Summary
Здесь мы представляем протоколы для подготовки острых ломтиков мозга, содержащих боковое гениальное ядро и электрофизиологическое исследование функции ретиногенулата и кортикогенулата синапсов. Этот протокол обеспечивает эффективный способ изучения синапсов с высокой и низкой вероятностью высвобождения в тех же острых срезах мозга.
Abstract
Боковое гениальное ядро является первой ретрансляционной станцией для визуальной информации. Ретрансляционные нейроны этого таламиического ядра интегрируют вход из клеток ганглия в коры и проецируют его на зрительную кору. Кроме того, реле нейроны получают сверху вниз возбуждение из коры. Два основных возбуждательных входных данных в реле нейронов отличаются несколькими аспектами. Каждый ретрансляторный нейрон получает вход только от нескольких ретиногенулатных синапсов, которые являются большими терминалами со многими местами выпуска. Это отражается на сравнительно сильное возбуждение, реле нейроны получают, от клеток ганглия в клетках клетки из корытины. Кортикогенулат синапсы, напротив, проще с несколькими местами выпуска и более слабой синаптической силой. Два синапса также отличаются по своей синаптической краткосрочной пластичности. Ретиногенулат синапсы имеют высокую вероятность высвобождения и, следовательно, отображают краткосрочную депрессию. В отличие от этого, кортикогенулатсины имеют низкую вероятность высвобождения. Кортикогенулатные волокна пересекают ретикулярные таламичные ядра перед входом в боковое гениальное ядро. Различные расположения ретикулярного таламического ядра (росттало из бокового гениального ядра) и оптического тракта (вентро-боково енерально из бокового гениального ядра) позволяют стимулировать кортикогенитулилит или ретиногениула синапсы отдельно с электродами внеклеточной стимуляции. Это делает боковое гениальное ядро идеальной областью мозга, где два возбуждающих синапса с очень разными свойствами, посягающими на один и тот же тип клеток, могут быть изучены одновременно. Здесь мы описываем метод исследования записи из ретрансляционных нейронов и для выполнения детального анализа функции ретиногенулата и кортикогенулата синапса в острых срезах мозга. Статья содержит пошаговый протокол для генерации острых ломтиков мозга бокового гениального ядра и шаги для записи активности от ретрансляционных нейронов, стимулируя оптический тракт и кортикогенулатные волокна отдельно.
Introduction
Реле нейронов бокового гениального ядра интегрировать и передать зрительную информацию в зрительную кору. Эти нейроны получают возбуждательный вход от клеток ганглия через ретиногенулат синапсы, которые обеспечивают основной возбуждательный диск для ретрансляции нейронов. Кроме того, реле нейроны получают возбуждательные входы из корковых нейронов через кортикогенулат синапсы. Кроме того, реле нейроны получают ингибирующие входы из местных интернейронов и ГАМК-нейронов ядра reticularis thalami1. Ядро reticularis thalami присутствует как щит между таламусом и корой, так что волокна, проецирование от коры к таламусу и в противоположном направлении должны пройти через ядро reticularis thalami2.
Ретиногенулат входы и кортикогенулат входы отображения различных синаптических свойств3,4,5,6,7. Retinogeniculate входы образуют большие терминалы с несколькими местами выпуска9,10. В отличие от этого, кортикогенулат входы отображают небольшие терминалы с одним релизомсайтов 7. Кроме того, ретиногенулат синапсы эффективно диск действия потенциалрел ьрентов, несмотря на составляющие только 5-10% всех синапсов на реле нейронов3,8,11. Кортикогенулат синапсы, с другой стороны, служат модулятором ретиногенулатных передач, контролируя мембранный потенциал ретрансляторных нейронов12,13.
Эти два основных возбуждательных входных данных для ретрансляции нейронов также функционально отличаются. Одним из заметных различий является краткосрочная депрессия ретиногенулатных синапсов и краткосрочноеоблегчение кортикогенулатных синапсов 3,5,8. Кратковременная пластичность относится к явлению, при котором синаптические силы изменяются, когда синапс неоднократно активен в течение периода времени от нескольких миллисекунд до нескольких секунд. Вероятность синапического высвобождения является важным фактором, лежащим в основе краткосрочной пластичности. Синапсы, с низкой начальной вероятностью выпуска, отображают кратковременное упрощение из-за накопления Ca2 в пресинапсе и, следовательно, увеличение вероятности высвобождения наблюдается при повторной активности. В отличие от этого, синапсы с высокой вероятностью высвобождения обычно отображают краткосрочную депрессию из-за истощения готовых пузырьков14. Кроме того, десенсибилизация постсинаптические рецепторы способствует краткосрочной пластичности в некоторых высоковысвеленных вероятностных синапсах8,15. Высокая вероятность высвобождения и десенсибилизация рецепторов х-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изосоксазолепрофиновой кислоты (АМРА) способствуют заметной краткосрочной депрессии ретиногенулатных синапсов. В отличие от этого, вероятность низкой высвобождения лежит в основе краткосрочного упрощения кортикогенуляционных синапсов.
У мышей, оптический тракт входит спинной боковой geniculate ядро (dLGN) из caudolateral сайте, в то время как кортикогенулатные волокна попадают в dLGN rostroventrally. Расстояние между двумя входами позволяет иссмотреть индивидуальные свойства двух очень разных возбуждающих входов, посягающих на одну и ту же ячейку. Здесь мы основопанов и улучшения ранее описанного метода вскрытия, в котором ретиногенулат и кортикогенулат волокна сохраняются в острых ломтиках мозга3. Мы описываем электрофизиологическое исследование ретрансляционных нейронов и стимуляцию ретиногеникулатных и кортикогенуляционных волокон внеклеточными электродами стимуляции. Наконец, мы предоставляем протокол для заполнения ретрансляционных нейронов биоцитином и последующего анатомического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены Правительственной наблюдательной группой по экспериментам на животных в Рейнланд-Пфальце.
1. Решения
- Решение для вскрытия
- Чтобы уменьшить excitotoxicity, подготовить холин на основе решения, которые будут использоваться во время вскрытия, как представлено здесь (в мМ): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37,5 холин хлорида, 25 NaHCO3, 1.252PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 25 глюкозы. Подготовьте раствор вскрытия менее чем за 1 неделю до начала эксперимента.
- Решение для записи
- Подготовка искусственного спинного спинного мозга (ACSF) раствор, содержащий (в ММ): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,252PO4, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, и 25 глюкозы. Добавьте 50 мкм D-APV и 10 мкм SR 95531 гидробромида, чтобы блокировать N-метил-D-аспартат (NMDA) и ГАМК-а-рецепторы, соответственно.
- Внутриклеточное решение
- Подготовьте внутриклеточный раствор, содержащий (в ММ): 35 Cs-глюконат, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA и 0.1 D-600 (гидрохлорид метоксиверапол). Отрегулируйте рН до 7.3 с CsOH. Фильтр, aliquot, и хранить складе решение на -20 градусов до использования.
2. Рассечение
- Подготовьте две срезные камеры, одна из которых заполнена 100 мл раствора вскрытия, а другая с 100 мл раствора записи. Поместите два клюва в водяную ванну (37 градусов по Цельсию) и пузырь растворы с карбогеном, по крайней мере 15 минут до вскрытия.
- Заполните пластиковый стакан 250 мл ближнего ледяного (но не замороженного) раствора вскрытия. Пузырь с карбогеном не менее 15 мин перед использованием.
- Заполните пластиковое блюдо Петри (100 мм х 20 мм), в котором будет выполнено вскрытие мозга, с холодным раствором вскрытия. Поместите кусок фильтровальной бумаги в крышку чашки Петри.
- Охладите камеру вскрытия вибратом.
- Анестезируйка мыши с 2,5% изолюран, например, в клетке мыши. Как только мышь не реагирует на щепотку хвоста, обезглавить мышь возле шейки матки медуллы и погрузить голову в ледяной раствор вскрытия в основании чашки Петри.
- Вырезать кожу головы от каудаля до носа и держать его боковой пальцами подвергать черепа. Чтобы вынуть передний мозг, сначала вырезать череп вместе с задней передней средней линии, а затем сократить еще два раза через корональный шов и лямбдаид ный шов(рисунок 1A).
- Удалите череп между корональным швом и швом лямбдоида таким образом, чтобы мозг подвергался воздействию. Вырежьте обонятельную луковицу и отделите предтеч от среднего мозга тонким лезвием(рисунок 1B). Удалить мозг из черепа с помощью тонкого шпателя и поместить его на фильтровальную бумагу в крышке чашки Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.6 и 2.7 должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы уменьшить гибель клеток. - Чтобы сохранить целостность сенсорных и корковых входов в dLGN в ломтик мозга, отделить два полушария с паразагитальной вырезать с углом 3'5 "(Рисунок 1C,D). Высушите посредственные плоскости двух полушарий, поместив их на фильтровальную бумагу, а затем приклеите их на сцену резки с углом 10–25 градусов от горизонтальной плоскости(рисунок 1E).
- Поместите сцену в центре металлического буферного лотка и аккуратно вылейте остальную часть раствора ледяного рассечения в буферный лоток. Выполните этот шаг тщательно, так как сильный залив может удалить вставить мозг(Рисунок 1F).
- Поместите буферный лоток в заполненный льдом лоток, который помогает поддерживать низкую температуру во время вскрытия. Вырезать 250 мкм ломтиками с лезвием бритвы со скоростью 0,1 мм / с и амплитуды 1 мм.
- Держите ломтики в камере хранения заполнены с кислородом раствор атсекции на 34 градусов по Цельсию в течение примерно 30 минут, а затем позволить ломтики для восстановления в растворе записи на 34 градусов по Цельсию в течение еще 30 минут.
- После восстановления снимите срез удерживая камеру из водяной ванны и держите ломтики при комнатной температуре (RT) до использования в экспериментах.
3. Электрофизиология
- Вытяните пипетки с помощью боризиликатных стеклянных капилляров и тягака нити. Поддерживайте сопротивление записывающих пипетки на уровне 3х4 МЗ. Потяните стимулирующие пипетки, используя тот же протокол, но слегка разбейте кончик после вытягивания, чтобы увеличить диаметр. Заполните записи пипетки внутриклеточным раствором и биоцитином, при этом заполняйте стимулирующие пипетки раствором записи.
- Поместите ломтики в камеру записи и постоянно наполнить ломтики с кислородом решения записи на RT. Проверьте все ломтики и выберите те, которые отображают нетронутыми оптического тракта.
- Визуализируйте срез и клетки с помощью вертикального микроскопа, оснащенного инфракрасной дифференциальной интерференцией (IR-DIC) видеомикроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ретрансляторы дифференцированы от интернейронов их большим размером сомы и более первичными дендритами (ветвями, возникающими из сомы). Интернейроны отображают биполярную морфологию с меньшей сомой. - Поместите стимулирующую пипетку на срез перед исправлениям клетки с записью пипетки. Чтобы исследовать ретиногенулат синапсы, поместите стимулирующий пипетка непосредственно на оптический тракт, где аксонволокна из клеток ганглия сетчатки в комплекте(Рисунок 2A). Для анализа кортикогенуляционных синапсов, поместите стимулирующий электрод на ядро reticularis thalami, который возтровентно примыкает к dLGN (Рисунок 2B).
- После того, как запись пипетка погружается в раствор записи, применить 5 мВт напряжения шаг для мониторинга сопротивления пипетки. Установите потенциал холдинга до 0 мВ и отмените офсетный потенциал, чтобы ток холдинга был 0 pA.
- Подойдите к ячейке с записывающей пипеткой при применении положительного давления. Когда пипетка находится в непосредственном контакте с клеточной мембраной, отпустите положительное давление и установите потенциал удержания до -70 мВ. Нанесите небольшое отрицательное давление, чтобы позволить клеточной мембране прикрепляться к стеклянной пипетке так, что образуется гигаохмная печать (сопротивление (сопротивление гигаохм). Компенсировать емость пипетки и открыть клетку с помощью импульсов отрицательного давления.
- Чтобы исследовать синаптические функции, нанесите импульсы тока 0.1 ms (около 30 ЗА) через стимуляционный пипетк. Если синаптические реакции не наблюдаются, стимулирующие пипетки, возможно, придется заменить. Будьте осторожны при размещении стимулирующих пипетков в другое положение, чтобы записанная ячейка не была потеряна.
ПРИМЕЧАНИЕ: В примере записи, показанные на рисунке 2, синаптической краткосрочной пластичности была исследована путем стимулирования оптического тракта или кортикогенулата волокон в два раза с 30 мс межстимуловых интервалов. Соотношение парного импульса (PPR) было рассчитано путем деления амплитуды второго возбуждающего постсинаптического тока (EPSC) на коэффициент первого EPSC (EPSC2/EPSC1). Каждый протокол стимуляции повторялся 20 раз. Амплитуда EPSC была измерена из средних токов 20 зачисток. Временной интервал между каждым повторением был не менее 5 с, чтобы избежать краткосрочной пластичности, вызванной повторениями. - Постоянно следите за устойчивостью серии, применяя шаг напряжения 5 мВ. Для анализа используйте только ячейки с устойчивостью серии меньше 20 МЗ.
4. Маркировка биоцитина
- Поддерживайте конфигурацию цельноклеточных элементов в течение по крайней мере 5 мин, чтобы позволить диффузии биоцитина в дистальные дендриты.
- После записи аккуратно выньте пипетку из клетки, чтобы сома не была уничтожена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если более одной клетки записаны на одном ломтике, их сомы должны быть достаточно вдали от соседних клеток. Убедитесь, что дендриты из разных клеток не мешают друг другу во время визуализации. - Подготовьте 24-колодец плиты культуры клеток. Заполните каждую скважину 300 qL 4% параформальдегида (PFA). Позаботьтесь, чтобы не загрязнять что-либо с PFA, которые будут находиться в контакте с ломтиками, которые будут записаны.
- Перенесите ломтики из камеры записи на пластину, содержащую PFA, с резиновой пипеткой и зафиксировать ломтики на ночь. Убедитесь, что пипетка всегда предотвращается от загрязнения PFA.
ВНИМАНИЕ: Всегда носите перчатки и используйте химический капюшон при манипулировании PFA. - После фиксации ломтиков на ночь в ПФА, заменить PFA с фосфат-буфером сольников (PBS). Храните ломтики в PBS при 4 градусах по Цельсию для дальнейшей обработки (менее 2 недель).
- Вымойте ломтики со свежими PBS 3 раза (10 мин каждый мыть).
- Блокируйте неспецифические обязательные сайты, инкубируя ломтики в блокирующем растворе (0,2% неионического сурфактанта и 5% бычьего сывороточного альбумина в PBS) за 2 ч на RT на орбитальном шейкере.
- Откажитесь от блокирующего решения. Инкубировать ломтики стрептавидином-Алекса 568 разбавленным в блокирующий раствор (1:1,000) при 4 градусах Цельсия в течение ночи на орбитальном шейкере.
- Откажитесь от раствора антитела и промойте ломтики 3 раза с PBS в течение 10 минут на RT на орбитальной шейкер. Вымойте ломтики с водопроводной водой перед монтажом.
- Положите ломтики одной мыши на одну стеклянную горку. Убедитесь, что окрашенные клетки присутствуют на верхней поверхности ломтиков. Поглотите воду вокруг ломтиков с тканями, а затем оставить ломтики высохнуть в течение примерно 15 минут.
- Нанесите две капли монтажной среды на каждый срез. Установите крышку на слайде, не производя пузырьков воздуха.
- Храните помеченные ломтики при 4 градусах По Цельсию после визуализации с помощью конфокального микроскопа.
5. Клеточная визуализация и реконструкция
- Сканирование ломтиков с конфокальный микроскоп и использовать связанное программное обеспечение для анализа.
- Возбуждайте флуоресценцию при 561 нм.
- Изображение ломтики с 0,7 численной диафрагмы (NA), нефть погружения цели.
- Отрегулируйте целевую ячейку в середине обзора и нанесите 2,5-кратное увеличение.
- Рендеринг наборы данных стеком для сканирования всего нейрона со следующими параметрами: формат 2550 х 2550 пикселей, частота сканирования 400 Гц, z число 40.Voxel размер был около 0,1211 х 0,1211 х 1,8463 мкм3.
- Полуавтоматический след нейронов с помощью программного обеспечения реконструкции нейронов (например, NeuronStudio). Пример 3D прослеживаемого ретранслятора нейронов показан на рисунке 3B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Срез подготовки dLGN, содержащий ретиногенулат и кортикогенулат пути показано под 4x цели(Рисунок 2). Аксоны клеток ганглия свертывали вместе в оптическом тракте(рисунок 2). Стимулирующая пипетка была помещена на оптическом тракте, чтобы вызвать ретиногенулат синапса тока(рисунок 2A) и на ядро reticularis талами, чтобы вызвать кортикогенитулового синапса-опосредованного тока (Рисунок 2B), соответственно. Следует отметить, аксоны от корковых нейронов до нейронов LGN проектов от коры до таламуса траверс ядра reticularis талами. Таким образом, синапсы Кортикогенилуата могут быть активированы путем стимуляции в ядре reticularis thalami.
Парно-импульсное соотношение АМРА рецептор-опосредованных EPSCs ниже 1 при стимулировании оптического тракта с 30 мс межстимуловый интервал, но выше 1 при стимулировании кортикогенулата волокон с тем же межстимуловым интервалом(Рисунок 2C,D) . Парно-импульсная депрессия ретиногенулатных синапсов обусловлена высокой вероятностью высвобождения везикулы и десенсибилизации постсинаптические рецепторы АМРА. Парно-импульсное упрощение кортикогенулатных синапсов согласуется с низкой вероятностью высвобождения везикулы16.
Рисунок 3A показывает изображение ИК-DIC, показывающее сому ретранслятора dLGN вместе с кончиком пипетки патча. Окрашивание биоцитина позволяет нам получить представление о записанном нейроне. В отличие от интернейронов, которые имеют биполярной морфологии, реле нейроны имеют многополярные дендритные беседки(рисунок 3B), содержащий более 3 первичных дендритов8,17. Затем была создана трехмерная (3D) реконструкция ретранслятора с маркировкой биоцитина, который показывает радиально симметричную дендритную архитектуру(рисунок 3C).
Рисунок 1 : Схемы, представляющие протокол вскрытия. (A) Горизонтальный вид черепа мыши, показывающий положение первоначальных разрезов. Первый разрез был выполнен вместе с сагитальным швом, а затем еще два пореза вместе с корональным швом и швом лямбдоида, соответственно. Dashed линии представляют разрезы. (B) Сагиттальный вид всего мозга. Dashed линии показывают, что мозг изолирован от обонятельной лампы и среднего мозга. (C-D) Эти панели показывают первый угол резки, чтобыотделить два полушария от горизонтального ( C) и коронального (D ) зрения, соответственно. (E) Корональное представление одного полушария на этапе резки. Dashed линии указывают направление нарезки. l, m, d и v представляют боковые, медиальные, дорсальные и вентральные аспекты, соответственно, для полушария в панелях D и E. (F) Диаграмма камеры вскрытия с двумя полушариями на этапе резки. Разбитая стрелка указывает на движущееся направление режущего лезвия. a, p и d представляют передние, задние и торцевые аспекты левого полушария, соответственно. (G) Схема, представляющая правильно нарезать ломтик с относительно большой частью dLGN и нетронутыми сохранения оптического тракта. dLGN, боковое боковое гениальное ядро; vLGN, брюшное боковое ядро; OT, обонятельная лампа; NRT, ядро reticularis талами. Панели C, D и G были изменены с рисунка 1 Тернера и соли3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Срез подготовки dLGN, содержащий ретиногенулат и кортикогенулат пути и примеры записей. (A-B) Эти панели показывают dLGN ломтик с сохранением ретиногенулата и кортикогенулата входов. Электрод стимуляции был помещен на оптический тракт, чтобы активировать ретиногенулат синапсы (A) и на ядро reticularis талами, чтобы активировать кортикогенулат синапсы (B). (C) АМРА рецептор-опосредованного EPSCs в ответ на стимуляцию оптического тракта в два раза с 30 мс межстимулирующего интервала. (D) Кортикогенулат синапсе-опосредованного токов с 30 мс межстимулирующего интервала. Артефакты стимуляции были удалены для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Морфологический анализ ретрансляторного нейрона. (A) ИК-DIC изображение, показывающее соому dLGN реле нейрон с кончиком патч пипетки. (B) Конфокальный образ ретранслятора нейрон оведен ный биоцитин и визуализированы с стрептавидин-Alexa 568. (C) Трехмерная (3D) реконструкция того же нейрона, показывающая радиально симметричную дендритную архитектуру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем улучшенный протокол на основе ранее опубликованного метода3, который позволяет исследует высокую вероятность высвобождения ретиногенулатных синапсов и низкую вероятность высвобождения кортикогенулатных синапсов из одного и того же среза. Это имеет большое значение, так как эти два входных данных взаимодействуют друг с другом, чтобы модулировать передачу визуального сигнала: ретиногенулатные входы являются основным возбуждательным приводом ретрансляционных нейронов, в то время как кортикоталамиковые входы функционируют как модулятор, который влияет на усиление передачи ретиногенулата, влияя на состояние ретрансляционных нейронов. Как и ожидалось, мы заметили, что ретиногенулат и кортикогенулат синапсы отображают различную кратковременную пластичность из-за разницы в вероятности их высвобождения. Кроме того, десенсибилизация рецепторов АМРА также способствует сильной депрессии в ретиногенулатных синапсах9,15,16. Недавно мы показали, что краткосрочная депрессия модулируется CKAMP4416, АМПА рецептор вспомогательного белка семьи CKAMP, что замедляет восстановление от десенсибилизации рецепторов АМРА18,19, 20. Кроме того, ретиногенулат синапса опосредованные токовые амплитуды выше, чем у кортикогенуляционных синапсов-опосредованные токи под той же стимулирующей силой, в соответствии с большими ретиногенулатными синапсами с несколькими выпуская сайты, и относительно небольшие кортикогенулатсины7,21.
Протокол нарезки по существу такой же, как тот, разработанный Тернер и соль3. Некоторые изменения, которые были основаны на нашем опыте улучшение качества ломтик. Подобно Hauser et al.22,мы использовали холин на основе вместо сахарозы на основе вскрытия решения. Восстановление после вскрытия было сделано при температуре 34 градусов по Цельсию в резочном растворе в течение 30 минут, а затем в растворе записи еще 30 минут, а не при комнатной температуре. Кусочки были немного тоньше (250 мкм вместо 400 мкм). Мы расчленили мозги с помощью клина с углом 10–25 градусов, что облегчает и повышает надежность процедуры нарезки.
Условия записи и стимуляции для исследования функции синапса ретранслятора по существу такие же, как ранее описаны Чэнь и Regehr8. Активация волокон оптического тракта обычно вызывает большие токи и может находиться в диапазоне нескольких nA, когда все ретиногенулатные синапсы на одном реле нейронов активируются23. Для предотвращения ошибок сопротивления серий, особенно при исследовании максимального тока путем активации всех ретиногенулатных синапсов на одном реле нейронов, Чэнь и Регер использовали записи пипетки низкого сопротивления (lt;2 M). Однако, чтобы исследовать синаптической краткосрочной пластичности, достаточно активировать один или несколько аксонов клеток ганглия сетчатого, который вызывает токи, которые находятся в диапазоне 34-579 pA (неопубликованные результаты, Chen et al.). Меньшие пипетки с сопротивлением между 3 х 4 МЗ могут, таким образом, использоваться при исследовании функции ретиногенулата синапса с использованием слабой стимуляции оптического тракта. Активация кортикогенуляционных синапсов вызывает относительно небольшие токи16. Ошибки сопротивления серии, таким образом, меньшая проблема при исследовании функции кортикогенулата синапса.
Мы здесь показываем, что стимуляция ретиногенулата и кортикогенуляционных синапсов может быть использована для исследования краткосрочной пластичности рецепторов АМРА опосредованного токов. Тот же протокол может быть применен для записи NMDA рецептор-опосредованный ток24. В самом деле, одним из первых признаков того, что АМРА рецептордезности десенсибилизации способствует краткосрочной пластичности в ретиногенулат синапсы пришли из экспериментов, в которых парные-пульссовы хавент-опосредованных токов АМРА были сравнены с парные и импульсные соотношения рецепторов NMDA- опосредованных токов. Кортикогенулат синапсы были стимулированы путем позиционирования стимуляции пипетка в ядре reticularis талами, потому что аксоны корковых нейронов, которые возбуждают dLGN реле нейронов путешествия через это саламическое ядро. То же положение стимуляции может быть использовано для изучения ингибирующих синаптических токов в dLGN, как показано, например, Govindaiah и Кокс25.
Реле нейронов выразить ГАМКи ГАМКB рецепторов. Высвобождение ГАМК активирует синаптических рецепторов ГАМК А. Рецепторы ГАМК B, которые экстрасинаптически локализованы, активируются, когда ядро reticularis талами сильно активируются, например, во время взрыва стрельбы26,27,28. Стриктор ГАМК, который, как правило, ограничивается из-за поглощения ГАМК астроцитов, может активировать во время интенсивной активации синапса экстрасинаптических рецепторов ГАМКB 27,28. Мы не блокировали рецепторы ГАМК B, потому что интенсивность стимуляции и частота были сравнительно низкими. Однако при исследовании функции кортикогенуляции синапса с использованием интенсивных протоколов стимуляции было бы предпочтительнее добавить рецепторы ГАМК B.
Записи dLGN реле нейронов могут быть легко выполнены при использовании ломтиков, которые примерно 2 мм медиаль с боковой поверхности мозга (начать сбор примерно 8из 250 мкм ломтиками во время резки процедуры). В некоторых ломтиках, не оба входных данных данного ретранслятора нейрона могут быть обнаружены, потому что один из двух путей отрезаны близко к реле нейрона. В этом случае, как правило, все еще можно исследовать ретиногенулат и кортикогенуляции синапсы в том же ломтике, выбрав различные реле нейронов для каждого ввода. Для записи ретиногенулат синапса опосредоченный ток, вентилируемые реле нейроны выбраны так как волокна оптического тракта к этим клеткам, скорее всего, сохраняются, чем в дорсически расположенных ретрансляторных нейронов. В отличие от этого, кортикогенулат входы, скорее всего, сохраняются на реле нейронов, которые расположены дорсально в dLGN.
Качество фрагментов определяет надежность данных. Основываясь на нашем опыте, следующие параметры необходимы для обеспечения хорошего качества среза. Охлаждение и оксигенация являются важными факторами во время процедуры вскрытия. Голова мыши должна храниться в холодном растворе сразу после обезглавливания мыши. При взятии мозга из черепа, он должен быть погружен в ледяной раствор каждые 3 до 4 с для того, чтобы уменьшить гибель клеток. Аналогичным образом, процедура нарезки должна быть выполнена при 4 градусах Цельсия. Кроме того, раствор вскрытия и записывающий раствор должны быть насыщены кислородом не менее 15 мин перед использованием для поддержания достаточной концентрации кислорода. Кроме того, блокирование натриевых каналов может эффективно снизить активность нейронов. Поэтому был использован раствор вскрытия, содержащий 37,5 ммоль холина.
Ретрансляционные нейроны отображают низкопороговые шипы, которые генерируются переходным током Ca2'29. Чтобы блокировать напряжение закрытых каналов Ca2,мы добавили D-600 (метоксиверапамил) к внутриклеточному раствору. D-600 не следует использовать, если целью исследования является исследование низкопороговых шипов в ретрансляционных нейронов. Точность записей зажима напряжения цельнояля клетки зависит от ошибок космического зажима. Эта техническая проблема более актуальна для входов, которые находятся далеко от записи электрода (таким образом, для дистальных синапсов)30,31. Чтобы свести к минимуму влияние ошибкикосмического зажима, мы использовали вместо внутриклеточного раствора на основеK- Каналы, которые являются Kи проницаемые (например, каналы утечки), как правило, Csи непроницаемой32. Таким образом, использование внутриклеточного раствора на основе Csиувеличивает импеданс клетки.
Стабильная запись зажима патча зависит от выбора здоровых клеток. Нейроны с круглой формой сомы, темного цвета или опухшей сомы следует избегать. Кроме того, ретрансляторы отличаются от локальных интернейронов их большим размером сомы и более сложными первичными дендритными беседками. Поэтому мы выбрали клетки, которые имеют больший размер сомы (больше 15 мкм в диаметре) и небиполярной морфологии. Пример клетки, показанной на рисунке 3B имеет симметричную дендритную архитектуру и, следовательно, может быть классифицирован как реле нейронов, напоминающих Y-нейронов, которые, например, найти в кошке LGN17.
Устойчивость к сериям должна быть как можно меньше и поддерживаться постоянно. Кроме того, поскольку входы с двух направлений сохраняются в одном срезе, важно избавиться от помех между двумя входами. Чтобы избежать активации кортикогенулатных волокон при записи ретиногенулатных синапсовых токов или наоборот, стимулирующий пипетка не должен быть помещен в dLGN и расстояние между стимулированием и записью пипетки должно быть так далеко, как Возможно. Кроме того, большое расстояние между стимулирующими и записывающими пипетками требует относительно нетронутой аксонной консервации. Таким образом, для вскрытия необходимо выбрать правильный угол резки. Как правило, только один или два ломтика с сохранением двух входов могут быть получены из каждого полушария.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансируется Германским исследовательским фондом (DFG) в рамках Центра совместных исследований (SFB) 1134 "Функциональные ансамбли" (J.v.E. и X.C.) и исследовательского гранта EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
- Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
- Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
- Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
- Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
- Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
- Chen, C., Regehr, W. G.
- Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
- Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
- Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
- Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. , (1997).
- Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
- Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
- Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
- von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
- Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
- Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
- Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
- Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
- Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
- Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
- Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
- Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
- Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
- Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
- Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
- Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
- White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
- Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).
