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Biochemistry

使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

改变的核酸酶活性与不同的人类条件有关，这是其作为生物标志物的潜力的基础。本文提出的模块化且易于实施的筛选方法允许选择特定的核酸探针，以利用核酸酶活性作为疾病的生物标志物。

Abstract

核酸酶是一类酶，通过催化连接核糖的磷酸键的水解来分解核酸。核酸酶在原核生物和真核生物中表现出各种重要的生理作用，从保持基因组稳定到提供对病原体的保护。改变的核酸酶活性与几种病理疾病有关，包括细菌感染和癌症。为此，核酸酶活性显示出作为特定生物标志物被开发的巨大潜力。然而，基于此活动的可靠和可重复的筛选方法仍然非常可取。

本文介绍一种利用核酸探针作为基质进行核酸活性筛选的方法，其范围是区分病理条件和健康条件。此方法提供了以迭代方式设计新的探测库的可能性，其特异性也越来越高。因此，利用化学修饰的核酸的可用性，需要进行多轮筛选，以增强特性改进探针的设计。所拟提出的技术的巨大潜力在于其灵活性、高可重复性和用于筛查与疾病条件相关的核酸酶活性的多功能性。预计这项技术将开发有前途的诊断工具，在临床上具有巨大的潜力。

Introduction

核酸酶是一类酶，能够分解形成核酸分子骨干结构的磷酸键。核酸酶的多样化使得它们的分类相当困难。然而，有一些常用的标准用于描述核酸酶，如基质偏好（脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）），裂解位点（内糖酶或外糖酶），或金属组依赖，等等1。核酸酶是高度保守的催化酶，在原核生物和真核生物中具有基本作用，并已作为基因编辑工具2使用并继续使用。他们也是DNA维护和复制的基本参与者，帮助保持基因组稳定和参与校对过程3。例如，在细菌中，核酸酶被确定为重要的毒治因素，能够通过降低宿主免疫系统4、5、6、7的功效来促进细菌生存。，8.在哺乳动物中，核酸酶被建议与凋亡9、线粒体生物生成和维持10和抗菌和抗病毒先天免疫反应的中介有关11。毫不奇怪，核酸酶活性的改变，无论是增强还是缺乏，都与广泛的人类疾病有关。这些疾病范围从多种癌症12，13到心脏肥大10或自身免疫性疾病14。因此，核酸酶已成为人类异常群体的生物标志物，成为有趣的候选物。事实上，核酸酶已经显示出其作为检测特定细菌制剂（如金黄色葡萄球菌或大肠杆菌15）引起的感染的成功诊断工具的潜力。 16.在许多癌症类型中，葡萄球菌类核酸酶领域含微糖蛋白1（SND1）核糖酸酶的表达表明预后不佳17。在胰腺癌患者中，升高的核糖核酸I（RNase I）血清水平已报告18，并提议与癌细胞表型19相关。在缺血性心脏疾病中，如心肌梗死或不稳定的心绞痛，脱氧核糖核酸I（DNase I）血清水平已被证明是有效的诊断标记20，21。

据推测，在健康和疾病状态中，核酸酶活性的全球蓝图可能有所不同。事实上，最近的报告已经利用核酸酶活性的差异来区分健康表型22或以特定物种15、23的方式识别致病性细菌感染。这些发现为利用核酸酶作为疾病的生物标志物开辟了一条新途径。因此，有必要开发一种全面的筛选方法，能够系统地查明核酸酶活动中与疾病相关的差异，这可能对开发新的诊断工具至关重要。

在此，我们介绍并描述了一种新的体外筛选方法（图1），以识别敏感和特定的探针，这种探针能够区分健康不健康中的核酸酶活性，或特定于某类细胞或细菌的活动。利用核酸的模块化，我们设计了一个初始的淬火荧光寡核苷酸探针库，该库由一套全面的不同序列和化学成分组成，都是库设计的重要参数。这些寡核苷酸探针的两侧分别有荧光团（氟辛石、FAM）和5'和3'端的环流（潮汐淬火2，TQ2）（表1）。通过使用这种基于荧光共振能量转移 （FRET） 的荧光测定来测量酶降解动力学，我们能够识别具有识别核酸酶活性差异模式的候选探针与健康或疾病状态相关。我们设计了一个迭代过程，其中基于最佳候选探测器创建新库，从而可以在后续筛选步骤中识别更具体的候选探测器。此外，这种方法利用核酸酶的催化性质来增加灵敏度。这是通过利用报告器探针的可激活性以及核酸酶持续处理基质分子的能力来实现的，这两者都代表了替代抗体或基于小分子的筛选方法的关键优势。

这种方法提供了一个高度模块化，灵活和易于实施筛选工具，用于识别能够区分健康状态和疾病状态的特定核酸探针，并为开发新的可适应未来临床应用的诊断工具。因此，这种方法用于识别从沙门氏菌（以下简称沙门氏菌）衍生的核酸酶活性，以特定鉴定这种细菌。在下面的协议中，我们报告一种使用动力学分析筛选细菌核酸酶活性的方法。

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Protocol

1. 橄榄核苷酸库的设计与准备

  1. 图书馆设计
    1. 根据以下标准设计一个8至12mer长的淬火荧光寡核苷酸探针库，以避免二次结构形成，所有探头的长度相等。
      1. 包括至少一个DNA和一个RNA随机序列，其中包含腺苷（A）、瓜宁（G）、细胞氨酸（C）和胸腺（T）/尿（U）（表1中的DNA和RNA探针的组合）。
        注：表1中描述的DNA和RNA序列作为对未知核酸酶活性（DNase或RNase）进行分类的初始基质非常有用。这两个序列被推荐作为任何筛选的起点，因为它们已经显示出在细菌和组织样本中检测核酸酶活性谱的广泛能力。如果这些DNA和RNA序列未观察到核酸酶活性，则需要设计额外的寡核苷酸。
      2. 包括由单一核苷酸组成的多核苷酸序列，以确定给定核酸酶活性的序列依赖性（DNA-Poly A、DNA-Poly T、DNA-Poly C、DNA-Poly G、RNA-Poly A、RNA-Poly U、RNA-Poly C 和RNA-Poly G）。
      3. 使用与初始DNA和RNA序列相同的核苷酸残留序列，包括含有核苷类化合物的序列，这些序列在核糖糖的2'位置（如2'-Fluoro和2'-O-甲基）具有化学修饰，作为严格的步骤增加核酸酶的选择性。
        1. 包括完全由2'-氟核苷模拟或2'-O-甲基核苷模拟（所有2'-F和所有2'-OMe，表1）组成的完全修改的序列。
        2. 包括由未经修饰的天然紫杉醇和2'-氟比米丁核苷模拟（RNA Pyr-2'F，表1）组成的嵌合序列。
        3. 包括由未经修饰的天然紫杉醇和2'-O-甲基苯丙胺核苷模拟（RNA Pyr-2'OMe，表1）组成的嵌合序列。
        4. 包括由未经修饰的天然丙胺和2'-氟尿素核苷类比（RNA Pur-2'F，表1）组成的嵌合序列。
        5. 包括由未经修饰的天然丙胺和2'-O-甲基紫杉醇核苷模拟物（RNA Pur-2'OMe，表1）组成的嵌合序列。
  2. 寡核苷酸探针制备和储存
    注：寡核苷酸由磷酰胺石法合成。合成后，使用高性能液相色谱（HPLC）纯化寡核苷酸，并通过质谱测量质量。
    1. 使用离心机将冻干寡核苷酸探针向下旋转，并在Tris-EDTA（TE）缓冲液中稀释，以防止核酸酶降解。根据每个探头的收率确定稀释体积，以呈现浓度为 500 pmol/μL 的库存溶液。
    2. 短期储存在4°C或室温下冻干寡核苷酸。对于长期储存（月到年），在-20°C储存冻干寡核苷酸。在TE中重新悬浮冻干寡核苷酸后，将库存溶液储存在-20°C，或优选在-80°C储存。

2. 细菌培养

  1. 在无菌条件下从低温储存小瓶中取一个多孔玻璃珠。
  2. 要分离单个细菌菌落（沙门氏菌和大肠杆菌），使用象限方法24，将珠子直接条纹/滚动到含有试皮大豆Agar（TSA）介质的培养皿上，并辅以脱脂羊血。
  3. 在37°C孵育培养24小时。

3. 超上准备

  1. 将单个菌落从固体介质转移到 50 mL 试皮大豆汤 （TSB），并在 37°C 下在 200 rpm 下孵育 24 小时。
  2. 稀释TSB（亚培养）中的培养（1：500），在37°C下在摇动的培养箱中以200rpm孵育24小时。
    注：预计24小时后，细菌培养物处于静止相位，达到高于109 CFU/mL的值。
  3. 潜伏期后，将培养物转移到盖上无菌管和离心机4，500 x g30分钟。
  4. 收集上清液并立即使用。或者，将上生物储存在4°C或-20°C。

4. 核酸酶活性测定

  1. 工作解决方案的准备
    1. 通过稀释（1：10 比）库存溶液（500 pmol/μL），为1.5 mL无核酸微离心管中的每个探头制备20 μL工作溶液，最终工作浓度为50 pmol/μL。为此，将含有MgCl2和CaCl2的18 μL磷酸盐缓冲液盐碱（PBS）与2μL探针剂溶液混合。
      注：请注意，在工作溶液中，寡核苷酸更容易受到核酸酶降解的影响，因此，建议在设置反应之前准备工作溶液。
    2. 在制备过程中避免直接接触，并在处理荧光管时保持黑暗（用箔纸包裹）。
  2. 反应设置
    1. 将荧光计预热（例如，环流 1）至 37°C。
    2. 为每个样品（TSB、大肠杆菌和沙门氏菌）制备一套（一管/探针）的1.5 mL无核酸酶微离心管，并贴上相应的标签。
    3. 小心地加入96 μL的TSB无菌培养培养物、沙门氏菌上清液或大肠杆菌上清液（从步骤3.4中）。随后，相应地添加4 μL/管探头工作溶液。在室温下执行此步骤。
      注：第一轮筛选使用了10个探头，第二轮使用了6个探头。
    4. 通过上下移液彻底混合，获得均匀的溶液。混合时避免将气泡引入样品中。
    5. 将每个溶液（探针 + 上清或培养层）的 95 μL 加载到黑色底部、未经处理的 96 孔板的单独孔中。装载时，通过小心地分配靠近井壁的尖端，尽量减少井中气泡的形成。
    6. 用盖子盖住盘子。目视检查盖子并检查笔标记或灰尘颗粒堆积，这些标记或灰尘颗粒堆积可能引入测量伪影。如果是这种情况，请更换新盖的盖子。
  3. 测量设置
    1. 单击软件快捷方式图标 （图 S1A） 打开获取软件 （Gen5 3.05）。
    2. 选择"立即从任务管理器"窗口中阅读，然后选择"新建..."以创建动力学测量协议 （图 S1B）。
    3. 单击标题为"过程"的对话框窗口中的"设置温度"，然后选择 37 °C。按"确定"（图 S1C）确认并保存设置。
    4. 单击标题为"过程"的对话框窗口中的"开始动力学"。然后在名为"动能步骤"的弹出式对话框窗口中，在"运行时"输入框中选择 2 小时，在"间隔输入"框中选择 2 分钟。按"确定"（图 S1D）确认并保存设置。
    5. 单击标题为"过程"的"阅读"。然后在名为"读取方法"的弹出式对话框窗口中，选择荧光强度作为检测方法，将端点/动力学作为读取类型，将滤波器作为光学类型。按"确定"（图 S1E）确认并保存设置。
    6. 在标题为"读取步骤（动能）"的弹出式对话框窗口中，从"筛选器集"中选择"绿色"。按"确定"（图 S2A）确认并保存设置。
    7. 在标题为"过程"的对话框窗口中，选择"使用盖子"并单击"验证"以确保创建的协议有效。这由一个弹出窗口（图S2B）确认。
    8. 在菜单栏中选择协议并选择过程（图 S2C）。
    9. 在标题为"过程"的对话框窗口中，定义要测量的井 （图 S2D）。
    10. 在文件名输入框中输入实验名称 （图 S2E）。
    11. 将带盖子的板装入板式读卡器中。确保板的方向正确。
    12. 单击工具栏中的"读取新按钮"（图 S2F）开始获取。
  4. 数据分析
    1. 单击对话框窗口中标题为"板 1"（图 S3A）中的测量井之一。
    2. 单击选择井，并在"井选择"对话框窗口中包括所有测量的井。请按"确定"确认并保存设置。（图 S3B）
    3. 在标题为"板 1"的对话框窗口中选择数据以可视化表格结果（图 S3C）。
    4. 通过从上下文菜单中选择快速导出将数据导出到跨页表 （图 S3C）。
    5. 在页散工作表中，为每个样本和探测标记相应的数据列。
    6. 通过绘制相对荧光单位 （RFU） 与时间（x 轴：反应的时间线和 y 轴：RfUs），使用具有标记样式的线生成动力学图。
      注： 使用电子表格程序（例如 Excel）时，生成图形的说明适用。但是，任何其他程序都可用于通过绘制 RFU 与时间之间的原始数据生成图形。
    7. 根据以下公式25计算每个测量间隔的酶反应速率：速率*，Equation 1其中If在最大间隔时间点为 RFU，Ii 在最小间隔时间点为 RFU，Tf 和Ti分别是最大和最小间隔时间点。
    8. 为每个曲线选择具有最高值 （R最大值） 的速率。如果每个样本有多个 R最大值，请选择在最早测量时间点发生的 R 最大值。
    9. 计算 R最大值与发生 R最大值的时间间隔的平均值之间的比率：速率系数 |Equation 2
    10. 计算每个探针的沙门氏菌和大肠杆菌的速率系数之间的折差 （FD）。
    11. 将高于 3 的折差值视为显著值。
    12. 将具有最高折叠差值 （FD） 的重要探头作为候选探头，并作为下一轮筛选中库设计的基础。

5. 筛选轮选择标准 （图 1）

  1. 第一轮筛选
    1. 使用DNA、RNA和多核苷酸探针进行核酸酶活性测定（如第4节所述）。
    2. 通过比较DNA和RNA候选探针的数量和性能（FD值），评估DNA化学或RNA化学的偏好。
    3. 选择核酸化学的类型，呈现最多的候选探针，如图1所示。
  2. 第二轮筛选
    1. 使用完全修饰的探针和嵌合探针，根据第一轮筛选中选定的核酸基板设计，执行核酸活性测定（如第 4 节所述）。
    2. 通过比较2'-Fluoro和2'-O-甲基改性候选探针获得的结果，评估对含有2'-Fluoro和2'-O-甲基核苷类比的序列的偏好。
    3. 选择核苷模拟修改的类型，呈现数量最多的候选探头，如图1所示。

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Representative Results

图 1显示了此方法的工作流程，该方法分为两个筛选轮。在第一轮筛选中，我们使用5个DNA探针（DNA、DNA聚A、DNA聚A、DNA聚子和DNA聚氨酯）和5个RNA探针（RNA、RNA聚A、RNA聚Dna聚氨酯和RNA聚氨酯）。本筛选轮的原始数据可在补充表 1 中找到。在第二轮中，通过用化学修饰的核苷（所有2'-Fluoro和所有2'-O甲基）替换RNA序列，或者结合RNA和纯化或化学修饰的紫杉醇（RNA Pyr-2'F，RNA）来合成化学修饰的探针Pyr-2'OMe、RNA Pur-2'F 和 RNA Pur-2'OMe）。本筛选轮的原始数据可在补充表 2 中找到。有关序列的详细说明，请参阅表 1。第一轮筛选的结果如图2所示，其中沙门氏菌培养超生物报告明显倾向于RNA探针，而不是DNA探针。相比之下，大肠杆菌和培养培养控制显示降解RNA探针的能力非常有限。此外，我们计算了沙门氏菌和大肠杆菌的速率系数（补充表3和补充表4）之间的折差（FD），以确定性能最佳的探针。计算执行如下，如协议部分所述。

这些结果表明，存在一种从沙门氏菌衍生的RNase类型的活性。基于将RNA识别为沙门氏菌核酸酶的首选核酸类型，我们设计了一个新的库，使用化学修饰的核苷酸，用于第二轮筛选，旨在提高探针。图3显示了含有化学修饰核苷酸的探针的动力学轮廓。有趣的是，RNA Pyr-2'OMe 和 RNA Pur-2'OMe 分别与 RNA Pyr-2'F 和 RNA Pur-2'F 相比表现出最佳的动力学行为。

这些结果表明，沙门氏菌具有重要的RNase活性，可用于选择能够专门识别这种细菌的探针。此外，我们观察到2'-OMe化学修饰的核苷更适合沙门氏菌分泌的RNA类。考虑到这一点，本贡献中描述的协议提供了探索利用核酸酶活性作为生物标志物的可能性。

Figure 1
图1：细菌培养和筛选过程的工作流程。培养菌和超生物的准备（左）。两个筛选回合的工作流说明。首次筛选：使用10个探针评估DNA或RNA的偏好。第二次筛选：根据核酸偏好，对含有化学修饰核苷酸的其他探针进行评估，以确定给定核酸酶活性的最佳性能基质。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：第一个动力学筛选轮。使用DNA和RNA探针的沙门氏菌、大肠杆菌和培养培养（TSB）的动力学图谱。核酸酶活性由相对荧光单位（RFU）表示。这些图表至少代表 3 个单独执行的实验。不同的样本标注如下图例所示。使用每个探针的沙门氏菌和大肠杆菌的速率系数计算折叠差 （FD） 值。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：第二轮动力学筛选。使用化学改性探针的沙门氏菌、大肠杆菌和培养培养（TSB）的动力学特征。核酸酶活性由相对荧光单位（RFU）表示。这些图表至少代表 3 个单独执行的实验。不同的样本标注如下图例所示。使用每个探针的沙门氏菌和大肠杆菌的速率系数计算折叠差 （FD） 值。请点击此处查看此图的较大版本。

Table 1
表1：核酸探针序列。本研究中使用的所有核酸探针的列表。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 1
补充图1：测量设置。按钮单击和对话框窗口，描述在采集软件中执行的逐步过程，以设置不同的测量参数。（A） 桌面图标.（B） 任务管理器对话框窗口。（C） 过程和温度 设置对话框窗口。（D） 过程和动能步骤对话框窗口。（E） 过程和读取方法对话框窗口。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 2
补充图2：测量设置。按钮单击和对话框窗口，描述在采集软件中执行的逐步过程，以设置不同的测量参数。（A） 过程和读取步骤 （动能） 对话框窗口.（B） 过程对话框窗口 （C） "协议"菜单栏.（D） 井选择对话框窗口.（E） 文件名输入框。（F） 运行用于在软件内开始采集的新图标。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 3
补充图3：数据分析。按钮单击和对话框窗口，描述在采集软件中执行的逐步过程，将获取的数据导出到页散页中，以便进一步分析。（A） 板矩阵对话框窗口.（B） 板和井选择对话框窗口。（C） 板对话框窗口和快速导出上下文菜单。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 4
补充图4：第三轮筛选（序列首选项优化）。描述旨在评估序列变异的附加筛选轮中涉及的不同步骤。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 5
补充图5：第四轮筛选（特异性评价一轮）。描述旨在增加特异性的附加筛选轮中涉及的不同步骤。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 6
补充图6：第五筛选轮（反应参数优化）。描述通过调节核酸酶活性减少非目标交叉反应的额外筛选轮中涉及的不同步骤。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Table 1
补充表1：第一轮筛选的原始数据。对于每个探针（在顶部标有红色标记），TSB、大肠杆菌和沙门氏菌的采集时间和原始荧光值以及每个间隔的计算速率值都进行了报告。计算方式如下：方法部分所述。请点击此处下载此文件。

Supplementary Table 2
补充表2：第二轮筛选的原始数据。对于每个探针（在顶部标有红色标记），TSB、大肠杆菌和沙门氏菌的采集时间和原始荧光值以及每个间隔的计算速率值都进行了报告。计算方式如下：方法部分所述。请点击此处下载此文件。

Supplementary Table 3
补充表3：第一轮筛选的数据分析。对于每个探头（顶部标有红色），为 TSB、大肠杆菌和沙门氏菌获取以下值：最大值值、最小和最大间隔时间点、速率系数、沙门氏菌之间的折叠差值大肠杆菌在TSB上，并折叠沙门氏菌和大肠杆菌之间的负值（以黄色突出显示）。计算方法部分所述，计算公式和分步计算显示在电子表格中。请点击此处下载此文件。

Supplementary Table 4
补充表4：第二轮筛选的数据分析。对于每个探头（顶部标有红色），为 TSB、大肠杆菌和沙门氏菌获取以下值：最大值值、最小和最大间隔时间点、速率系数、沙门氏菌之间的折叠差值大肠杆菌在TSB上，并折叠沙门氏菌和大肠杆菌之间的负值（以黄色突出显示）。计算方法部分所述，计算公式和分步计算显示在电子表格中。请点击此处下载此文件。

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Discussion

核酸酶活性的改变与各种各样的疾病表型有关，包括不同类型的癌症和细菌感染。这些改变被建议为一个条件14的致病剂，而在其他情况下，它们是有害生理事件20或致病剂16，26的结果。毫不奇怪，使用核酸酶和核酸酶活性作为诊断生物标志物的尝试被描述为15，22，23，26，具有相当大的前景。因此，建立一种有力和可重复的筛查方法，以便系统地评估疾病中的核酸酶活性，并查明具体和敏感的记者。为了满足这一需求，我们开发了一个基于荧光测定的坚固、模块化且易于实施的筛选平台，允许发现新的疾病生物标志物，并在并行，使用核酸酶的催化作用。

强大的筛选工具，如小分子高通量筛选（HTS）27，通过指数富集（SELEX）28或噬菌体显示29系统进化配体，这允许高亲和力识别分子（例如，小分子、贴合剂或结合肽）的识别。相比之下，此处介绍的筛选方法允许选择能够识别已知和未知核酸酶活性的探针。此外，这种方法与体外、体外和体内筛选模型兼容。此外，与上述方法不同，核酸酶的反应性具有明显的优势，因为探针-核酸酶相互作用不是静态的，而是动态的过程。这意味着核酸酶的活动成为报告器探测器的内在信号放大模块，因为多个报告器探头可以与单个核酸酶进行交互。

与任何其他筛选方法一样，初始库的生成和管理至关重要。核酸探针的性质为库的设计和创建提供了极大的灵活性，并允许根据筛选应用引入不同程度的复杂性。库复杂度可引入不同层次，包括序列图案、核苷酸化学、磷酸盐骨干化学和寡核苷酸长度。调节库的复杂性，不仅可以识别探针，不仅因为探头能够成功识别与疾病相关的核酸酶活性，还可用于与后续体内应用兼容的属性。此外，核酸碱库比其抗体或肽库具有若干优点。一方面，抗体生产众所周知是繁琐的，需要动物或复杂的真核培养系统，这会增加成本，并引入批次变异30，31。此外，高分子量和免疫原性限制了其应用28，32。另一方面，生物肽库的生成通常需要病毒或细菌表达系统29，30，增加了筛选过程的复杂性。化学肽库避免了这个问题，代价是使用复杂的珠基系统或多轮昂贵的肽合成33。所有这些问题都是通过使用核酸库来规避的。建立初始库后，筛选方法快速而简单。本文所述方法用作其他筛选轮的平台，例如序列优化（补充图 4）、特异性评估（补充图 5）或调制元素的优化。核酸酶活性，如金属辅料（通常为二价阳离子）和包合子，它们对于增加所选探针的特异性非常有用（补充图6）。

本研究中使用的动力学荧光测定可以针对细菌和细胞培养物进行优化，在用户友好的微ititer板中进行筛选。在细胞测定的情况下，该方案既与悬浮培养，又与单层培养物兼容，优化后，可根据所研究的体外模型的需要使用。我们已经确定了在筛查之前需要优化的几个关键步骤。其中包括要测定的细胞数或细菌密度、探针浓度、荧光计检测器增益设置或内置背景校正方法的实施。该技术的一个局限性是需要改变与感兴趣的病理条件相关的核酸酶活性。如果没有此功能，选择候选探针的筛选方法就不可行。另一个限制是关宁在接近荧光时的自我淬火能力。在设计库时需要考虑此特性。

被测量的反应的酶性质使得有必要考虑板的加载时间。最小化加载时间将减少不同实验条件之间的背景差异。有几个选项可以克服这个问题，例如使用冰冷的试剂或使用自动装载系统减缓装载过程中的酶反应，尽管后者大大增加了成本，但也增加了吞吐量。此外，动力学测量比静态测量有了很大的改进，为核酸酶催化活性的动态提供了完整和更真实的图像。

总之，我们的协议提供了一种多功能、坚固且可重复的筛选方法，用于识别敏感和特定的核酸探针，用于检测与疾病相关的核酸酶活性，从而克服了替代筛选方法。我们预计，这种筛查技术将允许开发多种条件下的新型诊断工具，便于临床翻译。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢路易莎·埃尔南德斯（林克平大学）对手稿的认真修订和宝贵建议。这项工作得到了克努特和爱丽丝·沃伦贝格基金会以及瑞典政府战略研究区在林雪平大学高级功能材料材料战略研究区的支持（学院授予SFO-Mat-LiU No.2009-00971）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选
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