使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

摘要

在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。

摘要

(p)ppGpp 核苷酸在细菌中作为全局性调控因子，响应多种物理和营养胁迫。其响应迅速，可在数秒内启动，导致其浓度迅速积累至接近甚至超过 GTP 池的水平。当胁迫解除时，(p)ppGpp 会迅速降解，半衰期通常不足一分钟。(p)ppGpp 的存在会引起细胞基因表达和代谢的改变，从而抵消胁迫带来的损伤。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有不同的响应机制，但二者均依赖于 (p)ppGpp 的浓度。因此，在关键的胁迫转换期，有必要在从10秒到数小时不等的时间间隔内，同时监测多个放射性标记的细菌培养物。本实验方案旨在解决这一技术难题。该方法利用温度和摇床可控的微量滴定板培养箱，可并行监测生长情况（吸光度）并快速取样均一磷酸盐放射性标记的培养物，随后通过聚乙烯亚胺-纤维素薄层色谱法分离并定量核苷酸池。该方法仅需少量样品，即可完成多次技术重复和生物学重复分析。诸如双相生长及快速 (p)ppGpp 转换速率等复杂的生长转换过程，均可通过此方法进行定量评估。

引言

（p）ppGpp 是一种全局性调控的第二信使，可调节大量基因的表达，包括核糖体和氨基酸合成相关基因^1,2。尽管最初在Escherichia coli中被发现³，（p）ppGpp 也存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，以及植物叶绿体中^4,5。对于大肠杆菌（E. coli）及其他革兰氏阴性菌而言，（p）ppGpp 可在两个不同位点直接与RNA聚合酶相互作用^6,7,8。在革兰氏阳性菌中，（p）ppGpp 抑制GTP的丰度，而GTP的变化可被CodY蛋白感知；CodY是一种GTP结合蛋白，具有特异性的DNA识别基序，从而介导基因表达调控^9,10。（p）ppGpp 在多种营养缺乏和应激条件下会积累，导致生长减缓，并通过调节基因表达帮助细胞适应压力环境^11,12。

ppGpp 的净积累量反映了合成酶与水解酶活性之间的平衡。E. coli 中，RelA 是一种强效合成酶，而 SpoT 具有双重功能，兼具强效水解酶和弱效合成酶活性，这两种酶可能在不同应激条件下以不同方式受到调控。当核糖体 A 位点上与密码子匹配的氨酰-tRNA 供应不足，无法满足蛋白质合成需求时，强效 RelA 合成酶即被激活^13,14,15。弱效 SpoT (p)ppGpp 合成酶则在其他应激条件下被激活，同时其强效 (p)ppGpp 水解酶活性受到抑制。在某些情况下，ACP 或 Rsd 等蛋白质可与 SpoT 结合，从而改变水解与合成之间的平衡^16,17。在革兰氏阳性菌中，(p)ppGpp 的合成与水解反映了一种更为复杂的平衡，涉及一种兼具强效合成与水解活性的单一 RelA/SpoT 同源蛋白（RSH），以及若干较小的水解酶和/或合成酶¹²。

（p）ppGpp核苷酸最初是在氨基酸饥饿诱导的严谨反应过程中，通过薄层色谱（TLC）自显影图上出现的异常³²P标记斑点被发现的³。更详细的标记方法已有综述¹⁸。本文所述方案（图1）是对这些方法的改进，可在微孔板上同时监测多个样品的生长情况。该方法便于对（p）ppGpp丰度变化进行多次生物学和实验技术上的重复测定，最初是为双相生长转换的研究 而开发的¹⁹。使用³²P标记（p）ppGpp并结合TLC检测，还可用于测定（p）ppGpp的降解速率。此外，已有其他方法被开发用于测定（p）ppGpp水平，如质谱法、 HPLC²⁰、荧光化学传感器^21,22，以及将GFP基因融合至受ppGpp影响的启动子上进行检测^23,24。目前荧光化学传感器的应用仍受限，因其在结合ppGpp后光谱位移较小，且难以区分ppGpp与pppGpp²¹。该方法适用于体外检测（p）ppGpp，但不适用于细胞提取物中的检测。基于HPLC的方法虽已有改进²⁰，但需要昂贵的设备，且难以适用于高通量分析。最后，GFP融合方法可估计ppGpp依赖性的激活或抑制效应，但并不能直接测量ppGpp本身。尽管上述替代方法各有价值，但它们或需昂贵设备，或需要大量手动操作时间，或难以实现多次动力学取样及后续处理。而本文所述方法可在约20分钟内将96个样品点样至6块TLC板上（每板18个样品），在数小时内完成TLC展开，定量数据则可在数小时或过夜曝光后获得，具体时间取决于标记强度。

方案

1. 培养基制备

1. 对于MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）培养基²⁵，使用1/10体积的10倍浓缩MOPS盐溶液、1/100体积的100倍浓缩微量元素溶液、用于过夜培养的3 mM磷酸钠或用于³²P均匀标记的0.2 mM磷酸钠、0.2%葡萄糖以及1 µg/mL硫胺素（维生素B1）。如需要，添加氨基酸至终浓度40 µg/mL。
   1. 配制MOPS盐溶液时，使用以下成分：400 mM MOPS、40 mM Tricine、0.1 mM FeSO₄、95 mM NH₄Cl、2.6 mM K₂SO₄、5 µM CaCl₂、10.56 mM MgCl₂和500 mM NaCl。按上述顺序依次加入各组分，以避免沉淀。用KOH调节pH至7.4，并通过过滤除菌。
   2. 配制100倍浓缩微量元素溶液时，使用以下成分：3 µM (NH₄)₆(MO₇)₂₄、0.4 mM H₃BO₄、30 µM CoCl₂、10 µM CuSO₄、80 µM MnCl₂和10 µM ZnSO₄。通过高压灭菌除菌。
   3. 葡萄糖（20%）和磷酸钠（300 mM）溶液应分别作为100倍浓缩液高压灭菌。硫胺素和氨基酸混合物的100倍浓缩液则通过过滤除菌。每次实验均需使用无菌储备液新鲜配制培养基。

2. 使用 ³²P 标记

1. 在含有 3 mM 磷酸钠的 MOPS 培养基中培养过夜菌液。
2. 在 24 孔板中，每孔加入 550 µL 含有 0.2 mM 磷酸钠载体的 MOPS 培养基和 30 µL 细菌接种物（1/20 稀释度），使初始接种量的 OD_600nm 达到 0.1。设一孔仅含新鲜培养基作为空白无菌对照。
3. 将 24 孔板置于 37 °C 摇床培养箱中，以 900 rpm 振荡培养 30 分钟。培养过程中由底部加热，振荡提供通气。需用胶带将板固定牢固，防止倾斜或洒漏。可通过平行设置另一块不含 ³²P 的培养基板，在相同条件下使用酶标仪监测菌液生长情况。
4. 向每孔加入 100 µCi 的 ³²P 正磷酸盐（取自 5 mCi/mL 储液的 20 µL）。
   注意：放射性活度可根据实验需求进行调整。对于低基础水平的检测，使用 100 µCi 放射性标记物配合 0.2 mM 载体磷酸盐效果良好；但若需测量预计与 GTP 池相当的 (p)ppGpp 水平，可将标记量降至 25 或 50 µCi。不建议将载体磷酸盐浓度降至 0.2 mM 以下，以免磷酸盐浓度限制细菌生长。
   警告： ³²P 为 β 射线发射同位素，操作时应采用符合安全规范的适当屏蔽。所有放射性物质必须按照相关规定妥善处理，并采取一切可能的预防措施。
5. 在摇床培养箱中继续培养 1 至 2 个倍增时间（1 小时或更长），使外源标记物与细胞内核苷酸池基本达到平衡，随后再施加应激处理。

3. 诱导应激或饥饿

1. 根据所研究的应激类型，选择适当的方法诱导应激，例如添加代谢通路抑制剂、改变温度、耗尽必需营养物质、改变渗透压、诱导氧化应激、添加毒素等。
   1. 例如，添加 100 µg/mL L-缬氨酸以诱导异亮氨酸饥饿 E. coli K-12 菌株。诱导 5 分钟后将观察到 ppGpp 水平升高。

4. 取样与ppGpp提取

1. 取每种标记的细胞样品 20 µL，加入含有 20 µL 冰冷 6 M 甲酸的 0.2 mL PCR 管中。
2. 立即将样品置于干冰中。
3. 通过三次冻融循环以提高细胞提取效率。
4. 在点样 PEI 纤维素薄层色谱板前，将样品在最大转速下离心 1 分钟，使细胞碎片沉淀，避免将其点样到色谱板上。

5. 薄层色谱法

1. 用软铅笔在20 cm × 20 cm的PEI-纤维素薄层色谱板上距离边缘1 cm处划出起始线，该色谱板顶部已用剪刀剪去5 cm。将每个样品5 µL以液滴形式点样于PEI表面。点样后立即开始上行展开，不要让斑点干燥，以减少拖尾现象，提高分辨率。
2. 在展开槽中进行上行展开，槽内加入1.5 M KH₂PO₄（pH 3.4）溶液，液层深度应足够浅，确保液体不会接触起始线上的样品点。用密封盖封闭展开槽，使液体沿剪裁后的色谱板上升至顶端（15 cm）。为获得pH 3.4的1.5 M KH₂PO₄溶液，需通过添加H₃PO₄调节pH值。
3. 取出完全展开的色谱图，在室温下空气中干燥。
4. 将色谱图顶部含有游离³²P的区域（即pH前沿部分）剪下并作为放射性废物处理。该部分在图2中以黄色表示，并可在紫外光下清晰观察。若仅检测迁移速度慢于GTP的(p)ppGpp核苷酸，建议同时运行紫外-可见光GTP标准品，然后剪除更大的上部区域（即GTP以上的全部部分，如图2所示）。
5. 将自显影胶片与磷屏一起曝光过夜。
6. 显影胶片，并使用磷屏成像仪捕获和定量磷屏信号。

6. (p)ppGpp 的定量分析

1. 使用 Image J^26,27 对放射性斑点进行定量。
   注意： (p)ppGpp 的量可归一化为每个样品中观察到的总 G 核苷酸量（图 2）。如果背景信号均匀，可通过减去一个空白区域（图 2 中的 4 号框）来校正背景。总 G 为检测到的 GTP、ppGpp 和 pppGpp 的总和。该归一化方法假设 GMP 和 GDP 水平可忽略不计，这在 E. coli 中成立。将特定核苷酸的量与总 G 量相比，可有效校正加样体积的差异。

7. ppGpp降解速率的测定

注意：对该方案进行修改后，可用于测量 ppGpp 的降解速率。

1. 在施加胁迫或饥饿处理一段时间以使 ppGpp 积累（步骤 3）后，逆转胁迫条件以阻断 ppGpp 的持续合成，从而检测其水解速率。逆转方法取决于所用胁迫类型。例如，加入 200 µg/mL 氯霉素以逆转氨基酸饥饿。
2. ppGpp 的衰减速率通常较快，但可能有所差异，因此每 20–30 秒取样一次，持续至 2 分钟。样品处理方法同步骤 4。
3. TLC 展开后（如步骤 5 所述），根据时间进程获得 ppGpp 水平，将残余 ppGpp 含量对时间作半对数图，可直观呈现为直线形式的零级衰减速率，并据此估算 ppGpp 的半衰期。

结果

在 E. coli K-12 菌株中，添加缬氨酸会引发异亮氨酸的内源性饥饿，导致在 5 分钟后 ppGpp 水平升高³。在 MOPS 培养基中培养的细胞（除 ILV 外含有所有氨基酸）按 图 1 所示用 ³²P 进行标记。标记后，加入 6 µL 的 10 mg/mL L-缬氨酸（终浓度为 100 µg/mL），以诱导异亮氨酸饥饿。在添加缬氨酸后 0 和 5 分钟分别取样。5 分钟后（图 3A），ppGpp 和 pppGpp 的水平分别增加了 2 倍和 2.5 倍。作为阴性对照，使用无细胞标记样品以检测 ³²P 来源中可能存在的非正磷酸盐化合物。此外，使用 ppGpp 缺陷型菌株（ΔrelA ΔspoT）作为阴性对照有助于更准确地鉴定斑点。

通过添加蛋白质合成抑制剂氯霉...

讨论

实现细胞的近乎均匀标记是本实验方案的关键步骤。因此，使用成分明确的培养基（如MOPS或Tris培养基）至关重要，以便调控载体磷酸盐浓度和比活性。不能使用磷酸盐缓冲培养基，例如M9或培养基A。大多数成分未明确的培养基含有可变含量的磷酸盐，例如LB、胰蛋白胨和酪蛋白氨基酸。磷酸同位素³³P是一种较弱的放射性发射体，可替代³²P。这种替代的优点在于安全性更高，且半衰期为25天，而³²P的半衰期为14天。然而，³²P能量更高的辐射显著提高了检测灵敏度。必须强调操作同位素时的危险性，以及采取适当屏蔽防护和规范处置的重要性。最近发现一种能够特异性识别ppGpp²⁸的核糖开关，未来可能为在体外和体内检测ppGpp提供更安全的方法。如引言中所述，尽管存在其他检测方法，磷酸标记法仍是检测细菌（p）ppGpp以及其他磷酸化化合物（如核糖或脱氧核糖-NTP池、PRPP、PPi或糖磷酸盐）的一种灵敏、直接且快速的高通量检测手段。

另一个关键步骤是确保平行培养物（摇床培养箱...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(NH4)6(MO7)24	费舍尔科技公司	A-674
放射自显影胶片	丹维尔科学公司	E3218
CaCl2	J.T.贝克公司	1-1309
氯霉素	RPI公司	C61000-25.0
CoCl2	费舍尔科技公司	C-371
CuSO4	J.T.贝克公司	1843
FeSO4	费舍尔科技公司	I-146
甲酸	费舍尔生物科技公司	BP1215-500
葡萄糖	Macron公司	4912-12
H3BO4	Macron公司	2549-04
H3PO4	J.T.贝克公司	0260-02
K2SO4	西格玛公司	P9458-250G
KH2PO4	费舍尔生物科技公司	BP362-500
L-缬氨酸	西格玛公司	V-6504
MgCl2	费舍尔科技公司	FL-06-0303
微孔板读数仪 Synergy HT	伯腾公司	Synergy HT
MnCl2	西格玛公司	M-9522
MOPS	西格玛公司	M1254-1KG
Na2HPO4	马林克罗特公司	7892
NaCl	J.T.贝克公司	3624-01
NaH2PO4	马林克罗特公司	7917
NH4Cl	西格玛公司	A0171-500G
P-32 放射性核素，1 mL 水中的正磷酸（5 mCi）	珀金埃尔默公司	NEX053005MC
储存式磷屏	柯达公司	So230
恒温混匀仪	艾本德公司	5382000015
硫胺素	西格玛公司	T-4625
TLC PEI 纤维素 F	默克-密理博公司	1.05579.0001
Tricine	RPI公司	T2400-500.0
Typhoon 9400 成像仪	GE 医疗集团
ZnSO4	费舍尔科技公司	Z-68