Summary
Her presenterer vi protokoller for utarbeidelse av akutte hjerne skiver som inneholder lateral geniculate kjernen og elektrofysiologisk undersøkelse av retinogeniculate og corticogeniculate synapser funksjon. Denne protokollen gir en effektiv måte å studere synapser med høy-Release og lav-Release sannsynlighet i samme akutte hjerne skiver.
Abstract
Den laterale geniculate kjernen er den første reléstasjon for den visuelle informasjonen. Relay neurons av denne thalamic kjernen integrere innspill fra retinal Ganglion celler og projisere det til den visuelle cortex. I tillegg relé neurons motta ovenfra og ned eksitasjon fra cortex. De to viktigste eksitatoriske innganger til stafetten neurons variere i flere aspekter. Hver stafett Nevron mottar innspill fra bare noen få retinogeniculate synapser, som er store terminaler med mange Release nettsteder. Dette gjenspeiles av sammenlignbare sterke eksitasjon, stafetten neurons motta, fra retinal Ganglion celler. Corticogeniculate synapser, i kontrast, er enklere med få Release nettsteder og svakere Synaptic styrke. De to synapser også avvike i sine Synaptic kort sikt plastisitet. Retinogeniculate synapser har høy Release sannsynlighet og dermed vise en kortsiktig depresjon. I kontrast, corticogeniculate synapser har en lav Release sannsynlighet. Corticogeniculate fibre Traverse retikulære thalamic kjerner før du går inn i lateral geniculate kjernen. De ulike plasseringene av retikulære thalamic kjernen (rostrally fra lateral geniculate nucleus) og optiske skrift (ventro-sideveis fra lateral geniculate nucleus) tillate stimulerende corticogeniculate eller retinogeniculate synapser separat med ekstracellulære stimulering elektroder. Dette gjør lateral geniculate kjernen en ideell hjerne område der to eksitatoriske synapser med svært forskjellige egenskaper impinging på samme celle type, kan bli studert samtidig. Her beskriver vi en metode for å undersøke innspillingen fra relé neurons og å utføre detaljert analyse av retinogeniculate og corticogeniculate synapse funksjon i akutte hjerne skiver. Artikkelen inneholder en trinnvis protokoll for generering av akutte hjerne skiver av lateral geniculate kjernen og trinn for innspilling av aktivitet fra relé neurons ved å stimulere den optiske kanalen og corticogeniculate fibre separat.
Introduction
Relay neurons av lateral geniculate kjernen integrere og relé visuell informasjon til den visuelle cortex. Disse neurons motta eksitatoriske innspill fra Ganglion celler via retinogeniculate synapser, som gir de viktigste eksitatoriske stasjonen for relé neurons. I tillegg relé neurons motta eksitatoriske innganger fra kortikale neurons via corticogeniculate synapser. Videre relé neurons motta hemmende innganger fra lokale interneurons og GABAergic neurons av kjernen reticularis thalami1. Kjernen reticularis thalami er til stede som et skjold mellom thalamus og cortex slik at fibrene projiserer fra cortex til thalamus og i motsatt retning må gå gjennom kjernen reticularis thalami2.
Retinogeniculate innganger og corticogeniculate innganger viser distinkte Synaptic egenskaper3,4,5,6,7,8. Retinogeniculate innganger danner store terminaler med flere Release nettsteder9,10. I kontrast, corticogeniculate innganger vise små terminaler med én utgivelse nettsteder7. I tillegg, retinogeniculate synapser effektivt drive handling potensialer for relé neurons tross utgjør bare 5 − 10% av alle synapser på stafett neurons3,8,11. Corticogeniculate synapser, derimot, fungerer som en modulator av retinogeniculate sendinger ved å kontrollere membranen potensialet i relé neurons12,13.
Disse to viktigste eksitatoriske innganger til stafett neurons er også funksjonelt annerledes. En fremtredende forskjell er kortsiktig depresjon av retinogeniculate synapser og kortsiktig tilrettelegging av corticogeniculate synapser3,5,8. Kortsiktige plastisitet refererer til et fenomen der Synaptic styrke endres når synapse er gjentatte ganger aktiv innen en periode på noen millisekunder til flere sekunder. Synaptic Release sannsynlighet er en viktig faktor underliggende kortsiktige plastisitet. Synapser, med en lav første utgivelse sannsynlighet, viser kortsiktig tilrettelegging på grunn av oppbygging av ca2 + i presynapse og følgelig en økning i utgivelsen sannsynligheten er observert ved gjentatt aktivitet. I kontrast, synapser med høy Release sannsynlighet vanligvis vise kortsiktig depresjon på grunn av tømming av ferdige releasable blemmer14. I tillegg bidrar desensitization av postsynaptic reseptorer til den kortsiktige plastisitet i noen High-Release sannsynlighet synapser8,15. Høy Release sannsynlighet og desensitization av α-amino-3-AHA-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) reseptorer bidra til fremtredende kortsiktig depresjon av retinogeniculate synapser. I kontrast er lav-Release sannsynlighet ligger på kort sikt tilrettelegging av corticogeniculate synapser.
I mus, kommer den optiske kanalen inn i rygg geniculate kjernen (dLGN) fra caudolateral stedet, mens corticogeniculate fibre kommer inn i dLGN-rostroventrally. Avstanden mellom de to innganger gjør det mulig for etterforskningen av de enkelte egenskapene til to svært forskjellige eksitatoriske innganger impinging på samme celle. Her bygger vi på og forbedrer en tidligere beskrevet disseksjon metode der retinogeniculate og corticogeniculate fibre er bevart i akutte hjerne skiver3. Deretter beskriver vi den elektrofysiologisk etterforskningen av relé neurons og stimulering av retinogeniculate og corticogeniculate fibre med ekstracellulære stimulering elektroder. Til slutt gir vi en protokoll for fylling av relé neurons med biocytin og påfølgende anatomiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble godkjent av det statlige tilsyns panelet om dyre eksperimenter i Rheinland-Pfalz.
1. løsninger
- Disseksjon løsning
- For å redusere excitotoxicity, utarbeide en kolin-basert løsning som skal brukes under disseksjon som presenteres her (i mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 kolin klorid, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, og 25 glukose. Klargjør disseksjon løsningen mindre enn 1 uke før eksperimentet.
- Innspilling løsning
- Forbered en kunstig cerebral spinalvæske (ACSF) løsning som inneholder (i mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, og 25 glukose. Legg 50 μM D-APV og 10 μM SR 95531 Hydrobromide for å blokkere N-metyl-D-aspartate (NMDA) og GABAen reseptorer, henholdsvis.
- Intracellulære løsning
- Forbered en intracellulære løsning som inneholder (i mM): 35 cs-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA og 0,1 D-600 (methoxyverapamil hydrochloride). Juster pH til 7,3 med CsOH. Filtrer, alikvot og oppbevar lager løsningen ved-20 ° c til bruk.
2. disseksjon
- Forbered to Slice kamre, hvorav en er fylt med 100 mL av disseksjon løsning og den andre med 100 mL av innspillingen løsning. Plasser de to kanner i et vannbad (37 ° c) og boble løsningene med carbogen i minst 15 minutter før disseksjon.
- Fyll et plast beger med 250 mL nær iskald (men ikke frosset) disseksjon oppløsning. Boble med carbogen minst 15 min før bruk.
- Fyll en plastikk Petri parabolen (100 mm x 20 mm), der hjernen disseksjon vil bli utført, med kaldt disseksjon løsning. Legg et stykke filter papir i lokket på Petri-fatet.
- Kjøl ned disseksjon kammeret til vibratome.
- Bedøve en mus med 2,5% isoflurane, f. eks, i muse buret. Så snart musen ikke reagerer på en hale klype, halshugge musen nær cervical forlengede og senk hodet inn i iskald disseksjon løsning i bunnen av Petri parabolen.
- Skjær huden på hodet fra caudal til nese og holde den sidelengs med fingrene til å utsette skallen. For å ta ut forebrain, først kutte skallen sammen med bakre-fremre midtlinjen, og deretter skjære to ganger gjennom koronale Sutur og lambdoid Sutur (figur 1a).
- Fjern skallen mellom koronale Sutur og lambdoid Sutur slik at cerebrum er eksponert. Skjær olfactory pære og Skill forebrain fra mellomhjernen med et fint blad (figur 1B). Fjern hjernen fra skallen med en tynn slikkepott og legg den på filteret papir i lokket på Petri parabolen.
Merk: trinn 2,6 og 2,7 bør utføres så raskt som mulig for å redusere celle dødsfallet. - For å bevare integriteten til de sensoriske og kortikale inngangene til dLGN i hjerne sektoren, skiller du de to halvkulene med en parasagittal som er skåret med en vinkel på 3 − 5 ° (figur 1C,D). Tørk de mediolateral flyene på de to halvkulene ved å plassere dem på filter papiret og deretter lime dem på skjære trinnet med en vinkel på 10 − 25 ° fra det horisontale planet (figur 1e).
- Plasser scenen i midten av metall bufferbrettet og forsiktig helle resten av iskald disseksjon løsning i bufferbrettet. Utfør dette trinnet nøye siden en sterk helle kan fjerne den innlimte hjernen (figur 1F).
- Plasser bufferbrettet i det iskalde brettet, noe som bidrar til å opprettholde den lave temperaturen under disseksjon. Skjær 250 μm skiver med et barberblad med en hastighet på 0,1 mm/s og en amplitude på 1 mm.
- Hold skiver i Holding kammeret fylt med oksygenrikt disseksjon løsning ved 34 ° c i ca 30 min og deretter la skiver å gjenopprette i innspillingen løsning ved 34 ° c for ytterligere 30 min.
- Etter utvinning, fjerne skive holde kammer fra vannbad og holde skiver ved romtemperatur (RT) til brukt i eksperimenter.
3. elektrofysiologi
- Trekk Pipetter med Borosilikatglass glass kar og en filament avtrekker. Oppretthold motstanden i opptaks Pipetter ved 3 − 4 MΩ. Trekk stimulerende Pipetter med samme protokoll, men Bryt spissen litt etter at du har dratt for å øke diameteren. Fyll inn opptaks Pipetter med den intracellulære løsningen og biocytin, mens du fyller stimulerende Pipetter med opptaks løsningen.
- Plasser skivene i opptaks kammeret og kontinuerlig perfuse skiver med oksygenrikt opptak løsning på RT. Sjekk alle skiver og velg de som viser en intakt optikk.
- Visualiser skive og celler med en oppreist mikroskop utstyrt med infrarød differensial interferens kontrast (IR-DIC) video mikroskopi.
Merk: Relay neurons er differensiert fra interneurons av deres større Soma størrelse og mer primære dendrites (grener dukker opp fra Soma). Interneurons vise bipolar morfologi med en mindre Soma. - Plasser stimulerende pipette på stykket før du patching cellen med innspillingen pipette. For å undersøke retinogeniculate synapser, plasser den stimulerende pipette direkte på den optiske kanalen, der axon fibrene fra Netthinne Ganglion celler er buntet sammen (figur 2a). For å analysere corticogeniculate synapser, plasser stimulerende elektroden på nucleus reticularis thalami, som er rostroventrally ved siden av dLGN (figur 2b).
- Når opptaks pipette er nedsenket i opptaks løsningen, Påfør et spennings trinn på 5 mV for å overvåke pipette motstanden. Sett holde potensialet til 0 mV og avbryte offset potensialet slik at holde strømmen er 0 pA.
- Tilnærming cellen med innspillingen pipette mens du bruker positivt trykk. Når pipette er i direkte kontakt med cellemembranen, slipp det positive trykket, og sett Holding potensialet til-70 mV. Påfør en svak Undertrykk for å la cellemembranen feste til glasset pipette slik at en gigaohm segl former (motstand > 1 GΩ). Kompensere pipette kapasitans og åpne cellen ved anvendelse av negative trykkpulser.
- For å undersøke Synaptic-funksjonen, Påfør 0,1 MS strøm pulser (ca. 30 μA) via stimulering pipette. Hvis ingen svar på Synaptic er observert, kan de stimulerende Pipetter måtte skiftes ut. Vær forsiktig når du plasserer de stimulerende Pipetter i en annen posisjon slik at den registrerte cellen ikke går tapt.
Merk: i eksempelet opptakene vist i figur 2, Synaptic kort sikt plastisitet ble undersøkt ved å stimulere den optiske tarmkanalen eller corticogeniculate fibre to ganger med 30 MS Inter-stimulans intervaller. Det sammenkoblede puls forholdet (PPR) ble beregnet ved å dele amplituden til den andre eksitatoriske postsynaptic strømmen (EPSC) av den første EPSC (EPSC2/EPSC1). Hver stimulering protokollen ble gjentatt 20 ganger. EPSC amplitude ble målt fra gjennomsnittlig strøm av de 20 feier. Tidsintervallet mellom hver repetisjon var minst 5 s for å unngå kortsiktig plastisitet indusert av repetisjoner. - Overvåk serie motstanden kontinuerlig ved å bruke et spennings trinn på 5 mV. Bare bruk cellene med serien motstand mindre enn 20 MΩ for analyse.
4. Biocytin merking
- Oppretthold hele celle konfigurasjonen i minst 5 min for å tillate spredning av biocytin i den dendrites.
- Etter innspillingen, forsiktig fjerne pipette fra cellen slik at Soma ikke er ødelagt.
Merk: Hvis mer enn én celle er registrert på en skive, bør deres somas være tilstrekkelig bort fra sine nærliggende celler. Kontroller at dendrites fra forskjellige celler ikke forstyrrer hverandre under bildebehandling. - Forbered en 24-brønn cellekultur plate. Fyll hver brønn med 300 μL av 4% paraformaldehyde (PFA). Pass på å ikke forurense noe med PFA som vil være i kontakt med skiver som skal registreres.
- Overfør skivene fra opptaks kammeret til PFA-inneholdende plate med en gummi pipette og fest skivene over natten. Sørg for at pipette alltid er forhindret fra PFA-forurensning.
FORSIKTIG: Bruk alltid hansker og bruke en kjemisk hette når du manipulerer PFA. - Etter å ha fikset skiver over natten i PFA, Erstatt PFA med fosfat-bufret saltvann (PBS). Oppbevar skivene i PBS ved 4 ° c for fremtidig behandling (mindre enn 2 uker).
- Vask skiver med fersk PBS 3 ganger (10 min hver vask).
- Blokker ikke-spesifikke bindings områder ved å incubating sektorene i blokkerings løsningen (0,2% ikke-ioniske overflateaktivt middel og 5% storfe serum albumin i PBS) for 2 timer ved RT på en orbital shaker.
- Forkast blokkerings løsningen. Ruge skiver med streptavidin-Alexa 568 fortynnet i blokkerings løsningen (1:1000) ved 4 ° c over natten på en orbital shaker.
- Kast antistoff oppløsningen og vask skiver 3 ganger med PBS for 10 min ved RT på en orbital shaker. Vask skivene med vann fra springen før montering.
- Sett skivene fra en mus på ett glass lysbilde. Kontroller at de fargede cellene er til stede på den øverste overflaten av sektorene. Absorber vannet rundt skiver med vev og deretter la skiver tørke i ca 15 min.
- Påfør to dråper montering medium på hver skive. Monter en dekkglass på lysbildet uten å produsere luftbobler.
- Oppbevar de merkede sektorene ved 4 ° c etter visualisering med et konfokalmikroskopi mikroskop.
5. Cellular tenkelig og rekonstruksjon
- Skann skiver med et konfokalmikroskopi mikroskop og bruk tilhørende programvare for analyse.
- Opphisse fluorescens på 561 NM.
- Image skivene med 0,7 numerisk blenderåpning (NA), olje-nedsenking mål.
- Juster den målrettede cellen midt i visningen, og bruk en 2,5 ganger forstørrelse.
- Gjengi Z-stakken datasett å skanne hele Nevron med følgende parametere: format = 2 550 x 2 550 piksler, skannefrekvens = 400 Hz, Z nummer = 40. Voxel størrelse var rundt 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
- Semi-automatisk spore neurons ved hjelp av en neuronal rekonstruksjon programvare (f. eks NeuronStudio). Et eksempel på en 3D spores relé Nevron er vist i figur 3b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stykket utarbeidelse av dLGN inneholder retinogeniculate og corticogeniculate trasé er vist under et 4X objektiv (figur 2). Axons av retinal Ganglion celler bunt sammen i den optiske kanalen (figur 2). Den stimulerende pipette ble plassert på den optiske kanalen for å indusere retinogeniculate synapse-mediert strøm (figur 2a) og på nucleus reticularis thalami for å indusere corticogeniculate synapser-mediert strøm (fig. 2b), henholdsvis. Av notatet, axons fra kortikale neurons til LGN neurons prosjekter fra cortex til thalamus krysse kjernen reticularis thalami. Corticogenicluate synapser kan derfor aktiveres ved stimulering i nucleus reticularis thalami.
Den sammenkoblede-puls ratio av AMPA reseptor-mediert EPSCs er under 1 når stimulere den optiske luftveiene med 30 MS Inter-stimulans intervall, men over 1 når stimulere corticogeniculate fibre med samme Inter-stimulans intervall (figur 2C,D) . Den sammenkoblede-puls depresjon av retinogeniculate synapser skyldes en høy vesicle Release sannsynlighet og desensitization av postsynaptic AMPA reseptorer. Den sammenkoblede puls tilrettelegging av corticogeniculate synapser er konsistent med en lav vesicle Release sannsynlighet16.
Figur 3a viser IR-dic bilde som viser Soma av en dLGN relé Nevron sammen med spissen av plasteret pipette. Biocytin farging gjør oss i å få en visning av den innspilte Nevron. Forskjellig fra interneurons, som har Bipolar morfologi, relé neurons har multipolar dendrittiske arbors (figur 3b) inneholder mer enn 3 primære dendrites8,17. Tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av en biocytin-merket relé Nevron ble deretter generert som viser en radielt symmetrisk dendrittiske arkitektur (figur 3c).
Figur 1 : Ordninger som representerer disseksjon-protokollen. (A) horisontal visning av musen skallen, som viser plasseringen av de første kuttene. Det første kuttet ble utført sammen med sagittal Sutur, etterfulgt av ytterligere to kutt sammen med koronale Sutur og lambdoid Sutur, henholdsvis. Stiplede linjer representerer snittene. (B) sagittal syn på hele hjernen. Stiplede linjer indikerer at cerebrum er isolert fra olfactory pære og mellomhjernen. (C-D) Disse panelene viser den første kutte vinkelen for å skille de to halvkuler fra horisontal (C) og koronale (D) visning, henholdsvis. (E) koronale visning av en halvkule på skjære scenen. Stiplede linjer angir skjære retningen. l, m, d, og v representerer lateral, midtre, rygg og ventrale aspekter, henholdsvis for halvkule i paneler D og E. (F) diagram av disseksjon kammer med to halvkuler på skjære scenen. Den stiplede pilen indikerer den bevegelige retningen på skjærebladet. a, p, og d representerer henholdsvis de fremre, bakre og rygg delene av venstre halvkule. (G) Scheme representerer en riktig kuttet skive med en relativt stor del av dLGN og intakt bevaring av optiske luftveiene. dLGN, rygg lateral geniculate kjerne; vLGN, ventrale lateral kjerne; OT, olfactory pære; NRT, Nucleus reticularis thalami. Paneler C, D og G er blitt modifisert fra figur 1 av Turner og salt3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Slice utarbeidelse av dLGN inneholder retinogeniculate og corticogeniculate trasé og eksempel innspillinger. (A-B) Disse panelene viser en dLGN skive med bevaring av retinogeniculate og corticogeniculate innganger. Stimulering elektroden ble plassert på den optiske kanalen for å aktivere retinogeniculate synapser (A) og på nucleus reticularis thalami for å aktivere corticogeniculate synapser (B). (C) AMPA reseptor-mediert EPSCs som svar på stimulering av den optiske kanalen to ganger med 30 MS Inter-stimulans intervall. (D) Corticogeniculate synapse-mediert strøm med 30 MS Inter-stimulans intervall. Den stimulering gjenstander ble fjernet for klarhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Morfologiske analyse av en relé Nevron. (A) IR-dic bilde som viser Soma av en dLGN relé Nevron med spissen av plasteret pipette. (B) konfokalmikroskopi bilde av en stafett Nevron merket med biocytin og avbildet med Streptavidin-Alexa 568. (C) tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av samme Nevron, viser en radielt symmetrisk dendrittiske arkitektur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en forbedret protokoll basert på en tidligere publisert metode3, som gjør det mulig for etterforskningen av den høye sannsynligheten for Release retinogeniculate synapser og lav sannsynlighet for Release corticogeniculate synapser fra samme stykke. Dette er av stor betydning siden disse to innganger samhandle med hverandre for å modulere den visuelle signaloverføring: retinogeniculate innganger er de viktigste eksitatoriske kjøring av relé neurons, mens corticothalamic innganger fungere som en modulator, som påvirker gevinsten av retinogeniculate overføring ved å påvirke tilstanden til relé neurons. Som forventet, observerte vi at retinogeniculate og corticogeniculate synapser vise ulike kortsiktige plastisitet på grunn av forskjellen i sin utgivelse sannsynligheter. I tillegg AMPA reseptor desensitization også bidrar til sterk depresjon i retinogeniculate synapser9,15,16. Vi har nylig vist at kortsiktig depresjon er modulert av CKAMP4416, en AMPA reseptor hjelpe protein av CKAMP familien som bremser utvinningen fra desensitization av AMPA reseptorer18,19, 20. Videre er retinogeniculate synapse-mediert nåværende amplituder er høyere enn for corticogeniculate synapse-mediert strømninger under samme stimulerende styrke, i samsvar med den store retinogeniculate synapser med flere slippe nettsteder, og relativt små corticogeniculate synapser7,21.
Den kutting protokollen er i hovedsak den samme som den som er utviklet av Turner og salt3. Noen modifikasjoner som var basert på vår erfaring forbedret skive kvalitet. I likhet med Hauser et al.22, brukte vi en kolin-basert i stedet for en sukrose-basert disseksjon løsning. Recovery etter disseksjon ble gjort ved 34 ° c i skjæring løsning i 30 min og deretter i innspillingen løsning for en annen 30 min og ikke ved romtemperatur. Skiver var litt tynnere (250 μm i stedet for 400 μm). Vi dissekert hjernen ved hjelp av en kile med en vinkel på 10 − 25 °, noe som forenkler og øker påliteligheten til kutting prosedyren.
Opptak og stimulering forhold for undersøkelse av relé Nevron synapse funksjon er i hovedsak de samme som tidligere beskrevet av Chen og Regehr8. Aktivering av optiske skrift fibre vanligvis utløser store strømninger og kan være i størrelsesklasse flere nA når alle retinogeniculate synapser på en relé neurons er aktivert23. For å hindre serie motstands feil, spesielt når du undersøker maksimal strøm ved å aktivere alle retinogeniculate synapser på en relé neurons, Chen og Regehr brukt opptak lav motstand Pipetter (< 2 MΩ). Men for å undersøke Synaptic kortsiktige plastisitet, er det nok å aktivere en eller noen retinal Ganglion celle axons, som utløser strømmer som er i størrelsesforholdet 34 − 579 pA (upubliserte resultater, Chen et al.). Mindre Pipetter med motstand mellom 3 − 4 MΩ kan derfor brukes ved undersøkelse av retinogeniculate synapse funksjon ved bruk av svak stimulering av den optiske kanalen. Aktivering av corticogeniculate synapser utløser relativt små strømmer16. Seriemotstand feil er derfor et mindre problem når gransker corticogeniculate synapse funksjon.
Vi her viser at stimulering av retinogeniculate og corticogeniculate synapser kan brukes til å undersøke kortsiktige plastisitet av AMPA reseptor-mediert strømninger. Den samme protokollen kan brukes til posten NMDA reseptor-mediert gjeldende24. Faktisk, en av de første indikasjoner på at AMPA reseptor desensitization bidrar til kortsiktig plastisitet i retinogeniculate synapser kom fra eksperimenter der sammenkoblet-pulsen prosenter av AMPA reseptor-mediert strømninger ble sammenlignet med par-puls prosenter av NMDA reseptor-mediert strømninger. Corticogeniculate synapser ble stimulert av posisjonering av stimulering pipette i kjernen reticularis thalami fordi axons av kortikale neurons som opphisse dLGN relé neurons reise over denne thalamic kjernen. Den samme stimulering posisjon kan brukes til å studere hemmende Synaptic strømninger i dLGN som vist for eksempel ved Govindaiah og Cox25.
Relay neurons uttrykke GABAA og GABAB reseptorer. Utgivelsen av GABA aktiverer Synaptic GABAA reseptorer. GABAB -reseptorer, som er extrasynaptically lokalisert, aktiveres når nucleus reticularis thalami er sterkt aktivert for eksempel under burst avfyring26,27,28. Smitteeffekter av GABA, som vanligvis er begrenset på grunn av GABA opptak av astrocytter, kan aktivere under intens synapse aktivering av extrasynaptic GABAB reseptorer27,28. Vi har ikke blokkere GABAB reseptorer fordi stimulering intensitet og frekvens var sammenlignbare lav. Men når man undersøker corticogeniculate synapse funksjon ved hjelp av intens stimulering protokoller det kan være å foretrekke å legge GABAB reseptorer.
Innspillinger av dLGN relé neurons kan lett utføres når du bruker skiver som er ca 2 mm midtre fra den laterale overflaten av hjernen (begynne å samle ca 8th av 250 μm skiver under skjæring prosedyre). I noen skiver, ikke begge innganger til en gitt relé Nevron kan oppdages fordi en av de to veiene er kuttet nær relé Nevron. I dette tilfellet er det vanligvis fortsatt mulig å undersøke retinogeniculate og corticogeniculate synapser i samme skive ved å velge ulike relé neurons for hver input. For å spille inn retinogeniculate synapse mediert strøm, ventrally ligger relé neurons er valgt siden optisk skrift fiber til disse cellene er mer sannsynlig bevart enn i dorsalt plassert relé neurons. I kontrast, corticogeniculate innganger er mer sannsynlig bevart på relé neurons som er plassert dorsalt i dLGN.
Slice kvalitet bestemmer påliteligheten av dataene. Basert på vår erfaring, følgende parametre er avgjørende for å sikre god skive kvalitet. Kjøling og oksygenering er viktige faktorer under disseksjon prosedyren. Hodet av musen må holdes i kaldt løsning umiddelbart etter halshogging av musen. Når du tar hjernen ut av skallen, bør det være nedsenket i iskald løsning hver 3 til 4 s for å redusere celle død. På samme måte bør kutting prosedyren utføres på rundt 4 ° c. Videre må disseksjon løsning og opptaks løsning være oksygen minst 15 min før bruk for å opprettholde tilstrekkelig oksygen konsentrasjon. I tillegg blokkerer natrium kanaler effektivt kan redusere Nevron aktivitet. Derfor, en disseksjon løsning som inneholder 37,5 mmol kolin ble brukt.
Relay neurons vise lav terskel toppene, som er generert av transient ca2 + nåværende29. For å blokkere spennings gated ca2 +-kanaler, la vi til D-600 (methoxyverapamil) til den intracellulære løsningen. D-600 bør ikke brukes hvis formålet med studien er å undersøke lav terskel toppene i relé neurons. Presisjonen av hele-celle spenning klemme innspillinger påvirkes av plass klemme feil. Dette tekniske problemet er mer relevant for innganger som er langt borte fra opptaks elektroden (således for fjernt synapser)30,31. For å minimere virkningen av plass klemme feilen, brukte vi en cs+-basert i stedet for en K+-baserte intracellulære løsning. Kanaler som er K+ gjennomtrengelig (for eksempel lekke kanaler) er vanligvis cs+ ugjennomtrengelig32. Således, bruk av en cs+-basert intracellulære løsning øker impedans i cellen.
Stabil patch klemme opptak avhenger av valg av sunne celler. Neurons med rund Soma form, mørk farge eller hovne Soma bør unngås. Videre er relé neurons skilles fra de lokale interneurons av deres større Soma størrelse og mer forseggjort primære dendrittiske arbors. Derfor valgte vi celler som har større Soma størrelse (større enn 15 μm i diameter) og ikke-bipolar morfologi. Eksempelet celle vist i figur 3b har en symmetrisk dendrittiske arkitektur og kan derfor klassifiseres som relé Nevron ligner Y-neurons som er for eksempel funnet i katten LGN17.
Serie motstanden bør være så liten som mulig og opprettholdt konstant. Videre, siden innganger fra to retninger er bevart i en skive, er det viktig å kvitte seg med interferens mellom de to innganger. For å unngå å aktivere corticogeniculate fibre når du spiller inn retinogeniculate synapse-mediert strøm eller vice versa, bør den stimulerende pipette ikke plasseres i dLGN og avstanden mellom stimulerende og opptak pipette bør være så langt som Mulig. I tillegg krever den lange avstanden mellom stimulerende og innspilling Pipetter relativt intakt axon bevaring. Derfor må en riktig skjærevinkel velges for disseksjon. Generelt kan bare én eller to skiver med bevaring av to innganger fås fra hver halvkule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har blitt finansiert av den tyske Forskningsstiftelsen (DFG) i Collaborative Research Center (SFB) 1134 "funksjonell ensembler" (J.v.E. og X.C.) og Research Grant EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
- Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
- Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
- Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
- Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
- Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
- Chen, C., Regehr, W. G.
- Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
- Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
- Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
- Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. , (1997).
- Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
- Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
- Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
- von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
- Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
- Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
- Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
- Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
- Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
- Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
- Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
- Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
- Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
- Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
- Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
- Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
- White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
- Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).
