Summary
ここで提示される、表皮を真皮から分離し、炎症性メディター産生を評価するためのプロトコルである。炎症に続いて、ラット後足表皮は、4°Cでサーモリシンによって真皮から分離される。 次に、表皮を、ウエスタンブロットおよび免疫染色法によるRT-PCRおよびタンパク質評価によるmRNA解析に使用する。
Abstract
皮膚損傷、炎症、および/または感作中の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するには、使いやすく安価な技術が必要です。本研究の目的は、4°Cで活性であるプロテイナーゼであるサーモリシンを用いた表皮皮膚分離プロトコルを記述することにある。 この手順を説明するために、スプレイグ・ドーリーラットは麻酔を受け、右後足にはカラギーナンを注射する。注射の6時間と12時間後、炎症とナイーブラットを持つラットは安楽死させられ、後足の一部、グラブルーの皮膚は冷たいダルベッコの修正されたイーグル培地に入れられる。表皮は、次いで、塩化カルシウムを用いてPBSでサーリシンによって真皮から基膜で分離される。次に、真皮はマイクロ解剖鉗子によって固定され、表皮は穏やかにからかわれ、組織切片のトルイジンブルー染色は、表皮が地下膜の真皮からきれいに分離されていることを示す。すべてのケラチノサイト細胞層はそのまま残っており、表皮レテの隆起は、真皮乳頭からのくぼみと共に明らかに観察される。定性的およびリアルタイムRT-PCRは、神経成長因子およびインターロイキン-6発現レベルを決定するために使用されます。最終的に、ウエスタンブロッティングと免疫染色法が行われ、神経成長因子の量を検出します。この報告は、炎症時のmRNAおよびタンパク質変化の評価のために、冷熱酵素消化が真皮から表皮を分離する有効な方法であることを示している。
Introduction
皮膚からの炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の評価は、炎症を起こした真皮および表皮1、2、3に見られる細胞タイプの不均一性に起因して制限され得る。いくつかの酵素、化学的、熱的、または評価のために細胞解離を行うための2つの層の分離を伴う機械的技術が最近4に見直されている。酸、アルカリ、中性塩、熱は表皮を真皮から素早く分けることができるが、細胞外腫脹は5,6で起こることが多い。トリプシン、膵臓、エラスターゼ、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、およびサーリシンは、表皮皮膚分離4、7に使用されてきた酵素である。トリプシンやその他の広いスケールのタンパク質分解酵素は37~40°Cで活性ですが、表皮層の解離を防ぐために注意深くモニタリングする必要があります。ディスパーゼは、薄層デンサで表皮を切断するが、37°C4、9で冷たい4、8または短いタイムポイントで分離するために24時間を必要とする。これらすべての技術の制限的な特徴は、組織形態の潜在的な破壊およびmRNAおよびタンパク質の完全性の喪失である。
mRNAとタンパク質の完全性を維持するために、皮膚分離方法は、短時間の間、寒さの中で行われるべきである。炎症研究のための皮膚分離技術を評価する際に、サーリシンは、寒い温度4で真皮から表皮を分離するのに有効な酵素である。サーモリシンは、4°Cで活性であり、表皮ヘミデスモソームを層のルシダから切断し、表皮を1-3 h4、8、10以内の真皮から分離する。このレポートの目的は、炎症を起こしたラット表皮を真皮から分離して、炎症性メディエーターおよび神経栄養因子のmRNAおよびタンパク質レベルを検出するためのサーモリシンの使用を最適化することです。いくつかの予備的なレポートが提示されています11,12,13,14,15.本稿の目的は、サーモリシンを用いた最適な皮膚分離技術を記述し、1)炎症の1)マーカーの検出を実証することである、2)インターロイキン-6(IL-6)mRNA、および3)神経成長因子(NGF)mRNAおよびカラギーゲン誘導性炎症を有するラットの表皮中のタンパク質(C-II)16,17。完全なフロイントアジュバントモデルを用いた予備報告は、NGF mRNAおよびタンパク質レベルが炎症の間に早期に増加することを示す15。マウスにおいて、オキサゾロンの局所適用による皮膚感作は、その後ハイブリダイゼーション36に使用するIL-6 mRNAの早期上昇を引き起こす。IL-6とNGFはいずれもC-II18,19に関与しているが、C-IIの急性期の表皮から特異的に表皮からmRNAまたはタンパク質レベルを記述する報告はない。
サーモリシン技術は安価で、実行が簡単です。さらに、真皮からの表皮のサーモリシン分離は、炎症の過程におけるmRNA、ウェスタンブロット、および炎症の過程における炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の免疫組織化学的分析を可能にする15。研究者は、皮膚の炎症の前臨床および臨床研究の両方でこの技術を簡単に使用できるはずです.
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Protocol
このプロトコルは、オクラホマ州立大学保健科学センターIACUC(#2016-03)の動物ケアガイドラインに従います。
1. カラギーナンによる炎症(C-II)
- イゾフルラン(または注射麻酔薬)で男性および/または雌のスプレイグ・ドーレーラット(200〜250 g;8〜9週齢)を麻酔する。
- 角膜に触れ、左後足を軽くつまんで麻酔の深さを確認します。動物が適切に麻酔を受けると、角膜や足の応答は認められない。
- 皮下に右グラブロスを注入し、100μLの100μLの後足(w/v)λ-カラギーナンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20に希釈した。
- このレポートでは、イオブルランを含まないナイーブラットなど、適切なコントロールが使用されていることを確認してください。予備的研究は、イオブルランの有無にかかわらずナイーブラットが表皮IL-6およびNGFの同じ基底発現を有することを示す。
注:ナイーブラットは、皮下生理食音またはPBSが局所炎症23、37を引き起こすので、炎症研究のための好ましいコントロールである。
- このレポートでは、イオブルランを含まないナイーブラットなど、適切なコントロールが使用されていることを確認してください。予備的研究は、イオブルランの有無にかかわらずナイーブラットが表皮IL-6およびNGFの同じ基底発現を有することを示す。
- C-IIラットの浮腫を評価してカラギーナンの有効性を保証する(図1)20.後足の中足骨の厚さをキャリパーで測定して浮腫の量を決定します。
- 6-12時間で、CO2( または注射麻酔の過剰摂取)でラットを安楽死させ、鋭いメスでグラブラス後足の皮膚の1ミリメートルx 2mm部分を切断します。毛むくじゃらの皮膚を使用する場合は、1mm x 2mmの皮膚部分を切断する前に剃ります。
注: 特定のスタディに従って適切なタイムポイントが選択されていることを確認します。 - マイクロディセクショニング鉗子を使用して、氷の上のマイクロ遠心分離管内の冷たいダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)の1mLに皮膚を移し、15〜60分間冷たく保ちます。
表皮と真皮のサーモリシン分離
- サーモリシンを準備し、活性化します。
- 10 mLの PBSに5mgのジオバチルス・ステアサーモフィルス を加えて、pH= 8(濃度500μg/mL)で、サーモリシンの溶液を調製する。
- 1.11gを蒸留したH2Oの10mLに加えて、塩化カルシウム(CaCl2無水)の1M溶液を調製する。
- サーモリシンの自己溶解を防ぐには、10 mLのサーリシン溶液に塩化カルシウム10μLを加えます。塩化カルシウムの最終濃度は1mMとなります。
- アリコート1mLの活性化サーモリシンを氷上の24ウェル細胞培養プレートの10個のウェルに入す。
- サーモリシン酵素消化を使用して、表皮を真皮から分離します。
- マイクロディスセクション鉗子を使用して、活性化されたサーモリシンの各ウェルに1つの皮膚サンプルを移す。サーモリジン溶液に皮膚を浸さないようにしてください。
- ウェルの側面の皮膚を軽くタップして、鉗子から皮膚サンプルを放出し、サーリシン溶液に浮かべるのを助けます。
- 角 層 (外表皮)側を上にして真皮を下に向けてサーモリシン溶液に皮膚を浮かべます。真皮が下に向かうか、効果的な分離が起されないことが重要です。
注: サーモリジンインキュベーションの時間は、エンドユーザーが経験的に決定する必要があります。グラブロウス、後足の皮膚は、スプレイグ・ドーレーラット(200〜250 g;8-9週齢)で、分離のために2.0~2.5時間を要する。インキュベーション時間は種や年齢によって異なると予想されます。 - サーモリシンで適切なインキュベーション時間を過ごした後、マイクロディスセクション鉗子を使用して、1つの皮膚サンプルを7〜8 mLの冷たい(4°C)DMEMを備えた6ウェル細胞培養プレートのウェルに移します。これにより、真皮から表皮を分離する余地が増えます。
- 皮膚をDMEMに浸します。
- 半透明の表皮が境界で観察されるまで、皮膚の周囲の鉗子で表皮をそっと磨きます。これが達成できない場合は、皮膚サンプルをサーリシン溶液に戻して、さらに15〜30分間戻してください。
- 表皮が真皮から顕著に分離したら、その後、慎重にマイクロ解剖鉗子で表皮と真皮の両方を保持し、非常にゆっくりと真皮から表皮を引っ張る。
- 分離した表皮の透過性を評価し、光学的に一貫性があることを確認します。ラット表皮の1mm x 2mmサンプルの例については 、図2 を参照してください。半透明性にばらつきがある場合、適切な分離は起こっていない。
- 表皮と真皮の分離片にエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を用いた熱分解を不活性化する。
注意:表皮や真皮に残るサーモリジンは依然として活性であり、不活性化しないと層に損傷を与える可能性があります。- 0.5 M EDTA ストックソリューションを準備します。これを行うには、ゆっくりと2蒸留水の5 mLに0.93 g EDTAを追加します。水酸化ナトリウムを溶液に加え、クリアします。ソリューションの pH が約 8.0 であることを確認します。
- DMEMで5 mM EDTA溶液を作ります。0.5 M EDTA ストックソリューションの 0.25 mL を 25 mL の DMEM に追加します。
- 分離した表皮と真皮を5 mM EDTA/DMEM溶液に4°Cで30分間置き、サーモリジンの活性を失活させます。
- 表皮を、ティンストリンジロジー8,9,10で評価する。
- 表皮の一部を10%中性ホルマリン、4%パラホルムアルデヒド、または0.25%パラホルムアルデヒドで1.8%のピコン酸溶液を室温(RT)で攪拌して固定します。
- 固定表皮を10%スクロースにPBSで1時間攪拌してRTに入れる。
- 断面化のための組織埋め込みマトリックス内の表皮を凍結します。14 μmの断面を、ゼラチンコーティングガラス顕微鏡スライド上にクライオスタットと解凍マウントセクションを使用して切ります。
- スライドウォーマー上の乾燥した切片と90 sのためのトルイジンブルー(TB;1%塩化ナトリウムで10%TB)の働く溶液と染色。水性取り付け媒体を使用したカバーリップをアポス。
- 50x-250xで明視野顕微鏡で表皮を観察します。
注:適切な分離が発生した場合、表皮は真皮からきれいに分割され、5つの層が検出されます: 層バサレ、 尖層、 顆粒層、 角層、角 質 層。分離されたラット皮膚表皮の例は 図3に見ることができる。
3. タンパク質抽出とウェスタンブロット分析
- 以前に公開されたプロトコル21を使用して分離された組織サンプルに対してウェスタンブロッティングを行う。
- ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50μLのリシスバッファー(25mMトリスHCl、pH=7.4、150mM NaCl、1 mM EDTA、5%グリセロール、および1%トリトンX-100)で表皮を均質化します。
- 4°Cで15分間の最高速度で遠心分離機サンプルを、タンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度の上清を評価します。
- タンパク質の濃度(30μg)をSDSゲルに負荷し、電気泳動を行い、タンパク質をニトロセルロースまたはPVDF膜に移します。
- 2時間の5%乳を有するブロック膜と一次抗体で一晩インキュベート(マウス抗NGF、E12、1:1000)。
- 3xをPBSで10分間0.3%トゥイーンで洗浄し、標識された二次抗体(例えば、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスIgG)でインキュベートする。
- 走査システムを使用して、ウェスタンブロット信号(例えば、ECF基板およびイメージングプラットフォーム)を評価する。
4. 免疫検査
- 最適な免疫反応性のための固定液に組織サンプルを入れる:0.96%(w/v)ピクリン酸および0.2%(w/v)ホルムアルデヒド0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH= 7.321、22、23 FOR 4 h RTで4時間の間、4°CでPBSで10%スクロースに移す。
- 組織切片21、22、23に標準免疫組織化学を行う。
- 動物の表皮を単一の凍結ブロックに埋め込み、マトリックスを埋め込み、クライオスタットで10〜30μmのセクションをカットします。ゼラチンコーティングされたガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付け、37°Cで2時間乾燥します。
- PBSで3、10分のリンスのためのセクションを洗浄し、一次アンチセラで24〜96時間インキュベート、 [例えば、マウス抗NGF(E12、1:2000)]およびウサギ抗タンパク質遺伝子産物9.9(PGP 9.5、1:2000)を0.3%(w/v)トリトンX-100(PBS-T)PBS-T0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)および0.5%ポリピニル(ポリピロン)を含むPBSで希釈した。
- 一次抗血清インキュベーションの後、PBSで10分間の部分をすすいで、ALEXA Fluor 488ロバ抗ウサギIgG(1:1000)とアレクサフルーター555ロバ抗マウスIgG(1:1000)で1時間インキュベートします。
- 10分間PBSで3回リンスセクションを、免疫蛍光の退色を遅らせる非フェージング実装媒体とカバースリップを貼付します。
5. RNAの単離とcDNA合成
- 皮膚サンプル21に対して標準の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行う。フェノール、グアニジンイソチオシアネート溶液を使用して全RNAを単離する。
- モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素による相補的DNA合成を行う。
- NGF および IL-6 増幅には、次のプライマー シーケンスを使用します。
NGF (センス) - GTGGACCCCAAACTGTッタガーアックッグ
NGF (アンチセンス) – GTGAGTCCGTTGTガーガガットGTACCATATAtG
IL-6 (センス) - GCAATTCTGTTGTATGAACAGCGATGC;
IL-6 (アンチセンス) – グタガーアックガッカガッカガグ - NGF および IL-6 mRNA のレベルをβアクチン ハウスキーピング遺伝子と比較します。
βアクチン(センス) - TGCGTガカッタアガガガグクトグタット
β-アクチン(アンチセンス) – ガアッGCTGCCGATAGTATGA - qRT-PCR システムを使用してサーマルサイクラーおよび定量リアルタイム PCR (qRT-PCR) を使用して定性的 RT-PCR を評価します。
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Representative Results
ラット後足へのカラギーナン注射は、赤みや浮腫16、17などの炎症の古典的な症状を引き起こした。後足の腫れをメカニカルキャリパー20で測定した。カラギーナン処理前に各ラットについて足の厚さのベースライン値を得て、6時間および12時間で再び測定した。足の厚さはベースライン値と比較して有意に増加した(図1)。
ラットグラブロス後足の皮膚のサーモリジンインキュベーションは、表皮のシートを生成しました.明視野顕微鏡を用いて、表皮と真皮のサーモリシン分離の有効性を評価した(図2)。表皮の層は、より高い倍率でシートを通して焦点を合わせながら決定することができる。表皮の断面のトルイジンブルー染色は、表皮が地下膜で真皮から分離されたことを示した(図3)。表皮のレテ尾根(表皮ペグ)は、真皮乳頭からのくぼみと共にそのままであった。全てのケラチノサイト細胞層が観察された。
サーリシン分離表皮のウェスタンブロッティングは、4°Cでの技術中に安定したタンパク質レベルを示す一貫した結果を生み出した。 ナイーブラット表皮ではNGFタンパク質が検出されたことはほとんどありませんが、NGFタンパク質レベルは、ナイーブ動物と比較してC-IIの6時間後(250%)上昇した(図4)。C-IIの12時間後、NGFレベルは6時間に比べて低下したが、対照に対して上昇した(55%)であった。分離された表皮中のNGFに対する免疫染色化学は、信頼性の高い免疫染色を提供し、ウェスタンブロットからの結果を確認した(図5)。NGF-免疫反応性(ir)は、ナイーブコントロール表皮では検出されなかったが、6時間C-IIでは、顆粒層および層lucidumのケラチノサイトの大部分にNGF-irがあった。尖塔の数個の細胞は、6時間C−IIでNGF免疫反応性(IR)であった。12時間C-IIで、NGF-irは、層顆粒球および層状顆粒の角質細胞で発生し、一部の細胞は、NGF-IRの層状に。どの時点でもNGF-irは地層バサレまたは角層で検出されなかった。PGP9.5-IR内皮下皮、ナイーブラットとC-IIラットから分離された表皮に静脈瘤神経線維が存在していた(図5)。
定性RT-PCRは、サーリシン分離表皮から良質のmRNAがあることを実証した(図6A、図7A)。定量的リアルタイムPCR用のハウスキーピング遺伝子としてアクチンを用い、C-II中の表皮におけるNGF mRNA発現は、ナイーブラットと比較して6時間で有意に上昇(>3倍)であった(図6B)。12時間で、NGF mRNAはベースラインレベルに戻った(図6B)。定量的リアルタイムPCR用のハウスキーピング遺伝子としてアクチンを用い、C-II中の表皮中のIL-6 mRNAは、ナイーブラットと比較して6時間で有意に上昇(>6倍)であった(図7B)。12時間で、IL-6 mRNAレベルは6h量から有意に低下したが、ナイーブラットと比較して上昇(2倍)のままであった(図7B)。
図1:カラギーナン注射で足浮腫が発生する。
カラギーナン治療前にラットごとにベースライン値を得た。6時間および12時間の治療の後、足の厚さはベースライン値と比較して有意に増加した。結果は、治療ごとに6匹のラットを持つSEMとして表されます(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001;学生のtテスト、ペアなし、2尾、各時点で行われました)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サーモリシンは表皮のシートを生成します。
明視野顕微鏡は、約1 mm x 2 mmの大きさの半透明の表皮シートを明らかにした。表皮の層は、より高い倍率でシートを通して焦点を合わせながら決定することができる。スケールバー= 500 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:表皮のトルイジンブルー染色。
ブライトフィールド顕微鏡は、サーモリジンが表皮と真皮の効果的な分離を引き起こしたと判断した。表皮レテ尾根(表皮ペグ;矢頭)は、真皮乳頭(矢印)からのくぼみと共に観察された。すべてのケラチノサイト細胞層はそのままであった。SB:ストラタムバサレ、SS:ストラタムスピノサム、SG:顆粒球層、SL:層明体、SC:角層。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:カラギーナン誘発炎症時の表皮におけるNGFタンパク質発現
NGFレベルは、ナイーブ動物と比較して6時間の炎症の後に増加した(250%)。12時間後、レベルは6時間に比べて減少したが、ナイーブ動物とは対照的に(55%)上昇した。結果は、グループごとに3匹のラットを持つSEMとして表されます(*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001;学生のtテスト、ペアなし、2尾は各時点で行われました )、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図5:C-II中のNGFおよびPGP9.5免疫反応性(ir)を示す。
列A、B、CはNGF-ir、PGP9.5-ir、およびDAPI核染色を示し、カラムA 1-C1はNGF-irのみを示す。すべての画像において、角質層は左方に向かって、層は右に向かう。NGF-irは、ナイーブ対照表皮で検出されなかった(A,A1)。6時間C-II(B,B1)では、NGF-irは、顆粒層(短矢印)および角質明石(長い矢印)の大部分の角質細胞に存在していた。尖塔の数個の細胞は、6時間C-II(大きな矢印)でNGF-irであった。12時間のC-II(C,C1)において、NGF-irは、層顆粒球および層状の明性(長い矢印)の角化細胞で発生し、一部の細胞は、階層顆粒球の中で、NGF-ir(短い矢印)を強く有する。どの時点でもNGF-irは地層バサレまたは角層で検出されなかった。PGP9.5-ir表皮内神経線維は、ナイーブおよびC-IIラット(小矢頭、A-C)から分離された表皮に存在した。SB:ストラタムバサレ、SS:ストラタムスピノサム、SG:顆粒層層、SL:ストラタムルシダム。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:カラギーナン誘発炎症時のNGF mRNA。
C-II中のサーモリシン分離表皮におけるNGF mRNA発現は、定性的PCR(A)および定量的リアルタイムPCR(B)により評価した。NGFおよびアクチンの定性的mRNAブロット(A)は、炎症の間に評価できる良質のmRNAがあることを実証した。C-II中の表皮におけるNGF mRNA発現は、ハウスキーピング遺伝子(B)としてアクチンを用いた定量リアルタイムPCRにより評価した。NGF mRNAは、ナイーブ未治療ラットと比較して6時間のC-II後(>3倍)有意に上昇したが、レベルは12h(B)でベースラインに戻った。結果は、グループごとに3匹のラットを持つSEMとして表されます(*p < 0.05、**p < 0.01、***p <0.001;学生のtテスト、ペアでない、2尾が各時点で行われました)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:カラギーナン誘発炎症時のIL-6 mRNA。
C-II中のサーモリシン分離表皮におけるIL-6 mRNA発現は、定性的PCR(A)および定量的リアルタイムPCR(B)により評価した。IL-6およびアクチンに対する定性的mRNAブロット(A)は、炎症時の評価に良質のmRNAがあることを示した。C-IIの際の表皮におけるIL-6 mRNA発現は、ハウスキーピング遺伝子(B)としてアクチンを用いた定量リアルタイムPCRにより評価した。IL-6 mRNAは、ナイーブ未治療ラット(B)と比較してC-IIの6時間後に有意に上昇した(>6倍)。12時間で、IL-6 mRNAレベルは6hレベルから有意に減少したが、ナイーブラット(B)と比較して上昇(2倍)のままでした。結果は、グループごとに2匹のラットを持つ平均S.E.M.として表されます(*p<0.05、**p<0.01、***p < 0.001、学生のtテスト、ペアになっていない、2尾が各時点で行われました)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、ラット後ろ足グラブロス皮膚の表皮は、2.5時間4°Cで1mMの塩化カルシウムを用いたPBSのサーモリシン(0.5 mG/mL)を使用して真皮から容易に分離されると判断した。組織学的評価により、表皮は基膜の真皮から分離され、表皮のレテ尾根はそのままであった。サーモライシンは、グラム陽性(ジオ)サーモプロテオリティクス24によって産生される細胞外金属内ペプチダーゼである。その活性は4°Cで安定しているが、温度10、24、25の広い範囲にわたって機能している。この酵素はタンパク質化学24,25に広く用いられてきたが、いくつかの群は表皮および/または真皮シート4、8、10、26、27への皮膚分離のためのその適用を示している。ワルツァーらは、4°C(250〜500 μg/mLの10)でサーリシンを用いたヒト皮膚の表皮皮膚分離を最初に報告した。光と電子顕微鏡法により、ラミニンと水疱性微粒子抗原部位10との間の表皮基部膜で分離が起こると判断した。
さらに、ヘミデスモソームは、基底ケラチノサイトの基底膜への付着物を、10、29に選択的に破壊した。ラクホルストらは、サーモリシン(4°C、500 μg/mL、一晩)をウサギ頬粘膜8の表皮皮膚分離に対するディスパーゼと比較した。サーモリシンは、種、インキュベーション時間、溶液組成物(サーモリシンの自己分解24を防ぐためのCaCl2なし)、サーモリシンの供給源、および/または他の研究10、26、27に対して異なる可能性があることを示す真皮から粘膜表皮を分離する際に不完全であった。現在のプロトコルのエンドユーザーは、新鮮なサーモリジンを使用し、常に塩化カルシウムを含める必要がありますが、また、これらの潜在的な制限を認識する必要があります。
一部の研究者は37°C26、29でサーモリシンを使用していますが、このプロトコルのユーザーは、タンパク質およびmRNAの安定性を維持するために皮膚組織を4°Cに保つことを念頭に置く必要があります。培養28において細胞を維持する上で有用性があるため、サーリシン分離前後の皮膚の溶液として4°CのDMEMを用い、サーモリシン8、26、27、30、31で皮膚分離に使用されています。しかし、Walzerらは、200μG/mLストレプトマイシン、200 U/mLペニシリン、2.5μg/mL真菌ゾーン10を補った無菌PBSを使用しましたが、他の人は異なる培地(例えば、表皮成長因子のないケラチノサイト培養培地)を使用しています。
プロトコルにおいて、熱分解は、500μg/mLの熱リサインと5mMの塩化カルシウムをPBS(pH=8)で行ったが、元の方法10と同様である。DMEMは、4°C(一晩)8でのサーモリジン分離の溶液として使用されており、HEPES緩衝液は2時間29時間37°Cで500μG/mLサーモリシン溶液で効果的に使用されている。しかし、我々は、培地または他の緩衝剤が表皮皮膚分離に対するサーリシンの活性にどのような影響を与えるかについては調べなかった。塩化カルシウムは、サーリシン24,32の自己分解を減少させる重要な付加であり、この工程の欠失は真皮8からの表皮の不完全な切断を招く可能性がある。
皮膚サンプルのサイズは、サーリシンインキュベーションに必要な時間と真皮からの表皮の酵素的切断の有効性に影響を与えるように見える。研究者は、自分の組織の適切なサンプルサイズとインキュベーション時間を評価する必要があります。表皮を上向きにしたサーモリシン溶液上にサンプルを浮かべて、最適な酵素効率10にとって重要である。先に述べたように、サーモリシンの作用部位はケラチノサイトヘミデスモソームおよび原膜4、10、29;したがって、サーモリシンは皮膚の縁から内側に働く。私たちの経験から、皮膚の縁はサンプルの真ん中よりも早く分離し、完全な酵素切断のための十分な時間を与えることを重要です。切断が完了すると、表皮は真皮から容易に引き離す必要があります。それでも付着している場合、層を引っ張ると、真皮の一部が表皮を持ち去る可能性があります。
サーモリシン技術の制限は、必要な時間です。サーモリジン濃度を500μG/mL以上に増やしても、分離時間は短くならず、より高濃度10では表皮の保存が悪い。表皮-真皮分離法は最近4つ検討されており、多くの方法は20~40°Cで30~60分を要する。 皮膚の熱(50~60°C)の分離は速く(30~10分)4ですが、このような高温でタンパク質やmRNAは急速に分解することが知られています。あるいは、RTでチオシアネートナトリウム(2N)は、受け入れ可能な急速分離技術(5分)4、6であり得るが、タンパク質およびmRNAの完全性はこの方法6で研究されていない。この冷熱法はタンパク質とmRNAの保存のために選ばれましたが、他の技術を用いたタンパク質とmRNAの完全性の間で直接比較は行われなかった。
本研究では、炎症時のmRNAおよびタンパク質変化の評価のために表皮を真皮から分離する有効な方法であることが、冷熱酵素消化法であることが実証されている。カラギーナンによる炎症の間、NGF mRNAおよびタンパク質レベルおよびIL-6 mRNAレベルは6時間で上昇し、ベースラインに近い12時間戻った。免疫細胞化学では、NGF免疫反応性が6時間および12時間のケラチノサイトで増加した。サーモリシン法の利点は、部位選択的分析を行う能力である。例えば、現在の研究におけるNGFおよびIL-6の産生増加は、ケラチノサイトからであり、真皮細胞はアッセイから除外されるからである。この方法は、プライマリの不感性端末33の感作のための位置およびメディタータイプに関する洞察を可能にする。さらに、この方法は、炎症34、35の間に一次性の眼炎における取り込みおよび輸送と共にニューロトロフィン産生の時間経過をよりよく理解することを可能にする。
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Disclosures
著者は開示を持っていません。
Acknowledgments
この研究のための資金は、国立衛生研究所NIH-AR047410(KEM)によって提供されました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
