Messung von ppGpp durch TLC-Workflow. Schematische Darstellung des Protokolls zur Extraktion von ppGpp-Form bakterienkulturen und deren posteriorde Detektion durch TLC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative TLC-Analyse. Schematische Darstellung der Ergebnisse, die nach Autoradiographie und Phosphor-Bildschirm über Nacht mit dem TLC erzielt wurden. Die zu messenden Flecken sind rot dargestellt. Die Formel zur Berechnung der Bruchmenge von ppGpp wird ebenfalls angezeigt. Gesamt G bezieht sich auf die Gesamtmenge der in der Stichprobe erkannten GTP + ppGpp + pppGpp. Das gelbe Band stellt die unter UV-Licht sichtbare pH-Front dar. Scheren zeigen an, wo wir empfehlen, das Chromatogramm zu schneiden, um den größten Teil der Radioaktivität zu verwerfen. Der Pfeil zeigt die Strömungsrichtung während der aufsteigenden Entwicklung mit 1,5 M Phosphatpuffer an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messung der Synthese und des Zerfalls von ppGpp. (A) Erkennung von ppGpp durch TLC für Die Proben 0 und 5 Minuten nach Zugabe von Valin. Spots entsprechend GTP, ppGpp und pppGpp sind markiert. Eine zellfreie Kultur wurde als Negativkontrolle (C-) aufgenommen. (B) Zerfall von ppGpp nach Zugabe von Chloramphenicol, um den Aminosäurehunger umzukehren. Die ppGpp-Halbwertszeit wird aus der exponentiellen Zerfallsrate bestimmt, die durch gepunktete Linien dargestellt wird. Fehlerbalken spiegeln SD von Duplikaten wider. Y-Achse wird in einer semilogaritmischen (log2) Skala dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Nahe eine einheitliche Kennzeichnung der Zellen ist ein entscheidender Schritt für dieses Protokoll. Daher ist die Verwendung definierter Medien wie MOPS- oder Tris-Medien von entscheidender Bedeutung, um eine Variation der Phosphatkonzentrationen des Trägers und spezifische Aktivitäten zu ermöglichen. Phosphatgepufferte Medien wie M9 oder Media A können nicht verwendet werden. Die meisten undefinierten Medien enthalten variable Mengen an Phosphat, wie LB, Trypton und Casaminosäuren. Das Phosphatisotop 33P ist ein schwächerer Emitter, der durch 32P ersetzt werden kann. Vorteile der Substitution sind, dass es sicherer ist und eine Halbwertszeit von 25 Tagen statt 14 Tagen für 32P hat. Die energetischeren Emissionen von 32P erhöhen jedoch die Erkennungsempfindlichkeit erheblich. Es ist wichtig, die Gefahren der Arbeit mit Isotopen und die Bedeutung der Verwendung von richtigen Abschirmungschutz und Entsorgung zu betonen. Die jüngste Entdeckung eines Riboschalters, der in der Lage ist, speziell ppGpp28 zu erkennen, kann eines Tages zu einer sichereren Möglichkeit führen, ppGpp in vitro und in vivo zu erkennen. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, gibt es andere Methoden, obwohl die Verwendung der Phosphatkennzeichnung nach wie vor ein sensibler, direkter und schneller Ansatz für Durchsatzmessungen von bakteriellen (p)ppGpp sowie anderen phosphatgekennzeichneten Verbindungen wie Ribo- oder Desoxyribo-NTP-Pools, PRPP, PPi oder Zuckerphosphate.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist, sicherzustellen, dass das Wachstum der Parallelkulturen (Shaking Inkubator und Plattenleser) ähnlich ist. Bei der Untersuchung der Nährstofferschöpfung, wie z. B. diauxic shift19,ist die Synchronisation zwischen den Kulturen entscheidend. Die Vergleichbarkeit des Wachstums auf markierten und unbeschrifteten Platten kann anhand von OD600-Messungen eines unbeschrifteten Brunnens auf der ansonsten radioaktiven Platte beurteilt werden. Um die Anzahl der getesteten Proben zu erhöhen, kann stattdessen eine 96-Well-Platte anstelle von 19verwendet werden, aber die Menge an Medien, die zur Minimierung der Verdunstung benötigt wird, reduziert die Kulturbelüftung. Basalgehalte von (p)ppGpp werden während des Wachstums in einer 96-Well-Platte im Vergleich zu einer 24-Well-Platte aufgrund der reduzierten Belüftung etwas höher sein. Daher wird für die Messung der Basalwerte ein 24-Well-Plattenwachstum empfohlen. Um Variationen von stärker induzierten (p)ppGpp-Spiegeln zu messen, wird eine 96-Well-Platte bevorzugt. Die Wahl zwischen 24 und 96 Brunnenmikrotiterplatten hängt vom experimentellen Ziel ab.
Variationen dieses Protokolls haben viele potenzielle Anwendungen für unterschiedliche Stressbedingungen. Kürzlich haben wir es angewendet, um die Akkumulation und den Zerfall von ppGpp während klassischer diauxischer Verschiebungen von Glukose zu Laktose und zu anderen alternativen Zuckern zu messen. Diese Studien ergaben eine Beteiligung sowohl des Glukosehungers als auch des Aminosäurehungers19. Hier beschreiben wir Aminosäurehunger induziert durch Valin in E. coli K12 Stämmen als einfachere und gut untersuchte Stressbedingung3. Dieses Beispiel kann als Steuerelement verwendet werden, bevor kompliziertere Hungersituationen durchgeführt werden. AminosäureHunger kann durch Zugabe von begrenzten Mengen einer erforderlichen Aminosäure provoziert werden, die während des Wachstums erschöpft ist; Hinzufügen eines Inhibitors der tRNA-Aminoacylation oder -Synthese (Serinhydroxamat, Mupirocin oder 3-Aminotriazol) oder für E. coli K12, der Inland von Isoleucin Netin hinzufügt). Serinhydroxamat wird oft verwendet, um die tRNASer Aminoacylation zu hemmen, erfordert aber hohe Konzentrationen, die aufgrund der Hydroxamatreaktivität mit anderen Verbindungen Probleme verursachen können. Umkehrung der serinen Hydroxamat-Effekte durch Zugabe einer großen Mengen von Serin kann ungewünschte Effekte haben1. Obwohl shX sich als wirksam als Diagnose der ppGpp-Produktion erwiesen hat, empfehlen wir seine Verwendung für physiologische Studien nicht, um Aminosäurehunger zu erzeugen, da normale (p)ppGpp-Feedback-Mechanismen abgeschafft werden, wie z. B. physiologische Folgen überflüssige Tätigkeiten zu senken, aber die Aktivierung von Stress-Überlebens-Regulierungskreisen zu ermöglichen.
Änderungen der hier beschriebenen TLC-Verfahren sind notwendig, um nichtkanonische regulatorische Nukleotide, wie z. B. (p)ppApp29, von gemischten Proben mit (p)ppGpp richtig zu trennen. Es hat sich gezeigt, dass pppApp eine antagonistische Rolle gegenüber ppGpp in vitro30,31hat; Daher ist für zukünftige Studien eine bessere Trennung beider Verbindungen erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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