Summary
מוצג כאן פרוטוקול להפרדת אפידרמיס מדרמיס להערכת ייצור מתווך דלקתי. בעקבות דלקת, אפידרמיס כף רגל אחורית חולדה מופרדת מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב 4 °C (50 °F). האפידרמיס משמש לאחר מכן לניתוח mRNA על ידי RT-PCR והערכה של חלבונים על ידי כתם מערבי ואימונוהיסטוכימיה.
Abstract
טכניקות קלות לשימוש וזולות נדרשות כדי לקבוע את הייצור הספציפי לאתר של מתווכים דלקתיים ונוירוטרופינים במהלך פגיעה בעור, דלקת ו/או רגישות. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקול הפרדה אפידרמלי-עורי באמצעות תרמוליסין, חלבון הפעיל ב 4 °C (70 °F). כדי להמחיש הליך זה, חולדות ספראג דולי הן מרדים, וכפות אחוריות ימניות מוזרקות לקרגינן. שש ו-12 שעות לאחר ההזרקה, חולדות עם דלקת וחולדות תמימות מורדמות, וחתיכת כף רגל אחורית, עור גלאברוי ממוקם במדיום הנשר המעודכן של דולבקו. האפידרמיס מופרד לאחר מכן בקרום המרתף מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב- PBS עם סידן כלורי. לאחר מכן, הדרמיס מאובטח על ידי מלקחיים זעירים, והאפידרמיס מתגרה בעדינות. כתמים כחולים טולואידין של קטעי רקמות מראים כי האפידרמיס מופרדת בצורה נקייה מן הדרמיס בקרום המרתף. כל שכבות תאי הקרטינוציט נשארות שלמות, ורכסי הרטי האפידרמלי יחד עם חריצים מפפילות עוריות נצפים בבירור. איכותי בזמן אמת RT-PCR משמש כדי לקבוע גורם גדילה עצבי ורמות ביטוי interleukin-6. סופג מערבי ואימונוהיסטוכימיה מבוצעים סוף סוף כדי לזהות כמויות של גורם גדילה עצבי. דו"ח זה ממחיש כי עיכול תרמוליצין קר היא שיטה יעילה להפריד אפידרמיס מדרמיס להערכת mRNA ושינויים בחלבון במהלך דלקת.
Introduction
הערכה של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים מהעור יכולה להיות מוגבלת בשל ההטרוגניות של סוגי תאים שנמצאו בדמיס ואפידרמיס מודלקים1,2,3. מספר אנזימים, טכניקות כימיות, תרמיות או מכניות הכוללות הפרדה בין שתי השכבות או לביצוע דיסוציאציה של תאים להערכה נבדקו לאחרונה4. חומצה, אלקלי, מלח ניטרלי, וחום יכול להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס במהירות, אבל נפיחות תאית חוץ תאית מתרחשת לעתים קרובות5,6. טריפסין, לבלב, אלסטאז, קרטינאז, קולגנאז, פרונאז, דיספאז ותרמולצין הם אנזימים ששימשו להפרדה אפידרמלית-עורית4,7. טריפסין ואנזימים פרוטאוליטיים בקנה מידה רחב אחרים פעילים ב 37-40 °C (37 °F), אבל חייב להיות במעקב בקפידה כדי למנוע ניתוק של שכבות אפידרמיס. Dispase מבקע את האפידרמיס בדנסה לאמינה, אבל דורש 24 שעות להפרדה בקור4,8 או נקודות זמן קצרות יותר ב 37 °C4,9. תכונה מגבילה של כל הטכניקות האלה היא ההפרעה הפוטנציאלית של מורפולוגיה של רקמות ואובדן שלמות של mRNA וחלבון.
כדי לשמור על שלמות ה- mRNA והחלבון, יש לבצע שיטת הפרדת עור בקור לפרק זמן קצר. בהערכת טכניקות הפרדת העור למחקרי דלקת, thermolysin הוא אנזים יעיל להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בטמפרטורות קרות4. תרמוליסין פעיל ב 4 °C (55 °F), מבקע את המידזמום האפידרמלי מן למינה לוסידה, ומפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בתוך 1-3 שעות4,8,10. מטרת דו"ח זה היא לייעל את השימוש התרמוליסין להפרדת אפידרמיס חולדה מודלק מדרמיס כדי לזהות רמות mRNA וחלבון עבור מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים. מספר דו"חות ראשוניים הוצגו11,12,13,14,15. מטרת כתב יד זה היא לתאר טכניקה אופטימלית להפרדת העור באמצעות תרמוליסין ולהדגים את הזיהוי של 1) סמנים של דלקת, 2) אינטרלוקין-6 (IL-6) mRNA, ו -3) גורם גדילה עצבי (NGF) mRNA וחלבון באפידרמיס של חולדות עם דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)16,17. דו"ח ראשוני באמצעות מודל אדג'ובנט מלא של פרוינד מציין כי NGF mRNA ורמות חלבון להגדיל מוקדם במהלך דלקת15. בעכברים, רגישות העור עם היישום אקטואלי של oxazolone גורם לעלייה מוקדמת IL-6 mRNA באמצעות הכלאה במקום36. IL-6 ו-NGF היו מעורבים ב-C-II18,19, אך לא היו דיווחים המתארים את רמות ה-MRNA או החלבון עבור IL-6 או NGF במיוחד מהאפידרמיס בשלבים החריפים של C-II.
טכניקת התרמוליסין זולה ופשוטה לביצוע. יתר על כן, הפרדת התרמוליסין של האפידרמיס מדרמיס מאפשרת mRNA, כתם מערבי, וניתוח אימונוהיסטוכימי של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים במהלך תהליך של דלקת15. חוקרים צריכים להיות מסוגלים בקלות להשתמש בטכניקה זו הן במחקרים פרה קליניים והן במחקרים קליניים של דלקת בעור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (#2016-03).
1. דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)
- מרדים חולדות ספראג דולי (200-250 גרם; 8-9 שבועות) עם איזופלוראן (או הרדמה להזרקה).
- בדוק את עומק ההרדמה על ידי נגיעה בקרנית וצביטה קלה של כף רגלו האחורית השמאלית. כאשר החיה היא מרדים כראוי, לא תהיה תגובה קרנית או כף רגל תצפה.
- תת עורית להזריק את גלברו הימני, כף רגל אחורית עם 100 μL של 1% (w /v) λ-carrageenan מדולל תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)20.
- ודא כי פקדים מתאימים משמשים, כגון חולדות תמימות ללא איזופלוראן בדו"ח זה. מחקרים ראשוניים מצביעים על כך שלעכברושים נאיביים עם או בלי איזופלוראן יש את אותו ביטוי בזאלי של אפידרמיס IL-6 ו- NGF.
הערה: חולדות תמימות מועדפות לבקרה למחקרי דלקת מאז מלוחים תת עוריים או PBS לגרום דלקת מקומית23,37.
- ודא כי פקדים מתאימים משמשים, כגון חולדות תמימות ללא איזופלוראן בדו"ח זה. מחקרים ראשוניים מצביעים על כך שלעכברושים נאיביים עם או בלי איזופלוראן יש את אותו ביטוי בזאלי של אפידרמיס IL-6 ו- NGF.
- להעריך את המצקת של חולדות C-II כדי להבטיח את האפקטיביות של carrageenan (איור 1)20. לקבוע את כמות המכשך על ידי מדידת עובי metatarsal כף רגל אחורית עם calipers.
- ב 6-12 שעות, להרדים חולדות עם CO 2 (או מנת יתרהרדמה להזרקה) לחתוך 1 מ"מ x 2 מ"מ חתיכות של עור כף רגל אחורית גלאברו עם אזמל חד. אם נעשה שימוש בעור שעיר, ואז לגלח אותו לפני חיתוך 1 מ"מ x 2 מ"מ חתיכות של העור.
הערה: ודא כי נקודות הזמן המתאימות נבחרות על פי המחקרים הספציפיים. - באמצעות מלקחיים microdissection, להעביר את העור לתוך 1 מ"ל של מדיום נשר שונה של Dulbecco קר (DMEM) בצינור microcentrifuge על קרח ולשמור על קור במשך 15-60 דקות.
2. הפרדת תרמוליסין של אפידרמיס ודרמיס
- הכן והפעל תרמוליסין.
- הכן פתרון של תרמוליזין, על ידי הוספת 5 מ"ג של Geobacillus stearothermophilus ל 10 מ"ל של PBS, ב pH = 8 (ריכוז 500 מיקרוגרם / מ"ל).
- הכן פתרון 1 M של סידן כלורי (CaCl2 נטול מים) על ידי הוספת 1.11 גרם לתוך 10 מ"ל של H2O מזוקק.
- כדי למנוע אוטוליזה של תרמוליזין, להוסיף 10 μL של סידן כלורי ל 10 מ"ל של פתרון תרמוליזין. הריכוז הסופי של סידן כלוריד יהיה 1 מ"מ.
- Aliquot 1 מ"ל של תרמוליזין מופעל לתוך 10 בארות של צלחת תרבית תאים 24 היטב על קרח.
- השתמש עיכול אנזים תרמוליסין כדי להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס.
- באמצעות מלקחיים microdissection, להעביר דגימת עור אחת לתוך כל באר של תרמוליסין פעיל. הקפד לא לטבול את העור בתמיסת התרמוליסין.
- הקש בעדינות על העור בצד הבאר כדי לסייע בשחרור דגימת העור מהמלקחיים כדי לצוף על תמיסת התרמוליסין.
- לצוף את העור לתוך פתרון התרמוליסין עם קרנית השכבה (אפידרמיס חיצוני) צד למעלה דרמיס עם הפנים כלפי מטה. זה קריטי כי הדרמיס פונה כלפי מטה, או ההפרדה האפקטיבית לא תתרחש.
הערה: משך הזמן לדגירה תרמוליסין חייב להיקבע אמפירית על ידי משתמש הקצה. עור גלברו, כף רגל אחורית מחולדות ספראג דולי (200-250 גרם; 8-9 שבועות) דורש לעתים קרובות 2.0-2.5 שעות להפרדה. זמן הדגירה צפוי להשתנות עם מינים וגיל. - לאחר זמן הדגירה המתאים התרמוליסין, השתמש במלקחיים מיקרו-חיתוניים כדי להעביר דגימת עור אחת לבאר של צלחת תרבית תאים 6 היטב עם 7-8 מ"ל של DMEM קר (4 °C). זה מאפשר יותר מקום להפרדת האפידרמיס מהדרמיס.
- לטבול את העור לתוך DMEM.
- מברישים בעדינות את האפידרמיס עם המלקחיים סביב היקף העור עד שנצפית האפידרמיס הכמעט שקוף בגבולות. אם זה לא ניתן להשיג, להחזיר את דגימת העור לפתרון thermolysin עוד 15-30 דקות.
- ברגע שהאפידרמיס נפרד באופן ניכר מהדרמיס, אז החזק בזהירות גם את האפידרמיס וגם את הדרמיס עם מלקחיים זעירים ולאט לאט למשוך את האפידרמיס מהדרמיס.
- להעריך את התחלות של האפידרמיס המבודד ולוודא שזה עקבי אופטית. ראו איור 2 לדוגמה של דגימה של 1 מ"מ x 2 מ"מ של אפידרמיס עכברושים. אם יש שונות בתחלוץ, אז ההפרדה הנכונה לא התרחשה.
- לאימת תרמוליסין באמצעות חומצה אתילנדימינטטראקטית (EDTA) בחתיכות המופרדות של אפידרמיס ודרמיס.
זהירות: התרמוליסין שנותר באפידרמיס ובדרמיס עדיין פעיל ועלולים לפגוע בשכבות אם לא מומתים.- הכן פתרון מניית EDTA 0.5 M. כדי לעשות זאת, לאט להוסיף 0.93 גרם EDTA לתוך 5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. מוסיפים נתרן הידרוקסיד לתמיסה עד שהוא מנקה. ודא כי ה- pH של הפתרון הוא ~ 8.0.
- הפוך פתרון EDTA 5 mM ב- DMEM. הוסף 0.25 מ"ל של פתרון מניית EDTA 0.5 M ל- 25 מ"ל של DMEM.
- מניחים את האפידרמיס והדרמיס המופרדים לפתרון EDTA/DMEM של 5 מ"מ ב-4 °C (30 דקות) כדי להשבית את הפעילות של התרמו-ליסין.
- להעריך את האפידרמיס עם היסתולוגיה טינקטולית8,9,10.
- תקן חלק של האפידרמיס בפורמלין נייטרלי 10%, 4% paraformaldehyde, או 0.25% paraformaldehyde עם 0.8% פתרון חומצה פיפרית עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר (RT) עם עצבנות.
- מניחים את האפידרמיס הקבוע ב 10% סוכרוז ב PBS במשך 1 שעות ב RT עם תסיסה.
- להקפיא את האפידרמיס במטריצה הטמעת רקמות לחתך. חותכים חתך 14 מיקרומטר חתך באמצעות קריוסטט ולהפשיר-הרכבה קטעים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה ג'לטין.
- חלקים יבשים על מחמם וכתם שקופיות עם פתרון עובד של כחול טולואידין (TB; 10% TB ב 1% נתרן כלורי) עבור 90 s. Appose מכסה את ההפלות עם מדיום הרכבה מימי.
- שימו לב לאפידרמיס עם מיקרוסקופיית ברייטפילד ב-50x-250x.
הערה: אם התרחשה הפרדה נכונה, האפידרמיס יחולק בצורה נקייה מהדרמיס וחמש השכבות יזוהו: בזל רובדים, ספינוסום רובדים, גרנולוזום שכבה, רובד מחזיר אור, ושכבת קרנית. דוגמה לאפידרמיס של עור חולדה מופרד ניתן לראות באיור 3.
3. מיצוי חלבונים וניתוח כתם מערבי
- בצע כתמים מערביים על דגימות רקמה מופרדת באמצעות פרוטוקול שפורסם בעבר21.
- הומוגניזציה האפידרמיס ב 50 μL של מאגר תמוגה (25mM טריס HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% גלילצל, ו 1% טריטון X-100) המכיל פוספטאז וקוקטייל מעכב פרוטאז.
- דגימות צנטריפוגות במהירות מקסימלית למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולהעריך את הסופר-נט לריכוז חלבונים באמצעות ערכת בדיקת חלבונים.
- לטעון ריכוזים שווים של חלבון (30 מיקרוגרם) על ג'ל SDS, לבצע אלקטרופורזה, ולאחר מכן להעביר חלבונים חנקן או PVDF ממברנות.
- חסום ממברנות עם 5% חלב ל-2 שעות ודגרה בין לילה בנוגדן העיקרי (עכבר נגד NGF, E12, 1:1000).
- לשטוף 3x עם PBS עם 0.3% tween במשך 10 דקות כל אחד ודגורה עם נוגדן משני שכותרתו (למשל, אלקליין פוספטאז שכותרתו ארנב נגד עכבר IgG).
- השתמש במערכת סריקה כדי להעריך אות כתם מערבי (למשל, מצע ECF ופלטפורמת הדמיה).
4. אימונוהיסטוכימיה
- מקם דגימות רקמה בתיקון עבור חיסוניות אופטימלית: 0.96% (w /v) חומצה פיצרית ו 0.2% (w/v) פורמלדהיד ב 0.1 M נתרן פוספט חוצץ, pH = 7.321,22,23 עבור 4 שעות ב RT. להעביר ל 10% סוכרוז ב PBS לילה ב 4 °C .
- בצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית על קטעי הרקמה21,22,23.
- הטמעת האפידרמיס מבעלי חיים לתוך בלוק קפוא אחד במטריצה הטמעה לחתוך 10-30 מקטעים מיקרומטר על cryostat. הר את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה ג'לטין ויבש ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות.
- לשטוף מקטעים במשך שלוש, 10 דקות שטיפות PBS ודגרה עבור 24-96 שעות באנטיזרים ראשוני, [למשל, עכבר נגד NGF (E12, 1:2000)] ומוצר גנים נגד חלבונים ארנב 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) מדולל ב- PBS המכיל 0.3% (w/v) טריטון X-100 (PBS-T) PBS-T עם 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA) ו-0.5% פוליווינילפירולידון (PVP).
- לאחר הדגירה העיקרית נגד קדם, יש לשטוף סעיפים שלוש פעמים במשך 10 דקות ב-PBS ולדגירה 1 שעות ב-RT באלכסה פלור 488 חמור נגד ארנב IgG (1:1000) ואלכסה פלור 555 חמור נגד עכבר IgG (1:1000) מדולל PBS-T.
- יש לשטוף חלקים שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות ולהדביק כיסויים עם מדיום הרכבה לא דועך כדי לפגום בדעיכת אימונופלואורסצנטיות.
5. בידוד RNA וסינתזה cDNA
- בצע תגובת שרשרת פולימראז פולימראז הפוך סטנדרטית (RT-PCR) על דגימות העור21. לבודד RNA הכולל באמצעות פנול, פתרון איזוטיוצינאט guanidine.
- בצע סינתזת DNA משלימה על ידי Moloney מורין לוקמיה וירוס הפוך transcriptase.
- השתמש ברצפי הפריימר הבאים להגברת NGF ו- IL-6:
NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (אנטיסנס) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
IL-6 (אנטיסנס) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGAGAGAG - השווה את הרמות של NGF ו- IL-6 mRNA לגן משק הבית β-אקטין:
β-ACTIN (Sense) - TGCGTGACATTAAAGAAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTIN (אנטיסנס) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - להעריך עם איכות RT-PCR באמצעות רוכב אופניים תרמי וכמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) באמצעות מערכת qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקת קרגינן לתוך כף רגלו האחורית של העכברוש גרמה לתסמינים קלאסיים של דלקת כגון אדמומיות ובצקת16,17. הנפיחות של כף רגל האחורית נמדדה עם calipers מכני20. ערך בסיסי של עובי כף רגל הושג עבור כל חולדה לפני טיפול carrageenan ונמדד שוב ב 6 שעות ו 12 שעות. עובי כף רגלו הוגדל משמעותית בהשוואה לערכי הבסיס (איור 1).
דגירה תרמוליצין של עור כף רגל אחורית גלברוס חולדה יצרה גיליון של אפידרמיס. מיקרוסקופיית ברייטפילד שימשה להערכת האפקטיביות של הפרדת התרמולצין של האפידרמיס והדרמיס(איור 2). ניתן היה לקבוע את שכבות האפידרמיס תוך התמקדות בסדין בהגדלה גבוהה יותר. כתמים כחולים טולואידין של חתך אפידרמיס הראו כי האפידרמיס הופרד מהדרמיס בקרום המרתף(איור 3). רכסי הרט האפידרמליים (יתדות אפידרמיס) יחד עם החריצים מפפילות עוריות לא נפגעו. כל שכבות תאי הקרטינוציט נצפו.
סופג מערבי של אפידרמיס מופרד תרמוליסין הניב תוצאות עקביות המצביעות על רמות חלבון יציבות במהלך הטכניקה ב 4 °C (50 °F). מעט מאוד חלבון NGF זוהה באפידרמיס עכברוש נאיבי, אבל רמות חלבון NGF היו למעלה (250%) לאחר 6 שעות של C-II בהשוואה לבעלי חיים נאיביים(איור 4). לאחר 12 שעות של C-II, רמות NGF הופחתו לעומת 6 שעות אך נותרו גבוהות (55%) ביחס לבקרות. אימונוהיסטוכימיה עבור NGF באפידרמיס המופרד סיפקה חיסון אמין ואישרה את התוצאות של כתמים מערביים(איור 5). NGF-חיסוניות (ir) לא זוהתה באפידרמיס שליטה נאיבית, אבל ב 6 h C-II, היה NGF-ir ברוב הקרטינוציטים של גרנולוזום רובד ושכבות מחזירת אור. כמה תאים עבור ספינוסום השכבה היו NGF-אימונוריים (IR) ב 6 h C-II. בשעה 12 h C-II, NGF-ir התרחשה קרטינוציטים של גרנולוזום רובד ושכבות מחזירת אור עם כמה תאים בגרנולוזום רובד אינטנסיבי NGF-IR. בשום נקודת זמן לא זוהתה NGF-ir במכת עכבה או בקרנית. PGP9.5-IR תוך אפידרמלי, סיבי עצב דליות היו נוכחים באפידרמיס המופרד מחולדות נאיביות ו- C-II(איור 5).
RT-PCR איכותי הוכיח שיש mRNA באיכות טובה מאפידרמיס המופרד תרמוליסין(איור 6A, איור 7A). ביטוי ה-NGF mRNA באפידרמיס במהלך C-II הועלה משמעותית (פי >3) ב-6 שעות בהשוואה לחולדות תמימות(איור 6B). בשעה 12 שעות, NGF mRNA חזר לרמות הבסיס(איור 6B). השימוש actin כגן משק בית עבור PCR כמותי בזמן אמת, IL-6 mRNA באפידרמיס במהלך C-II היה גבוה באופן משמעותי (>6-פי 6) ב 6 שעות לעומת חולדות נאיביות(איור 7B). בשעה 12 שעות, רמות IL-6 mRNA ירדו באופן משמעותי מכמויות 6 שעות אבל נשאר גבוה (פי 2) לעומת חולדות נאיביות(איור 7B).
איור 1: הזרקת קרגינן מייצרת מבשרת כף רגל.
ערך בסיסי הושג עבור כל חולדה לפני טיפול carrageenan. לאחר 6 שעות ו 12 שעות של טיפול, עובי כף רגל גדל באופן משמעותי לעומת ערכים בסיסיים. התוצאות באות לידי ביטוי כ- SEM עם שש חולדות לטיפול (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; מבחן t של התלמיד, לא משוער, דו-זנב, בוצע בכל נקודת זמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התרמוליסין מייצר גיליון אפידרמיס.
מיקרוסקופיית ברייטפילד חשפה יריעת אפידרמיס שקופה בגודל של כ-1 מ"מ על 2 מ"מ. ניתן היה לקבוע את שכבות האפידרמיס תוך התמקדות בסדין בהגדלה גבוהה יותר. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כתמים כחולים טולואידין של האפידרמיס.
מיקרוסקופיית ברייטפילד קבעה כי התרמוליסין גרם להפרדה יעילה של האפידרמיס מדרמיס. רכסי רט אפידרמליים (יתדות אפידרמיס; ראשי חץ) נצפו יחד עם חריצים של פפילה עורית (חצים). כל שכבות תאי הקרטינוציט היו שלמות. SB: מצרף רובדים, אס.אס: ספינוסום רובדים, ס"ג: גרנולוזום רובדים, SL: רובד מחזירת אור, SC: קרנית רובדים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי חלבון NGF באפידרמיס במהלך דלקת הנגרמת על ידי קרגינן.
רמות ה-NGF עלו (250%) לאחר 6 שעות של דלקת בהשוואה לבעלי חיים תמימים. לאחר 12 שעות, הרמות הופחתו לעומת 6 שעות אך היו גבוהות (55%) בניגוד לבעלי חיים נאיביים. התוצאות באות לידי ביטוי כ- SEM עם שלוש חולדות לכל קבוצה (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; מבחן t של התלמיד, לא משוחזר, דו-זנב בוצע בכל נקודת זמן) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: NGF ו-PGP9.5 חיסוניות (ir) במהלך C-II.
עמודות A, B, C מציגות NGF-ir, PGP9.5-ir, וכתמים גרעיניים DAPI, ואילו עמודות A1-C1 להראות רק NGF-ir. בכל התמונות, קרנית השכבה היא לכיוון שמאל ומעוז רובד לכיוון ימין. NGF-ir לא זוהה באפידרמיס שליטה נאיבית (א,א'). ב 6 h C-II (B,B1), NGF-ir היה נוכח ברוב קרטינוציטים של גרנולוזום השכבה (חצים קצרים) ושכבות מחזירת אור (חצים ארוכים). כמה תאים עבור ספינוסאום השכבה היו NGF-ir ב 6 h C-II (ראשי חץ גדולים). בשעה 12 h C-II (C,C1), NGF-ir התרחשה בקרטינוציטים של גרנולוזום רובד ושכבות מחזירת אור (חצים ארוכים) עם כמה תאים בגרנולוזום רובדים בעוצמה NGF-ir (חצים קצרים). בשום נקודת זמן לא זוהתה NGF-ir במכת עכבה או בקרנית. סיבי עצב תוך-אפידרמליים PGP9.5-ir היו נוכחים באפידרמיס המופרד מחולדות נאיביות ו- C-II (ראשי חץ קטנים, A-C). SB: מצרף רובדים, אס.אס: ספינוסום רובדים, ס"ג: גרנולוזום רובדים, SL: רובד מחזירת אור. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: NGF mRNA במהלך דלקת הנגרמת על ידי קרגינן.
ביטוי mRNA NGF באפידרמיס המופרד תרמוליסין במהלך C-II הוערך על ידי PCR איכותי (A) ו- PCR כמותי בזמן אמת (B). כתמי mRNA איכותיים (A) עבור NGF ו actin הוכיח כי יש mRNA באיכות טובה שניתן להעריך במהלך דלקת. ביטוי mRNA NGF באפידרמיס במהלך C-II הוערך על ידי PCR כמותי בזמן אמת באמצעות actin כגן משק בית (B). NGF mRNA היה גבוה באופן משמעותי (פי >3) לאחר 6 שעות של C-II בהשוואה לחולדות תמימות שלא טופלו, אך הרמות חזרו לקו הבסיס ב 12 שעות (B). התוצאות באות לידי ביטוי כ- SEM עם שלוש חולדות לכל קבוצה (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; מבחן t של התלמיד, לא משוער, שני זנבות בוצע בכל נקודת זמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: IL-6 mRNA במהלך דלקת הנגרמת על ידי קרגינן.
ביטוי IL-6 mRNA באפידרמיס המופרד תרמוליסין במהלך C-II הוערך על ידי PCR איכותי (A) ו- PCR כמותי בזמן אמת (B). כתמי mRNA איכותיים (A) עבור IL-6 ואקטין הראו שיש mRNA באיכות טובה להערכה במהלך דלקת. ביטוי IL-6 mRNA באפידרמיס במהלך C-II הוערך על ידי PCR כמותי בזמן אמת באמצעות actin כגן משק בית (B). IL-6 mRNA היה גבוה באופן משמעותי (>6-פי 6) לאחר 6 שעות של C-II לעומת חולדות תמימות לא מטופלות (B). בשעה 12 שעות, רמות IL-6 mRNA הופחתו באופן משמעותי מרמות של 6 שעות אך נותרו גבוהות (פי 2) בהשוואה לחולדות נאיביות (B). התוצאות באות לידי ביטוי כ- S.E.M הממוצע עם שתי חולדות לכל קבוצה (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, מבחן t של התלמיד, לא משוער, שני זנבות בוצעו בכל נקודת זמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר קבע כי האפידרמיס של עור גלברוס כף רגל אחורית חולדה הופרד בקלות דרמיס באמצעות thermolysin (0.5 mG / mL) ב PBS עם 1 mM סידן כלורי ב 4 °C (2.5 שעות). הערכה היסתולוגית הצביעה על כך שהאפידרמיס הופרד מהדרמיס בקרום המרתף וכי רכסי הרט האפידרמליים היו שלמים. תרמוליסין הוא מטאלונדופפטידאאז חוץ-תאי המיוצר על ידי תרמו-פרוטווליקוס גראם-חיובי(Geo)בצילוס תרמופרוטיליקוס24. פעילותו יציבה ב 4 °C (55 °F), אך היא פונקציונלית על פני מגוון רחב של טמפרטורות10,24,25. אנזים זה שימש בהרחבה לכימיה של חלבונים24,25, אך מספר קבוצות הראו את היישום שלו להפרדת העור לתוך גיליונות אפידרמליים ו / אועוריים 4,8,10,26,27. Walzer ואח ' היו הראשונים לדווח על הפרדה אפידרמלית-עורית של עור אנושי באמצעות תרמוליזין ב 4 °C (250-500 מיקרוגרם / מ"ל עבור 1 שעות)10. עם מיקרוסקופיה אור ואלקטרון, ההפרדה נקבעה להתרחש בקרום המרתף האפידרמלי בין למינין ואתר אנטיגן פמפיגואיד bullous10.
יתר על כן, hemidesmosomes, ההחזקות של keratinocytes בזאלי לקרום המרתף, שובשו באופן סלקטיבי10,29. Rakhorst ואח ' השווה תרמוליזין (4 °C (4 °C (500 מיקרוגרם / מ"ל, לילה) כדי dispase להפרדה אפידרמלית-עורית של רירית ארנב buccal8. תרמוליזין לא היה שלם בהפרדת האפידרמיס הרירי מדרמיס המציין כי הבדלים עשויים להתרחש עבור מינים, זמן דגירה, הרכב פתרון (אין CaCl2 למניעת אוטוליזה תרמוליזה24),מקור התרמוליזין, ו / או הבדלים ספציפיים לאתר המצוינים ממחקרים אחרים10,26,27. משתמשי הקצה של הפרוטוקול הנוכחי צריכים להקפיד להשתמש תרמוליסין טרי תמיד לכלול סידן כלורי אבל גם צריך להיות מודע למגבלות פוטנציאליות אלה.
למרות כמה חוקרים השתמשו thermolysin ב 37 °C26,29, משתמשים בפרוטוקול זה צריך להיות מודע כדי לשמור על רקמת העור ב 4 °C (55 °F) כדי לשמר את היציבות של חלבון ו mRNA. השתמשנו DMEM ב 4 °C כפתרון לעור לפני ואחרי הפרדת תרמוליסין בגלל התועלת שלה בשמירה על תאים בתרבית28, והוא שימש בעבר להפרדת העור עם תרמוליסין8,26,27,30,31. עם זאת, Walzer ואח ' בשימוש PBS סטרילי בתוספת 200 μG / mL סטרפטומיצין, 200 U / mL פניצילין, ו 2.5 מיקרוגרם / mL fungizone10, בעוד שאחרים השתמשו במדיה שונה (למשל, מדיה תרבות keratinocyte ללא גורם גדילה אפידרמלי) ואחריו PBS שטיפה29.
בפרוטוקול, הפרדת התרמוליסין בוצעה בתרמוליסין של 500 מיקרוגרם/מ"ל ו-5 מ"מ סידן כלורי ב-PBS (pH = 8), בדומה לשיטה המקורית10. DMEM שימש כפתרון להפרדת תרמוליזין ב 4 °C (לילה)8, ואת חיץ HEPES שימש ביעילות עם פתרון תרמוליזין 500 μG / mL ב 37 °C (2 שעות29). עם זאת, לא חקרנו כיצד מאגרים בינוניים או אחרים משפיעים על פעילות התרמוליסין להפרדה אפידרמלית-עורית. סידן כלוריד הוא תוספת חשובה כדי להקטין את האוטוליזה של תרמוליזין24,32 ומחיקת שלב זה עלולה להוביל למחשוף לא שלם של האפידרמיס מדרמיס8.
נראה שגודל דגימת העור משפיע על הזמן הדרוש לדגירה תרמוליצינית ועל האפקטיביות של מחשוף אנזימטי של האפידרמיס מדרמיס. החוקרים צריכים להעריך את גודל המדגם המתאים וזמן הדגירה עבור הרקמות שלהם. הצפת הדגימות על פתרון התרמוליסין עם האפידרמיס הפונה כלפי מעלה חשובה ליעילות אופטימלית שלאנזימים 10. כפי שצוין קודם לכן, אתר הפעולה של thermolysin הוא ב hemidesmosomes keratinocyte וקרוםהמרתף 4,10,29; לכן, תרמוליסין עובד פנימה משולי העור. מניסיוננו, קצות העור נפרדים מוקדם יותר מאמצע המדגם, וחשוב לאפשר מספיק זמן למחשוף אנזימטי מלא. כאשר המחשוף הושלם, האפידרמיס צריך להתרחק בקלות מן הדרמיס. אם עדיין מחובר, משיכה על השכבות עלולה לגרום חלקים של דרמיס לבוא משם עם האפידרמיס.
מגבלה של טכניקת התרמוליסין היא הזמן הנדרש. הגדלת ריכוז התרמוליזין מעבר ל-500 מיקרוגרם/מ"ל אינה מקטינה את זמן ההפרדה ויש שימור לקוי של האפידרמיס בריכוזים גבוהים יותר10. שיטות הפרדה אפידרמלית-עורית נבדקו לאחרונה4, ושיטות רבות לקחת 30-60 דקות ב 20-40 °C (50 °F). חום (50-60 °C) הפרדת העור מתרחשת במהירות (30 s עד 10 דקות)4, אבל חלבונים ו mRNA ידועים להשפיל במהירות בטמפרטורות גבוהות כאלה. לחלופין, נתרן thiocyanate (2 N) ב RT עשוי להיות טכניקת הפרדה מהירה מקובלת (5 דקות)4,6, אבל חלבון ושלמות mRNA לא נחקרו בשיטה זו6. שיטת התרמו-ליסין הקרה נבחרה לשימור חלבונים ו-mRNA, אך לא בוצעו השוואות ישירות בין שלמות החלבון ל-mRNA בטכניקות אחרות.
במחקר הנוכחי, עיכול תרמוליצין קר הוכח להיות שיטה יעילה להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס להערכה של mRNA ושינויים חלבון במהלך דלקת. במהלך דלקת הנגרמת על ידי carrageenan, רמות mRNA וחלבון NGF ורמות IL-6 mRNA היו גבוהות ב 6 שעות, חוזר קרוב לבסיס על ידי 12 שעות. עם אימונוהיסטוכימיה, NGF חיסוניות הוגדלה קרטינוציטים ב 6 שעות ו 12 שעות. יתרון של שיטת התרמוליסין הוא היכולת לבצע ניתוח סלקטיבי באתר. לדוגמה, הייצור המוגבר של NGF ו- IL-6 במחקר הנוכחי הוא מקרטינוציטים, שכן תאים עוריים אינם נכללים מההצקות. שיטה זו מאפשרת תובנה לגבי סוגי המיקום והמתווכים לתחושה של מסופים אמינים ראשיים33. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הבנה טובה יותר של מהלך הזמן של ייצור נוירוטרופין יחד עם ספיגה והובלה afferents העיקרי במהלך דלקת34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים.
Acknowledgments
מימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
