Summary
Her præsenterer vi en protokol til præcist at danne hemogen endotelet fra humane pluripotente stamceller i en feeder-og Xeno-fri tilstand. Denne metode vil have brede anvendelsesmuligheder i sygdom modellering og screening for terapeutiske forbindelser.
Abstract
Afledte funktionelle hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller (Hspc'er) fra humane pluripotente stamcelle (kvikskrankerne) har været et flygtigt mål for autologe transplantationer til behandling af hæmatologiske og maligne lidelser. Hemogenic endothel (HE) er en genstand platform til at producere funktionelle hspc'er ved transkription faktorer eller til at inducere lymfocytter på en robust måde. Men de nuværende metoder til at udlede HE er enten dyrt eller variable i udbyttet. I denne protokol etablerede vi en omkostningseffektiv og præcis metode til at udlede HE inden for 4 dage i en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand. Den resulterende han gennemgik en Endothelial-til-hæmatopoietisk overgang og producerede CD34+CD45+ clonogenic hæmatopoietiske progenitorer. Den potentielle kapacitet af vores platform til at generere funktionelle Hspc'er vil have brede applikationer i sygdoms modellering og screening for terapeutiske forbindelser.
Introduction
Udviklingen af nye lægemidler til hæmatologiske og immunologiske lidelser er blevet hæmmet af manglen på robuste platforme til sygdoms modellering og høj gennemstrømning af lægemiddel screening med autologe hæmatopoietiske stamceller (HSCs) afledt af patientens pluripotente stamceller (kvikskranker). Gennembruddet i den inducerede (i) PSC-teknologi lover at modellere sygdomme fra patienternes celler, men etableringen af funktionelle Hsc'er fra patient-iPSCs har været undvigende. For at kunne udlede hscs fra menneskelige kvikskranker er den korrekte induktion af embryonale mønster-og transskriptionelle programmer nøgle1,2,3,4,5,6, 7,8. Nylige fremskridt inden for hæmatopoietisk udvikling har vist den rolle, som hemogen endotelet (HE) i HSC udvikling9. Han kan induceres fra kvikskrankerne og er i stand til at gribe ind i nedstrømsinterventioner såsom genoverførsel10,11,12,13. Ved hjælp af HE som en platform, kombinationen af 5 transkription faktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) med succes inducerede funktionelle hscs at indpode langsigtede og differentiere i flere slægter14. Variabel og ineffektiv generering af HE fra kvikskrankerne har imidlertid hæmmet den systematiske manipulation og analyse af celler sammen med den off-the-shelf produktion og store induktion af hæmatopoietiske celler til klinisk brug.
Her beskriver vi en omkostningseffektiv og præcis metode til at udlede HE i 4 dage med en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand. I denne metode sikrer sfæroide dannelse og spontan re-samkopiering på imarix-511 en konsistent tæthed af PSC-kolonier, hvilket er afgørende for effektiv induktion af HE-celler.
Protocol
1. reagenser
- Cellelinjer (menneskelige kvikskranker): få enten embryonale stamceller (Esc'er) eller iPSC-linjer 409B2 og 201B7 (317-9)) og CBA11.
-
Klargøring af reagens
- PSC plating medium: Bland PSC vedligeholdelses medium med 10 μM Y-27632 og opbevares ved 4 °C.
- PSC Spheroid flisebelægning medium: Bland PSC vedligeholdelses medium med 625 – 1250 ng/mL humant rekombinant Laminin-511 E8 fragment (LM511-E8) (afhængigt af cellelinje) lige før brug.
Bemærk: LM511-E8 kan blandes i medie15. Andre matrix såsom fuld længde Laminin-511 skal være præ-belagt, og selv gjorde det, de ikke opretholde mesodermal organoider holdes under differentierings processen. - Dag 0 differentialmedium: Bland Mesodermal basal medium med 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL knogle morfogenetisk protein 4 (BMP4) og 80 ng/ml vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF).
- Dag 2 differentierings medium: Bland Hemogenic basal medium med 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF og 100 ng/mL stamcellefaktor (SCF).
- Klargør fosfatbuffer salt (PBS) uden calcium eller magnesium (Se tabel over materialer).
- 1 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) buffer: Tilsæt 1 mL 0,5 M EDTA til 500 mL PBS.
- EHT medium: Bland hæmatopoietisk basal medium med 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL trombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-relateret tyrosin kinase 3 ligand (flt-3L), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6-receptor Alpha (IL-6/IL-6Rα), insulin-transferrin-selenium-ethanolamin, L-glutamin og penicillin/streptomycin/amphotericin B.
- FACS buffer: Bland PBS med 2% føtalt kalv serum og 1 mM EDTA.
- Forbered magnetisk separations buffer (Se tabel over materialer).
- Forbered methylcellulose-baserede medier (Se tabel over materialer).
2. PSC koloni formation
- Forøg hPSCs til 70 – 80% sammenløbet på en 0,5 μg cm-2 LM511-E8-coated 6-brønd plade i mTeSR1 i en 37 °c-inkubator med 5% Co2.
-
PSC-afkobling (dag-4)
- Aspirer mediet, og vask cellerne med PBS to gange. Skyl cellerne med dissociations opløsning. Der inkuperes ved 37 °C i 15 minutter (cellerne vil ikke tørre i dette tidsrum).
- Afbryd cellerne i PSC-vedligeholdelses mediet, Overfør suspensionen til et passende mellemstort rør og centrifuge cellerne ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, og Afbryd CELLERNE i PSC plating medium.
- Den PSC-suspensioner fastholdes med en densitet på 48.000 – 70.000 celler cm-2 (afhængigt af celle linjen) på et mikro-fabrikeret plastic fartøj, og der inkuleeres natten i en 37 °c-inkubator med 5% Co2.
Bemærk: Vi anbefaler 100 μL brønd-1 af cellesuspension i et 96-godt mikro-fabrikeret plastikbeholder. Du vil typisk frø 20.000 celler godt-1 i en 96-brønd plade til at give ca 100 sfæroider. -
Flisebelægning af PSC-sfæroider på LM511-E8 (Dag-3)
- Saml de PSC-sfæroider i et 15 mL konisk rør ved forsigtigt at pipette ved hjælp af P1000-Mikropipetter, og lad sfærooiderne stå ved stuetemperatur i 2 minutter for at udløse tyngdekraften. Aspirer supernatanten.
- Suspension i sfæroide plating medium, dispensere suspensionen i en ikke-belagt 6-brønd kultur plade med en tæthed på 4-spheroids cm-2 og kultur i 37 °c inkubator med 5% Co2 i tre dage.
3. hemogen induktion (dag 0)
- Aspirer mediet, tilsæt Day0 differentierings medium og-kultur i 37 °C-inkubatoren med 5% O2 og 5% Co2 (hypoxic-inkubator).
- Efter to dages kultur i Day0 differentierings medium, aspirerer mediet, tilsæt derefter Dag2 differentierings medium og-kultur i den hypoxiske inkubator.
4. isolering af Hemogen endothelium (dag 4)
- To dage senere, Aspirer mediet og vask cellerne med PBS to gange. Skyl cellerne med dissociations opløsning. Inkubator i 37 °C-inkubatoren med 5% CO2 i 30 min.
- Cellerne skal forsigtigt suspenderes i 1 mM EDTA for at dissociere til enkelt celleniveau, Overfør suspensionen til et 50 mL konisk rør og centrifuger cellerne ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, og Suspender celle pillen med 300 μl magnetisk separation Buffer.
- Tilsæt 100 μL CD34+ mikroperler og forsigtigt pipet. Der inkurueres i 30 minutter ved stuetemperatur. Der kan anvendes op til 20.000.000 celler pr. 100 μL CD34+ perler.
- Filtrer suspensionen gennem en 40 μm celle Strainer.
- Adskil CD34+ cellerne ved hjælp af en magnetisk separator.
5. induktion af Endothelial til hæmatopoietisk overgang (EHT)
-
Fibronectin belægning
- Den påkrævede volumen på 5 μg/mL fibronectin-coatingopløsning forberedes ved fortynding af 1 mg/mL fibronectin i PBS.
- Der dispenseres 0,5 mL af belægnings opløsningen i hver brønd af en 24-brønd kultur plade. Pladen inkupereres ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Centrifuge den sorterede CD34+ celler ved 200 x g i 3 min. resuspender cellen pellet i 1 ml EHT medium.
- Bestem den levedygtige celletæthed med celle tælleren. Juster celletætheden til 200.000 celler mL-1 ved at tilføje EHT-medium.
- Udsug og kassér coatingopløsningen fra den fibronectin-belagte brønd. Dispenserer 0,5 mL CD34+ cellesuspension i hver fibronectin-belagt brønd.
- Inkubere i den hypoxiske inkubator i en uge.
6. flow cytometri analyse af hæmatopoietiske celler
- Flydende celle samling: Dyrkningsmediet overføres til et 15 mL konisk rør. Mediet centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten.
-
Vedklædet celle samling
- Cellerne vaskes med 0,5 mL PBS to gange.
- Skyl cellerne med dissocierende opløsning og Aspirer overskuds væsken.
- Pladen inkurueres i en 37 °C-inkubator i 5 min.
- Cellerne tilbage stoppes i 1 mL FACS-buffer.
- Bland de flydende celler og vedklædige celler.
- Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten. Resuspension i 50 μL af FACS-bufferen. Cellerne inkupereres med anti-CD34 og anti-CD45 antistoffer i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Cellerne vaskes med PBS to gange, og centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, og resuspér i 0,5 ml FACS-buffer med 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol.
- Mål CD34 og CD45 udtryk ved flow cytometer.
7. koloni danner enhed (CFU) analyse af hæmatopoietiske celler
- Hæmatopoietisk celle samling: Mediet overføres fra kulturen til et 15 mL konisk rør. Skyl forsigtigt brønden to gange med PBS.
- Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten. Opslæk i 1 mL EHT-medium. Bestem celle nummer med celle tælleren.
- Der tilsættes en suspension volumen svarende til 10.000 celler til 3 mL methylcellulose-baserede medier suppleret med antibiotika og bland godt 5 gange med en 16 G eller 18 G sprøjte.
- Dispenserer hele den methylcellulose baserede medie affjedring i hver brønd af en 6-brønd plade.
- Inkubator i 37 °C-inkubatoren med 5% CO2 i to uger, mens den holdes fugtig. Forstyr ikke skålen. Kolonier er bevægelsesfølsomme.
- Efter to uger, tælle kolonierne under et mikroskop.
Representative Results
En skematisk dannelse af PSC-kolonier er afbildet i figur 1a. PSC-sfæroider dannes på en mikro-fabrikeret plastikbeholder for en dag. Som et repræsentativt resultat, 20.000 409B2 celler kunne håndteres pr 96-brønd af mikro-fabrikeret plastic fartøj, selv om andre cellelinjer kan kræve en højere tæthed (30000-40000 celler pr 96-brønd af mikro-fabrikeret plastic fartøj). Disse kugler er spontant fladtrykt til en næsten todimensionel kultur, når belagt på en kultur skål i nærværelse af LM511-E8.
En skematisk af hemogen induktion er illustreret i figur 1b. Når PSC-kolonier vokser til en diameter på 750 μm, ændres mediet sekventielt til at inducere mesodermal organoider. De PSC kolonier vil gradvist blive en solrig side op struktur under differentiering til mesodermal organoider ved sekventiel medium forandring indtil dag 4. På dag 4 er hemogen endothelia specificeret fra mesodermal organoider ved magnetisk sortering og efterfølgende belagt på fibronectin i EHT medium. 5-10 millioner CD34+CD45- celler forventes fra sfæroider indeholdende 1.000.000 kvikskranker (figur 1c).
Det bemærkes, at cellerne morfologisk skifte fra endotel til hæmatopoietiske celler (supplerende video 1). Et repræsentativt fasekontrast billede af hæmatopoietiske stamceller efter stimulering med hæmatopoietisk cocktail på dag 7 er vist i figur 2a. Hæmatopoietiske celle kolonier dukkede op i kulturen.
Et repræsentativt flow cytometri plot er vist i figur 2b. Hele kulturen stimuleres med hæmatopoietisk cocktail og på dag 7 analyseres for udtrykket af CD34 og CD45 ved flow cytometri. Hæmatopoietiske progenitorceller udtrykker CD34 og CD45.
En CFU-analyse viste dannelsen af granulocytter/makrofag kolonier fra CD34+ CD45+ hæmatopoietiske progenitorceller (figur 2c). Det anslåede koloni nummer er 38 CFU-G/M pr. 10.000 celler (figur 2D)
Figur 1: skematisk flisebelægning af PSC-kolonier og efterfølgende hæmatopoietisk differentiering via hemogen endothelia. (A) skematisk proces med at danne PSC-kolonier. Kvikskrankerne vedligeholdes på en LM511-E8-belagt 6-brønd plade i PSC-vedligeholdelses medium. På dag-4 er cellerne løsrevet og dissocieret til enkelt celleniveau ved hjælp af dissocierende opløsning, efterfølgende belagt på mikrofabrikeret plastikbeholder i PSC-vedligeholdelses medium med Y-27632 og kultiveret natten for at danne sfæroider. På dag-3 er sfæroider belagt med PSC-vedligeholdelses medium med LM511-E8 og kultiveret i tre dage. Ved dag 0 er sfæroider spontant fladtrykt til en næsten todimensional kultur. Skala stænger = 200 μm. (B) på dag 0, mediet er erstattet med Day0 differentierings medium og kultiveret i hypoksiske inkubator. På dag 2 af differentieringen, mediet erstattes med Dag2 differentierings medium. På dag 4 af den hemogene endotelet berigelse, CD34+ celler er magnetisk sorteret og kultiveret på en fibronectin-belagt 12-brønd plade i EHT medium i 6 dage. C) repræsentativt flowcytometri plot af CD45 og CD34, der er udtryk for dag 4-celler sorteret efter CD34. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyse af hæmatopoietisk ejendom. (A) repræsentativt fasekontrast billede af hæmatopoietiske stamceller efter stimulation med hæmatopoietisk cocktail på dag 7. Skala stang = 200 μm. (B) repræsentativt flow cytometri plot af CD45 og CD34 udtryk for hele kulturen efter stimulering med hæmatopoietisk cocktail på dag 7. C) repræsentativ fasekontrast-billede af en granulocyt/macrophage-koloni, der er genereret fra dag 11 hæmatopoietiske progenitorceller. Skaleringsbar = 500 μm. (D) antal cfus pr. 10.000 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: EHT-video. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vores feeder-og Xeno-fri definerede induktions metode tilbyder en præcis og omkostningseffektiv platform til at inducere HE-celler på en skalerbar måde. Den trofaste dannelse af hemogen endotelet i konventionelle protokoller10,11,12,13,14 er blevet hæmmet af manglen på præcis kontrol af PSC koloni tæthed og størrelse, som påvirker effektiviteten af morphogen/cytokin baseret målrettet differentiering. Vi havde oplevet inkonsistens af hemogen endotelet induktion i hver uafhængig batch fra konventionelle protokoller. Den nye protokol giver mulighed for stram regulering af PSC koloni tæthed og størrelse, dermed overvinder den inkonsekvente af hemogenic endotelinduum induktion.
Vi udnyttede den uniformerede dannelse af sfæroider og overbragte efterfølgende en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand til at danne HE i alt 4 dage. Vi bekræftede ved hjælp af tre uafhængige cellelinjer, at sfæoide dannelsen forsikrer den konsekvente dannelse af HE celler. Som et repræsentativt resultat gav 409B2-celle linjerne 12,7%-23,6% CD34+ celle effektivitet baseret på tre uafhængige eksperimenter. Den kritiske faktor for Tile-sfæroider er LM511-E8. Vi anbefaler ikke at erstatte dette med andre matrix, såsom Matrigel eller fuld længde Laminin produkter i vores erfaringer. Vi oplevede, at mesodermal organoider let blev løsrevet fra Matrigel og tabte under differentierings processen. Og hverken Matrigel eller fuld-længde Laminin ikke forankre celler uden præ-belægning.
Den mulige begrænsning af denne protokol er, at vi er afhængige af PSC-vedligeholdelses mediet for at vedligeholde kvikskrankerne. Vi har testet andre medier som StemFit, men vi kompromitteret hemogenic induktion. Formentlig celler var resistente over for at forlade pluripotente tilstand i vores korte tid (4 dage) induktion protokol. Hvis man vedligeholder kvikskrankerne i andre medier, anbefaler vi at tilpasse cellerne i PSC-vedligeholdelses mediet og gennemføre et par passager før differentiering. Denne platform vil tillade systematisk manipulation og analyse af celler, og off-the-shelf produktion og storstilet induktion af hæmatopoietiske celler til potentiel klinisk brug. Et langsigtet mål med dette system er at modellere immundefekt sygdomme i humaniserede musemodeller for at undersøge de ansvarlige cellulære og molekylære mekanismer og gennemføre lægemiddel screeninger.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Alina Li og Seiko Benno for deres tekniske assistance. Vi vil også gerne takke fru Harumi Watanabe for at yde administrativ bistand og Dr. Peter Karagiannis til at redigere papiret. Dette arbejde blev støttet af Core Center for iPS Cell Research af Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling (AMED) [M.K.S.], programmet for Intractable sygdomme Research Udnytte. Sygdomsspecifikke iPS-celler af AMED (17935423) [M.K.S.] og Center for innovation-programmet for Japans videnskabs-og teknologi agentur (JST) [R.O. og M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
References
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
- Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
- Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
- Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
- Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
- Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
- Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
- Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
- Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
- Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).
