Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a separação da epiderme da derme para avaliar a produção de mediadores inflamatórios. Após a inflamação, a epiderme da pata traseira de rato é separada da derme por termolysina a 4 °C. A epiderme é então usada para análise de mRNA por RT-PCR e avaliação de proteínas por mancha ocidental e imunohistoquímica.
Abstract
Técnicas fáceis de usar e baratas são necessárias para determinar a produção específica do local de mediadores inflamatórios e neurotrophins durante lesões, inflamações e/ou sensibilização da pele. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo de separação epidérmico-dérmica usando termolysina, uma proteína que está ativa a 4 °C. Para ilustrar este procedimento, os ratos Sprague Dawley são anestesiados, e as patas traseiras direitas são injetadas com carrageenan. Seis e doze horas após a injeção, ratos com inflamação e ratos ingênuos são eutanizados, e um pedaço de pata traseira, pele glabrous é colocada no frio Dulbecco's Modified Eagle Medium. A epiderme é então separada na membrana do porão da derme por termolysina em PBS com cloreto de cálcio. Em seguida, a derme é protegida por fórceps de microdisseção, e a epiderme é gentilmente provocada. A coloração azul toluidina das seções teciduais mostra que a epiderme é separada limpamente da derme na membrana do porão. Todas as camadas celulares queratinócitos permanecem intactas, e as cristas epidérmicas de rete, juntamente com recuos de papilas dérmicas são claramente observadas. O RT-PCR qualitativo e em tempo real é usado para determinar o fator de crescimento nervoso e os níveis de expressão interleucina-6. Manchas ocidentais e imunohistoquímica são finalmente realizadas para detectar quantidades de fator de crescimento nervoso. Este relatório ilustra que a digestão da termolise fria é um método eficaz para separar a epiderme da derme para avaliação de alterações de mRNA e proteínas durante a inflamação.
Introduction
A avaliação de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos da pele pode ser limitada devido à heterogeneidade dos tipos celulares encontrados na derme inflamada e epiderme1,2,3. Várias enzimas, técnicas químicas, térmicas ou mecânicas envolvendo separação das duas camadas ou para a realização da dissociação celular para avaliação foram revisadas recentemente4. Ácido, álcali, sal neutro e calor podem dividir a epiderme da derme rapidamente, mas o inchaço celular e extracelular geralmente ocorre5,6. Tripo, pancreatina, descamefástase, keratinase, colagenase, pronase, dispase e termolise são enzimas que foram usadas para separação epidérmico-dérmica4,7. Trippsina e outras enzimas proteolíticas de larga escala estão ativas a 37-40 °C, mas devem ser monitoradas cuidadosamente para evitar a dissociação de camadas epidérmicas. Dispase corta a epiderme na lamina densa, mas requer 24h para separação no frio4,8 ou pontos de tempo mais curtos a 37 °C4,9. Uma característica limitante de todas essas técnicas é a potencial interrupção da morfologia tecidual e perda de integridade de mRNA e proteína.
Para manter a integridade do mRNA e da proteína, um método de separação da pele deve ser realizado no frio por um curto período de tempo. Na avaliação das técnicas de separação da pele para estudos de inflamação, a termolise é uma enzima eficaz para separar a epiderme da derme a temperaturas frias4. A termolise está ativa a 4 °C, corta hemidesmosmosomos epidérmicos da lamina lucida, e separa a epiderme da derme dentro de 1-3 h4,8,10. O objetivo deste relatório é otimizar o uso de termolysina para separação de epiderme inflamada de ratos inflamados da derme para detectar níveis de mRNA e proteína para mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos. Vários relatórios preliminares foram apresentados11,12,13,14,15. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica ideal de separação da pele utilizando termolysina e demonstrar a detecção de 1) marcadores de inflamação, 2) interleucina-6 (IL-6) mRNA, e 3) mRNA e proteína na epiderme de ratos com inflamação induzida por carrageenano (C-II)16,17. Um relatório preliminar usando o modelo adjuvante completo da Freund indica que os níveis de MRNA e proteína ngf aumentam precocemente durante a inflamação15. Em camundongos, a sensibilização da pele com a aplicação tópica da oxazolona causa um aumento precoce no IL-6 mRNA usando a hibridização in situ36. Tanto o IL-6 quanto o NGF foram implicados em C-II18,19, mas não houve relatos que descrevam níveis de mRNA ou proteína para IL-6 ou NGF especificamente da epiderme durante os estágios agudos de C-II.
A técnica de termolise é barata e simples de executar. Além disso, a separação termolísina da epiderme da derme permite a análise mRNA, western blot e imunohistoquímica de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos durante o processo de inflamação15. Os pesquisadores devem ser capazes de usar facilmente essa técnica em estudos pré-clínicos e clínicos de inflamação cutânea.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Inflamação induzida por carrageenano (C-II)
- Anestesize ratos machos e/ou fêmeas Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 semanas de idade) com isoflurane (ou anestésico injetável).
- Verifique a profundidade da anestesia tocando a córnea e apertando levemente a pata traseira esquerda. Quando o animal estiver apropriadamente anestesiado, nenhuma resposta de córnea ou pata será observada.
- Injete subcutâneamente o glabrous direito, pata traseira com 100 μL de 1% (w/v) diluído em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)20.
- Certifique-se de que sejam utilizados controles apropriados, como ratos ingênuos sem isoflurano neste relatório. Estudos preliminares indicam que ratos ingênuos com ou sem isoflurano têm a mesma expressão basal de IL-6 epidérmico e NGF.
NOTA: Ratos ingênuos são controles preferenciais para estudos de inflamação, uma vez que o soro fisiológico subcutâneo ou a PBS causam uma inflamação local23,37.
- Certifique-se de que sejam utilizados controles apropriados, como ratos ingênuos sem isoflurano neste relatório. Estudos preliminares indicam que ratos ingênuos com ou sem isoflurano têm a mesma expressão basal de IL-6 epidérmico e NGF.
- Avaliar o edema dos ratos C-II para garantir a eficácia do carrageenano (Figura 1)20. Determine a quantidade de edema medindo a espessura metatarsal da pata traseira com pinças.
- Às 6-12 h, eutanize os ratos com CO2 (ou overdose anestésico injetável) e corte 1 mm x 2 mm de pele de pata traseira glabrous com bisturi afiado. Se for usada a pele pelada, raspe-a antes de cortar os pedaços de pele de 1 mm x 2 mm.
NOTA: Certifique-se de que os pontos de tempo apropriados sejam escolhidos de acordo com os estudos específicos. - Usando fórceps de microdisseção, transfira a pele para 1 mL de DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco em um tubo de microcentrifusagem no gelo e mantenha frio por 15-60 min.
2. Separação termolysina de epiderme e derme
- Prepare e ative a termolise.
- Prepare uma solução de termolise, adicionando 5 mg de Geobacillus stearothermophilus a 10 mL de PBS, em pH = 8 (concentração 500 μg/mL).
- Prepare uma solução de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2 anidro) adicionando 1,11 g em 10 mL de H2O destilado.
- Para prevenir a autolise da termolise, adicione 10 μL de cloreto de cálcio a 10 mL de solução termolise. A concentração final do cloreto de cálcio será de 1 mM.
- Aliquot 1 mL de termolysina ativada em 10 poços de uma placa de cultura de 24 poços no gelo.
- Use a digestão da enzima termolise para separar a epiderme da derme.
- Usando fórceps de microdisseção, transfira uma amostra de pele para cada poço de termolise ativada. Certifique-se de não mergulhar a pele na solução termolysina.
- Bata suavemente a pele na lateral do poço para ajudar na liberação da amostra de pele das fórceps para flutuar sobre a solução termolysin.
- Flutue a pele para dentro da solução termolise com o lado estrato corneum (epiderme externa) para cima e derme voltado para baixo. É fundamental que a dermis enfrente, ou a separação efetiva não ocorra.
NOTA: A quantidade de tempo para a incubação da termolise deve ser determinada empiricamente pelo usuário final. Glabrous, pele de pata traseira de ratos Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 semanas de idade) muitas vezes requer 2,0-2,5 h para separação. Espera-se que o tempo de incubação varie com espécies e idade. - Após o tempo de incubação adequado na termolise, use fórceps de microdisseção para transferir uma amostra de pele para um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com 7-8 mL de DMEM frio (4 °C). Isso permite mais espaço para a separação da epiderme da derme.
- Mergulhe a pele no DMEM.
- Escove suavemente a epiderme com os fórceps ao redor do perímetro da pele até que a epiderme quase translúcida seja observada nas bordas. Se isso não for alcançado, devolva a amostra de pele à solução termolise por mais 15-30 min.
- Uma vez que a epiderme se separe visivelmente da derme, em seguida, segure cuidadosamente tanto a epiderme quanto a derme com fórceps de microdisseção e muito lentamente puxe a epiderme da derme.
- Avalie a translucência da epiderme isolada e certifique-se de que ela seja opticamente consistente. Consulte a Figura 2 para um exemplo de uma amostra de 1 mm x 2 mm de epiderme de rato. Se há uma variação na translucência, então a separação adequada não ocorreu.
- Inativar termolysina usando ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) nos pedaços separados de epiderme e derme.
ATENÇÃO: A termolise que permanece na epiderme e na derme ainda está ativa e pode danificar as camadas se não for inativada.- Prepare uma solução de estoque 0,5 M EDTA. Para isso, adicione lentamente 0,93 g EDTA em 5 mL de água duplamente destilada. Adicione hidróxido de sódio à solução até que ela se limpe. Certifique-se de que o pH da solução é ~8.0.
- Faça uma solução EDTA de 5 mM no DMEM. Adicione 0,25 mL de 0,5 M EDTA solução de estoque a 25 mL de DMEM.
- Coloque a epiderme e a derme separadas na solução EDTA/DMEM de 5 mM a 4 °C por 30 minutos para desativar a atividade da termolise.
- Avalie a epiderme com histologia tinctorial8,9,10.
- Fixar uma porção da epiderme em uma formalina 10% neutra, 4% paraformaldeído, ou 0,25% paraformaldeído com solução de ácido picrico de 0,8% para 1h à temperatura ambiente (TR) com agitação.
- Coloque a epiderme fixa em 10% de sacarose em PBS por 1h no RT com agitação.
- Congele a epiderme em uma matriz de incorporação de tecido para seção. Corte 14 seções transversais de 14 μm usando um criostat e seções de montagem de degelo em lâminas de microscópio de vidro revestidas de gelatina.
- Seções secas em um aquecedor de slides e mancha com uma solução de trabalho de azul toluidina (TB; 10% TB em cloreto de sódio 1%) para 90 s. O appose cobre clipes com um meio de montagem aquoso.
- Observe a epiderme com microscopia de campo brilhante em 50x-250x.
NOTA: Se ocorreu a separação adequada, a epiderme será dividida limpamente da derme e as cinco camadas serão detectadas: estrato basale, estrato spinosum, estrato granuloso, estrato lucidum e corneum estrato. Um exemplo de epiderme separada da pele de rato pode ser visto na Figura 3.
3. Extração de proteínas e análise de manchas ocidentais
- Realize manchas ocidentais nas amostras de tecido separados usando o protocolo21publicado anteriormente .
- Homogeneize a epiderme em 50 μL de tampão de lise (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerol e 1% Triton X-100) contendo fosfatase e coquetel inibidor de protease.
- Centrífuga amostras a uma velocidade máxima de 15 min a 4 °C e avaliar o sobrenante para concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteínas.
- Carregar concentrações iguais de proteína (30 μg) em géis SDS, realizar eletroforese e, em seguida, transferir proteínas para membranas nitrocelulose ou PVDF.
- Bloqueie as membranas com 5% de leite por 2 h e incubar durante a noite em anticorpo primário (camundongo anti-NGF, E12, 1:1000).
- Lave 3x com PBS com 0,3% de interpolação por 10 min cada e incuba com um anticorpo secundário rotulado (por exemplo, fosfatese alcalina rotulada anti-rato IgG).
- Use um sistema de varredura para avaliar o sinal de mancha ocidental (por exemplo, substrato ECF e uma plataforma de imagem).
4. Imunohistoquímica
- Coloque amostras de tecido em um fixador para a imunoreatividade ideal: 0,96% (w/v) ácido picrico e 0,2% (w/v) formaldeído em 0,1 M tampão fosfato de sódio, pH = 7,321,22,23 por 4 h na RT. Transfira para 10% de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C.
- Realizar imunohistoquímica padrão nas seções teciduais21,22,23.
- Incorpore a epiderme dos animais em um único bloco congelado na matriz de incorporação e corte seções de 10 a 30 μm em um criostat. Monte as seções em lâminas de microscópio de vidro revestidas de gelatina e seque a 37 °C por 2 h.
- Lavar seções para três, 10 min enxagua em PBS e incubar por 24-96 h em antissoro primário, [por exemplo, camundongo anti-NGF (E12, 1:2000)] e produto genético anti-proteína de coelho 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) diluído em PBS contendo 0,3% (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T com albumina de soro bovino de 0,5% (BSA) e 0,5% polivinylpyrrolidone (PVP).
- Após a incubação primária do anti-coelhinho, enxágue seções três vezes por 10 min na PBS e incubar 1 h na RT em Alexa Fluor 488 burro anti-coelho IgG (1:1000) e Alexa Fluor 555 burro anti-mouse IgG (1:1000) diluído em PBS-T.
- Enxágüe seções três vezes em PBS por 10 min e afixe tampas com meio de montagem não desbotado para desbotamento retardado da imunofluorescência.
5. Isolamento do RNA e síntese de CDNA
- Realize a reação padrão de cadeia de transcriptase reversa (RT-PCR) nas amostras de pele21. Isole o RNA total usando uma solução de isothiocianato de fenol e guanidina.
- Realizar síntese de DNA complementar pelo vírus da leucemia murina Moloney reverter transcriptase.
- Use as seguintes sequências de primer para amplificação NGF e IL-6:
NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Sentido) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG - Compare os níveis de NGF e IL-6 mRNA com o gene de limpeza de β-actin:
β-ACTIN (Sentido) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - Avalie com RT-PCR qualitativo usando ciclofatritor térmico e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) usando um sistema qRT-PCR.
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Representative Results
A injeção de carrageenano na pata traseira do rato causou sintomas clássicos de inflamação, como vermelhidão e edema16,17. O inchaço da pata traseira foi medido com pinças mecânicas20. Um valor de linha de base da espessura da pata foi obtido para cada rato antes do tratamento carrageenano e medido novamente às 6h e 12 h. A espessura da pata aumentou significativamente em relação aos valores da linha de base(Figura 1).
A incubação termolise da pele da pata traseira glabrous do rato produziu uma folha de epiderme. A microscopia brightfield foi utilizada para avaliar a eficácia da separação termolise da epiderme e da derme(Figura 2). As camadas da epiderme poderiam ser determinadas enquanto se concentravam através da folha em maior ampliação. A coloração azul toluidina das seções transversais epidérmicas mostrou que a epiderme foi separada da derme na membrana do porão(Figura 3). As cristas epidérmicas de rete (pinos epidérmicos) juntamente com as recuos das papilas dérmicas estavam intactas. Todas as camadas celulares queratinócitos foram observadas.
A mancha ocidental de epiderme separada por termolysina produziu resultados consistentes indicando níveis de proteína estáveis durante a técnica a 4 °C. Muito pouca proteína NGF foi detectada em epiderme de rato ingênuo, mas os níveis de proteína NGF foram elevados (250%) após 6h de C-II em comparação com animais ingênuos(Figura 4). Após 12h de C-II, os níveis de NGF foram reduzidos em relação a 6h, mas permaneceram elevados (55%) em relação aos controles. A imunohistoquímica para NGF na epiderme separada forneceu imunostenções confiáveis e confirmou os resultados das manchas ocidentais(Figura 5). NGF-imunoreactivity (ir) não foi detectado em epiderme de controle ingênuo, mas às 6h C-II, houve NGF-ir na maioria dos queratinócitos do estrato granuloso e estrato lucidum. Algumas células para o spinosum estrato foram NGF-imunoreactive (IR) a 6 h C-II. Às 12 h C-II, NGF-ir ocorreu em queratinócitos do estrato granuloso e estrato lucidum com algumas células no estrato granulosum intensamente NGF-IR. Em nenhum ponto de tempo foi detectado NGF-ir em estrato basale ou corneum estrato. PGP9.5-IR intraepidérmica, fibras nervosas varizes estavam presentes na epiderme separada de ratos ingênuos e C-II(Figura 5).
O RT-PCR qualitativo demonstrou que havia mRNA de boa qualidade de epiderme separada da termolise(Figura 6A, Figura 7A). Usando actin como um gene de limpeza para PCR quantitativo em tempo real, a expressão NGF mRNA em epiderme durante C-II foi significativamente elevada (>3 vezes) em 6h em comparação com ratos ingênuos(Figura 6B). Às 12 h, o NGF mRNA retornou aos níveis de linha de base(Figura 6B). Usando actin como um gene de limpeza para PCR quantitativo em tempo real, IL-6 mRNA em epiderme durante C-II foi significativamente elevado (>6 vezes) em 6 h em comparação com ratos ingênuos(Figura 7B). Às 12 h, os níveis de IL-6 mRNA caíram significativamente das quantidades de 6h, mas permaneceram elevados (2 vezes) em comparação com ratos ingênuos(Figura 7B).
Figura 1: A injeção de carrageenano produz edema de pata.
Um valor de linha de base foi obtido para cada rato antes do tratamento carrageenano. Após 6h e 12h de tratamento, a espessura da pata aumentou significativamente em relação aos valores da linha de base. Os resultados são expressos como o MEI com seis ratos por tratamento (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; o teste t do aluno, não remunerado, de duas caudas, foi realizado em cada ponto de tempo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A termolise produz uma folha de epiderme.
A microscopia Brightfield revelou uma folha epidérmica translúcida de aproximadamente 1 mm x 2 mm de tamanho. As camadas da epiderme poderiam ser determinadas enquanto se concentravam através da folha em maior ampliação. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mancha azul toluidina da epiderme.
A microscopia brightfield determinou que a termolise causou uma separação efetiva da epiderme da derme. Cumes de rete epidérmicos (pinos epidérmicos; pontas de flecha) foram observados juntamente com recuos de papilas dérmicas (flechas). Todas as camadas de células queratinócitos estavam intactas. SB: estrato basale, SS: estrato spinosum, SG: estrato granulosum, SL: estrato lucidum, SC: estrato corneum. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão proteica NGF em epiderme durante inflamação induzida por carrageenano.
Os níveis de NGF foram aumentados (250%) após 6h de inflamação em comparação com animais ingênuos. Após 12h, os níveis foram reduzidos em relação a 6h, mas elevados (55%) em contraste com os animais ingênuos. Os resultados são expressos como o MEI com três ratos por grupo (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; teste t do aluno, não realizado, duas caudas foi realizado em cada ponto de tempo) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: NGF e PGP9,5 imunoreatividade (ir) durante C-II.
As colunas A,B,C mostram NGF-ir, PGP9.5-ir e mancha nuclear DAPI, enquanto as colunas A1-C 1 mostramapenas NGF-ir. Em todas as imagens, o estrato corneum é em direção à esquerda e estrato basale para a direita. NGF-ir não foi detectado em epiderme de controle ingênuo (A, A1). Às 6 h C-II (B,B1), NGF-ir esteve presente na maioria dos queratinócitos do estrato granuloso (setas curtas) e estrato lucidum (flechas longas). Algumas células para o estrato spinosum eram NGF-ir a 6 h C-II (grandes pontas de flecha). Às 12 h C-II (C,C1), NGF-ir ocorreu em queratinócitos do estrato granuloso e estrato lucidum (setas longas) com algumas células no estrato granuloso intensamente NGF-ir (setas curtas). Em nenhum ponto de tempo foi detectado NGF-ir em estrato basale ou corneum estrato. As fibras nervosas intraepidérmicas PGP9.5-IR estavam presentes na epiderme separada de ratos ingênuos e C-II (pequenas pontas de flecha, A-C). SB: estrato basale, SS: estrato spinosum, SG: estrato granuloso, SL: estrato lucidum. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: NGF mRNA durante inflamação induzida por carrageenano.
A expressão mRNA NGF em epiderme separada da termolise durante a C-II foi avaliada por PCR qualitativo (A)e PCR em tempo real quantitativo(B). As manchas de mRNA qualitativas (A) para NGF e actina demonstraram que havia mRNA de boa qualidade que poderia ser avaliada durante a inflamação. A expressão mRNA NGF em epiderme durante c-II foi avaliada por PCR em tempo real quantitativo utilizando actin como gene de limpeza (B). O mRNA NGF foi significativamente elevado (>3 vezes) após 6h de C-II em comparação com ratos ingênuos não tratados, mas os níveis voltaram à linha de base em 12 h (B). Os resultados são expressos como o MEI com três ratos por grupo (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; o teste t do aluno, não remunerado, de duas caudas foi realizado em cada ponto de tempo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: IL-6 mRNA durante inflamação induzida por carrageenano.
A expressão IL-6 mRNA em epiderme separada por termolysina durante o C-II foi avaliada por PCR qualitativo (A) e PCR em tempo real quantitativo(B). As manchas de mRNA qualitativas (A) para IL-6 e actina mostraram que havia mRNA de boa qualidade para avaliação durante a inflamação. A expressão IL-6 mRNA em epiderme durante o C-II foi avaliada pelo PCR quantitativo em tempo real usando actin como gene de limpeza (B). O IL-6 mRNA foi significativamente elevado (>6 vezes) após 6 h de C-II em comparação com ratos ingênuos não tratados (B). Às 12 h, os níveis de IL-6 mRNA foram reduzidos significativamente dos níveis de 6h, mas permaneceram elevados (2 vezes) em comparação com ratos ingênuos (B). Os resultados são expressos como a média S.E.M. com dois ratos por grupo (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, teste t do aluno, não remunerado, de duas caudas foi realizada em cada ponto de tempo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O estudo determinou que a epiderme da pele de pata traseira de rato foi facilmente separada da derme usando termolise (0,5 mG/mL) em PBS com cloreto de cálcio de 1 mM a 4 °C por 2,5 h. A avaliação histológica indicou que a epiderme foi separada da derme na membrana do porão e que as cristas de rete epidérmicas estavam intactas. Termolysina é um metalloendopeptidase extracelular produzido por Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Sua atividade é estável a 4 °C, mas é funcional sobre uma ampla faixa de temperaturas10,24,25. Esta enzima tem sido usada extensivamente para química proteica24,25, mas vários grupos têm mostrado sua aplicação para separação da pele em folhas epidérmicas e/ou dérmicas4,8,10,26,27. Walzer et al. foram os primeiros a relatar separação epidérmico-dérmica da pele humana usando termolise a 4 °C (250-500 μg/mL por 1 h)10. Com a microscopia de luz e elétron, a separação foi determinada a ocorrer na membrana do porão epidérmico entre laminina e o antígeno pemphigoide10.
Além disso, os hemidesmosomostos, os anexos dos queratinócitos basais à membrana do porão, foram interrompidos seletivamente10,29. Rakhorst et al. compararam termolysina (4 °C, 500 μg/mL, durante a noite) para dispase para separação epidérmico-dérmica da mucosa bucal do coelho8. A termolise estava incompleta na separação da epiderme mucosa da derme, o que significa que podem ocorrer diferenças para espécies, tempo de incubação, composição da solução (no CaCl2 para prevenir a autolise termolísina24),fonte de termolise e/ou diferenças específicas do local indicadas de outros estudos10,26,27. Os usuários finais do protocolo atual devem ter certeza de usar termolysina fresca e sempre incluir cloreto de cálcio, mas também devem estar cientes dessas possíveis limitações.
Embora alguns pesquisadores tenham usado termolysina a 37 °C26,29, os usuários deste protocolo devem estar atentos para manter o tecido da pele a 4 °C para preservar a estabilidade da proteína e do mRNA. Utilizamos DMEM a 4 °C como solução para a separação da pele antes e depois da separação da termolise devido à sua utilidade na manutenção de células na cultura28, e tem sido usada anteriormente para separação da pele com termolysina8,26,27,30,31. No entanto, Walzer et al. utilizaram PBS estéril suplementado com estreptomicina de 200 μG/mL, penicilina U/mL e 2,5 μg/mL fungizone10, enquanto outros utilizaram diferentes mídias (por exemplo, mídia de cultura queratinócito livre do fator de crescimento epidérmico) seguido pelo pbs enxaguando29.
No protocolo, a separação da termolise foi realizada em termolysina de 500 μg/mL e cloreto de cálcio de 5 mM em PBS (pH = 8), semelhante ao método original10. O DMEM tem sido usado como solução para separação termolise a 4 °C (durante a noite)8, e o buffer HEPES tem sido usado efetivamente com 500 μG/mL solução termolísina a 37 °C por 2h29. No entanto, não exploramos como o meio da cultura ou outros buffers afetam a atividade da termolise para a separação epidérmico-dérmica. O cloreto de cálcio é uma adição importante para diminuir a autolise da termolise24,32 e a exclusão desta etapa pode levar ao decote incompleto da epiderme da derme8.
O tamanho da amostra de pele parece influenciar o tempo necessário para a incubação da termolise e a eficácia do decote enzimático da epiderme da derme. Os investigadores precisam avaliar o tamanho da amostra e o tempo de incubação adequados para seus próprios tecidos. Flutuar as amostras na solução termolise com a epiderme voltada para cima é importante para a eficácia ideal da enzima10. Como observado anteriormente, o local de ação para termolysina está nos hemidesmosmostos de hemidesmosotos queratinócitos e membrana do porão4,10,29; portanto, a termolise trabalha para dentro das bordas da pele. Pela nossa experiência, as bordas da pele se separam mais cedo do que o meio da amostra, e é importante dar tempo suficiente para decote enzimático completo. Quando o decote estiver completo, a epiderme deve se afastar facilmente da derme. Se ainda estiver preso, puxar as camadas pode fazer com que porções de derme saiam com a epiderme.
Uma limitação da técnica termolise é o tempo necessário. O aumento da concentração de termolysina para além de 500 μG/mL não diminui o tempo de separação e há má preservação da epiderme em concentrações mais elevadas10. Métodos de separação epidérmico-dérmico foram revisados recentemente4, e muitos métodos levam de 30 a 60 min a 20-40 °C. A separação do calor (50-60 °C) da pele ocorre rapidamente (30 s a 10 min)4, mas proteínas e mRNA são conhecidos por se degradarem rapidamente a temperaturas tão altas. Alternativamente, o tiocianato de sódio (2 N) na RT pode ser uma técnica de separação rápida aceitável (5 min)4,6, mas a proteína e a integridade do mRNA não foram estudadas com este método6. O método termolysina fria foi escolhido para a preservação da proteína e do mRNA, mas não houve comparações diretas feitas entre a proteína e a integridade do mRNA utilizando outras técnicas.
No presente estudo, a digestão da termolysina fria é demonstrada como um método eficaz para separar a epiderme da derme para avaliação de alterações de mRNA e proteína durante a inflamação. Durante a inflamação induzida por carrageenano, os níveis de MRNA e proteína nGF e os níveis de IL-6 mRNA foram elevados em 6 h, retornando perto da linha de base em 12 h. Com a imunohistoquímica, a imunoreatividade NGF foi aumentada em queratinócitos às 6h e 12h. Uma vantagem do método termolise é a capacidade de realizar análises seletivas no local. Por exemplo, o aumento da produção de NGF e IL-6 no presente estudo é de queratinócitos, uma vez que as células dérmicas são excluídas dos ensaios. Este método permite uma visão dos tipos de localização e mediadores para sensibilização dos terminais primáriosaferentes 33. Além disso, este método permite uma melhor compreensão do curso de tempo da produção de neurotrophin, juntamente com a absorção e transporte em aferentes primários durante a inflamação34,35.
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Disclosures
Os autores não têm revelações.
Acknowledgments
O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
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