在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。
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方法文章
使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平
本文内容
摘要
摘要
(p)ppGpp 核苷酸在细菌中作为全局性调控因子，响应多种物理和营养胁迫。其响应迅速，可在数秒内启动，导致其浓度迅速积累至接近甚至超过 GTP 池的水平。当胁迫解除时，(p)ppGpp 会迅速降解，半衰期通常不足一分钟。(p)ppGpp 的存在会引起细胞基因表达和代谢的改变，从而抵消胁迫带来的损伤。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有不同的响应机制，但二者均依赖于 (p)ppGpp 的浓度。因此，在关键的胁迫转换期，有必要在从10秒到数小时不等的时间间隔内，同时监测多个放射性标记的细菌培养物。本实验方案旨在解决这一技术难题。该方法利用温度和摇床可控的微量滴定板培养箱，可并行监测生长情况（吸光度）并快速取样均一磷酸盐放射性标记的培养物，随后通过聚乙烯亚胺-纤维素薄层色谱法分离并定量核苷酸池。该方法仅需少量样品，即可完成多次技术重复和生物学重复分析。诸如双相生长及快速 (p)ppGpp 转换速率等复杂的生长转换过程，均可通过此方法进行定量评估。
引言
（p）ppGpp 是一种全局性调控的第二信使，可调节大量基因的表达，包括核糖体和氨基酸合成相关基因1,2。尽管最初在Escherichia coli中被发现3，（p）ppGpp 也存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，以及植物叶绿体中4,5。对于大肠杆菌（E. coli）及其他革兰氏阴性菌而言，（p）ppGpp 可在两个不同位点直接与RNA聚合酶相互作用6,7,8。在革兰氏阳性菌中，（p）ppGpp 抑制GTP的丰度，而GTP的变化可被CodY蛋白感知；CodY是一种GTP结合蛋白，具有特异性的DNA识别基序，从而介导基因表达调控9,10。（p）ppGpp 在多种营养缺乏和应激条件下会积累，导致生长减缓，并通过调节基因表达帮助细胞适应压力环境11,<....
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方案
1. 培养基制备
- 对于MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）培养基25，使用1/10体积的10倍浓缩MOPS盐溶液、1/100体积的100倍浓缩微量元素溶液、用于过夜培养的3 mM磷酸钠或用于32P均匀标记的0.2 mM磷酸钠、0.2%葡萄糖以及1 µg/mL硫胺素（维生素B1）。如需要，添加氨基酸至终浓度40 µg/mL。
- 配制MOPS盐溶液时，使用以下成分：400 mM MOPS、40 mM Tricine、0.1 mM FeSO4、95 mM NH4Cl、2.6 mM K2SO4、5 µM CaCl2、10.56 mM MgCl2和500 mM NaCl。按上述顺序依次加入各组分，以避免沉淀。用KOH调节pH至7.4，并通过过滤除菌。
- 配制100倍浓缩微量元素溶液时，使用以下成分：3 µM (NH4)6(MO7)24、0.4 mM H3BO4、30 µM CoCl2、10 µM CuSO4、80 µM MnCl2和10 µM ZnS....
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结果
在 E. coli K-12 菌株中，添加缬氨酸会引发异亮氨酸的内源性饥饿，导致在 5 分钟后 ppGpp 水平升高3。在 MOPS 培养基中培养的细胞（除 ILV 外含有所有氨基酸）按 图 1 所示用 32P 进行标记。标记后，加入 6 µL 的 10 mg/mL L-缬氨酸（终浓度为 100 µg/mL），以诱导异亮氨酸饥饿。在添加缬氨酸后 0 和 5 分钟分别取样。5 分钟后（图 3A），ppGpp 和 pppGpp 的水平分别增加了 2 倍和 2.5 倍。作为阴性对照，使用无细胞标记样品以检测 32P 来源中可能存在的非正磷酸盐化合物。此外，使用 ppGpp 缺陷型菌株（ΔrelA ΔspoT）作为阴性对照有助于更准确地鉴定斑点。
通过添加蛋白质合成抑制剂氯霉.......
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讨论
实现细胞的近乎均匀标记是本实验方案的关键步骤。因此，使用成分明确的培养基（如MOPS或Tris培养基）至关重要，以便调控载体磷酸盐浓度和比活性。不能使用磷酸盐缓冲培养基，例如M9或培养基A。大多数成分未明确的培养基含有可变含量的磷酸盐，例如LB、胰蛋白胨和酪蛋白氨基酸。磷酸同位素33P是一种较弱的放射性发射体，可替代32P。这种替代的优点在于安全性更高，且半衰期为25天，而32P的半衰期为14天。然而，32P能量更高的辐射显著提高了检测灵敏度。必须强调操作同位素时的危险性，以及采取适当屏蔽防护和规范处置的重要性。最近发现一种能够特异性识别ppGpp28的核糖开关，未来可能为在体外和体内检测ppGpp提供更安全的方法。如引言中所述，尽管存在其他检测方法，磷酸标记法仍是检测细菌（p）ppGpp以及其他磷酸化化合物（如核糖或脱氧核糖-NTP池、PRPP、PPi或糖磷酸盐）的一种灵敏、直接且快速的高通量检测手段。
另一个关键步骤是确保平行培养物（摇床培养箱.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发育研究所院内研究计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (NH4)6(MO7)24 | 费舍尔科技公司 | A-674 | |
| 放射自显影胶片 | 丹维尔科学公司 | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.贝克公司 | 1-1309 | |
| 氯霉素 | RPI公司 | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | 费舍尔科技公司 | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.贝克公司 | 1843 | |
| FeSO4 | 费舍尔科技公司 | I-146 | |
| 甲酸 | 费舍尔生物科技公司 | BP1215-500 | |
| 葡萄糖 | Macron公司 | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron公司 | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.贝克公司 | 0260-02 | |
| K2SO4 | 西格玛公司 | P9458-250G | |
| KH2PO4 | 费舍尔生物科技公司 | BP362-500 | |
| L-缬氨酸 | 西格玛公司 | V-6504 | |
| MgCl2 | 费舍尔科技公司 | FL-06-0303 | |
| 微孔板读数仪 Synergy HT | 伯腾公司 | Synergy HT | |
| MnCl2 | 西格玛公司 | M-9522 | |
| MOPS | 西格玛公司 | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | 马林克罗特公司 | 7892 | |
| NaCl | J.T.贝克公司 | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | 马林克罗特公司 | 7917 | |
| NH4Cl | 西格玛公司 | A0171-500G | |
| P-32 放射性核素，1 mL 水中的正磷酸（5 mCi） | 珀金埃尔默公司 | NEX053005MC | |
| 储存式磷屏 | 柯达公司 | So230 | |
| 恒温混匀仪 | 艾本德公司 | 5382000015 | |
| 硫胺素 | 西格玛公司 | T-4625 | |
| TLC PEI 纤维素 F | 默克-密理博公司 | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI公司 | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 成像仪 | GE 医疗集团 | ||
| ZnSO4 | 费舍尔科技公司 | Z-68 |
参考文献
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13
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