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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

A atividade de nuclease alterada tem sido associada a diferentes condições humanas, subjacentes ao seu potencial como biomarcador. A metodologia modular e fácil de implementar a triagem apresentada neste artigo permite a seleção de sondas de ácido nucleico específico para aproveitar a atividade de nuclease como biomarcador da doença.

Abstract

Nucleases são uma classe de enzimas que quebram os ácidos nucleicos catalisando a hidrólise das ligações de fosfosfosterqueques que ligam os açúcares ribose. Nucleases apresentam uma variedade de papéis fisiológicos vitais em organismos procarióticos e eucarióticos, que vão desde a manutenção da estabilidade do genoma até o fornecimento de proteção contra patógenos. A atividade de nuclease alterada tem sido associada a várias condições patológicas, incluindo infecções bacterianas e câncer. Para este fim, a atividade nuclease tem mostrado grande potencial para ser explorada como um biomarcador específico. No entanto, um método de triagem robusto e reproduzível baseado nessa atividade permanece altamente desejável.

Aqui, introduzimos um método que permite o rastreamento para a atividade nuclease usando sondas de ácido nucleico como substratos, com o escopo de diferenciação entre condições patológicas e saudáveis. Este método oferece a possibilidade de projetar bibliotecas novas da ponta de prova, com especificidade crescente, em uma maneira iterativa. Assim, várias rodadas de triagem são necessárias para refinar o design das sondas com características aprimoradas, aproveitando a disponibilidade de ácidos nucleicos quimicamente modificados. O potencial considerável da tecnologia proposta reside na sua flexibilidade, alta reprodutibilidade e versatilidade para o rastreamento da atividade de nuclease associada às condições da doença. Espera-se que esta tecnologia permita o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico promissoras com um grande potencial na clínica.

Introduction

Nucleases são uma classe de enzimas capazes de clivagem as ligações fosfosfosfosterques que formam a estrutura espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico. A vasta diversidade de nucleases torna a sua classificação bastante difícil. No entanto, existem alguns critérios comuns utilizados para descrever nucleases, como preferência por substrato (ácido desoxiribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA)), local de clivagem (endonucleases ou exonucleases), ou dependência de ions metálico, entre outros1. Nucleases são enzimas catalíticas altamente conservadas que têm papéis fundamentais em ambos, organismos procarióticos e eucarióticos e têm sido usadas, e continuam a ser usadas, como ferramentas de edição de genes2. Eles também são atores fundamentais na manutenção e replicação do DNA, ajudando a manter a estabilidade do genoma e participando de processos de leitura de prova3. Em bactérias, por exemplo, nucleases foram identificados como importantes fatores de virulência, capazes de promover a sobrevivência bacteriana, reduzindo a eficácia do sistema imunológico do hospedeiro4,5,6,7 8. Em mamíferos, nucleases têm sido sugeridos para ser implicado em apoptose9, biogênese mitocondrial e manutenção10 e mediação de antibacteriano e antiviral respostas imunes inatas11. Não surpreendentemente, as alterações de atividade nuclease, seja aprimoramento ou falta de, têm sido implicadas em uma ampla gama de doenças humanas. Estas doenças variam de uma grande variedade de cânceres12,13 a hipertrofia cardíaca10 ou doenças auto-imunes14. Portanto, nucleases tornaram-se candidatos interessantes como biomarcadores para um grupo heterogêneo de condições humanas. Na verdade, nucleases já mostraram seu potencial como ferramentas de diagnóstico bem-sucedidas para a detecção de infecções causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus ou Escherichia coli15, 16.Em muitos tipos de câncer, a expressão da proteína 1 (SND1) contendo domínio estaphylocóco sede é indicativa de mau prognóstico17. Em pacientes com câncer de pâncreas, níveis elevados de ribeirinhoI (RNase I) foram relatados18 e propostos para serem associados a fenótipos de células cancerosas19. Em doenças cardíacas isquêmicas, como infarto do miocárdio ou angina pectoris instáveis, os níveis de soro de desoxiribonuclease I (DNase I) mostraram-se um marcador diagnóstico válido20,21.

Tem sido a hipótese de que o modelo global de atividade nuclease pode ser diferente em estados saudáveis e doenças. Na verdade, relatórios recentes têm usado diferenças na atividade nuclease para distinguir entre fenótipos saudáveis e cancerosos22 ou para identificar infecções bacterianas patogênicas de uma forma específica da espécie15,23. Esses achados abriram um novo caminho para o uso de nucleases como biomarcadores da doença. Portanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de um método abrangente de rastreamento capaz de identificar sistematicamente as diferenças associadas à doença na atividade nuclease, o que pode ser de importância fundamental no desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico.

Aqui, introduzimos e descrevemos uma nova abordagem de rastreamento in vitro (Figura 1) para identificar sondas sensíveis e específicas capazes de discriminar entre a atividade nuclease em saudável e insalubre, ou atividade específica para um tipo de célula ou bactéria. Aproveitando a modularidade dos ácidos nucleicos, projetamos uma biblioteca inicial de sondas oligonucleotídeas fluorescentes saciadas que consistem em um conjunto abrangente de diferentes sequências e químicas, ambos sendo parâmetros importantes para o projeto da biblioteca. Estas sondas oligonucleotide são ladeadas por um fluorofóbico (fluorescein amidita, FAM) e um quencher (maré quencher 2, TQ2) nas extremidades 5' e 3', respectivamente (Tabela 1). Ao utilizar este ensaio fluorométrico à base de ressonância fluorescente (FRET) para medir a cinética da degradação enzimática, conseguimos identificar sondas candidatas com potencial para discriminar padrões diferenciais de atividade nuclease estados saudáveis ou de doença. Nós projetamos um processo iterativo, no qual novas bibliotecas são criadas com base nas melhores sondas de candidatos, que permite a identificação de sondas candidatas cada vez mais específicas em etapas de triagem subsequentes. Além disso, essa abordagem aproveita a natureza catalítica dos nucleases para aumentar a sensibilidade. Isto é conseguido aproveitando-se da natureza activatable das pontas de prova do repórter e da habilidade dos nucleases de processar continuamente moléculas substratos, representando vantagens chaves sobre o anticorpo alternativo ou métodos de seleção molécula-baseados pequenos.

Esta abordagem oferece uma ferramenta de triagem altamente modular, flexível e fácil de implementar para a identificação de sondas de ácido nucleico específico capazes de discriminar entre estados saudáveis e de doença, e uma excelente plataforma para o desenvolvimento de novos estados de ácido nucleico capazes de discriminar entre estados saudáveis e de doença, e uma excelente plataforma para o desenvolvimento de novos ferramentas de diagnóstico que podem ser adaptadas para futuras aplicações clínicas. Como tal, esta abordagem foi usada para identificar a atividade nuclease derivada de Salmonella Typhimurium (aqui referido como Salmonella)para a identificação específica desta bactéria. No protocolo a seguir, relatamos um método para rastrear a atividade de nuclease bacteriana usando análise cinética.

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Protocol

1. Projeto e preparação da biblioteca de Oligonucleotide

  1. Projeto da biblioteca
    1. Com base nos seguintes critérios de projetar uma biblioteca de sondas oligonucleotídeas fluorescentes saciadas entre 8 e 12 mers de comprimento para evitar a formação da estrutura secundária, com comprimento igual para todas as sondas.
      1. Inclua pelo menos um DNA e uma sequência aleatória de RNA contendo uma combinação de adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T)/uracil (U) (sondas de DNA e RNA na Tabela 1).
        NOTA: As sequências de DNA e RNA descritas na Tabela 1 têm sido úteis como os substratos iniciais para classificar um tipo desconhecido de atividade nuclease, tanto dnase ou rnase. Estas duas seqüências são recomendadas como o ponto de partida para qualquer triagem, pois eles mostraram uma ampla capacidade para detectar perfis de atividade de nuclease em bactérias e amostras de tecido. Se a atividade nuclease não é observada com essas seqüências de DNA e RNA, o design de oligonucleotídeos adicionais é necessário.
      2. Inclua sequências de polinucleotídeos que consistem em um único tipo de nucleotídeo para determinar a dependência da sequência de uma determinada atividade nuclease (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C e RNA-Poly G na Tabela 1).
      3. Usando a mesma seqüência de resíduos de nucleotídeos como as sequências iniciais de DNA e RNA, incluem sequências que contêm análogos nucleosídeos que abrigam modificações químicas na posição 2 do açúcar ribose, como 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl, como um passo rigoroso para aumentar a seletividade das nucleases.
        1. Inclua sequências totalmente modificadas que consistem inteiramente de análogos de nucleosídeo fluoro 2 ou análogos de nucleosídeo 2'-O-Methyl (Todos 2'-F e All 2'-OMe, Tabela 1)
        2. Inclua sequências quiméricas compostas por purinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de pirimidina 2'-Fluoro (RNA Pyr-2'F, Tabela 1).
        3. Inclua sequências quiméricas compostas por purinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de pirimidina 2'-O-Methyl (RNA Pyr-2'OMe, Tabela 1).
        4. Inclua sequências quiméricas compostas por pirimidinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de puroside 2'-Fluoro (RNA Pur-2'F, Tabela 1).
        5. Inclua sequências quiméricas compostas por pirimidinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de puré de 2'-O-Metil (RNA Pur-2'OMe, Tabela 1).
  2. Preparação e armazenamento da ponta de prova do Oligonucleotide
    NOTA: Oligonucleotides são sintetizados pelo método de fostempomidite. Após a síntese, os oligonucleotídeos são purificados usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e a massa é medida pela espectrometria de massa.
    1. Desça as sondas oligonucleotídeas liofilizadas usando uma centrífuga e diluí-las no tampão Tris-EDTA (TE) para evitar a degradação da nuclease. Determine o volume de diluição de acordo com o rendimento de cada sonda para tornar uma solução de estoque com uma concentração de 500 pmol/μL.
    2. Armazenar oligonucleotídeos liofilizados a 4 °C ou temperatura ambiente por um curto prazo. Para armazenamento a longo prazo (meses a anos), armazenar oligonucleotídeos liofilizados em -20 °C. Após a resuspensão de oligonucleotídeos liofilizados na TE, guarde as soluções de ações a -20 °C ou, de preferência, a -80 °C.

2. Cultura bacteriana

  1. Pegue uma conta de vidro porosa do frasco de armazenamento criogênico em condições estéreis.
  2. Para isolar colônias bacterianas individuais(Salmonella e E. coli), use o métodoquadrante 24 por estrias / rolando a conta diretamente em uma placa de Petri contendo Tryptic Soy Agar (TSA) médio complementado com ovelhas defibrinadas Sangue.
  3. Incubar a cultura a 37 °C por 24 h.

3. Preparação supernatant

  1. Transfira uma única colônia de mídia sólida para 50 mL Caldo de soja tripética (TSB) e incubar a 37 °C por 24 h a 200 rpm.
  2. Diluir a cultura (1:500) no TSB (subcultura) e incubar a 37 °C por 24 h a 200 rpm em uma incubadora tremer.
    NOTA: Espera-se que após 24 h de incubação as culturas bacterianas estão em fase estacionária atingindo valores superiores a 109 CFU/mL.
  3. Após o período de incubação, transfira as culturas para tubos estéreis e centrífugas limitados a 4.500 x g por 30 min.
  4. Recolher o supernatant e usá-lo imediatamente. Alternativamente, guarde as supernatantes a 4 °C ou -20 °C.

4. Ensaio de Atividade de Nuclease

  1. Preparação de soluções de trabalho
    1. Prepare uma solução de trabalho de 20 μL para cada sonda em tubos de microcentrífuga livre de nuclease de 1,5 mL diluindo (proporção de 1:10) a solução de estoque (500 pmol/μL) para uma concentração de trabalho final de 50 pmol/μL. Para esse efeito, misture 18 μL de Phosphate Buffer Saline (PBS) contendo MgCl2 e CaCl2 com 2 μL de solução de estoque de sonda.
      NOTA: Esteja ciente de que na solução de trabalho, os oligonucleotídeos são mais vulneráveis à degradação do nuclease, portanto, recomenda-se preparar as soluções de trabalho pouco antes de configurar a reação.
    2. Evite o contato direto de luz durante a preparação e mantenha no escuro (envolto em papel alumínio), ao lidar com fluorofóbicos.
  2. Reação configurada
    1. Pré-aqueça o flódromo (por exemplo, Cytation 1) a 37 °C.
    2. Prepare um conjunto (um tubo/sonda) de tubos de microcentrífuga sem nuclease de 1,5 mL para cada amostra (TSB, E. coli e Salmonella)e rotule em conformidade.
    3. Adicione cuidadosamente 96 μL de mídia de cultura estéril TSB, Salmonella supernatant ou Supernatant E. coli (a partir da etapa 3.4.). Posteriormente, adicione 4 μL/tubo de solução de trabalho de sonda em conformidade. Executar este passo à temperatura ambiente.
      NOTA: 10 sondas foram usadas para a primeira rodada da triagem e 6 sondas para a segunda rodada.
    4. Misture bem por pipetting cima e para baixo para obter uma solução homogênea. Evite introduzir bolhas de ar nas amostras durante a mistura.
    5. Carregue 95 μL de cada solução (sonda + mídia de supernatant ou cultura) em um poço separado de uma placa de 96 poços de fundo preto e não tratada. Minimize a formação de bolhas nos poços ao carregar, dispensando cuidadosamente a ponta próxima à parede do poço.
    6. Cubra a placa com a tampa. Inspecione visualmente a tampa e verifique se há marcas de caneta ou acúmulo de partículas de poeira que podem introduzir artefatos de medição. Substitua a tampa para um novo se aquele for o caso.
  3. Medida configurada
    1. Abra o software de aquisição (Gen5 3.05) clicando no ícone do atalho do software(Figura S1A).
    2. Selecione Leia Agora a partir da janela do gerenciador de tarefas e escolha Novo... para criar o protocolo de medição cinética(Figura S1B).
    3. Clique no Set Temperature na janela de diálogo intitulada Procedimento e selecione 37 °C. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S1C).
    4. Clique no Iniciar a Cinética na janela de diálogo intitulada Procedimento. Em seguida, na janela de diálogo pop-up, intitulado Kinetic Step, selecione 2 h na caixa de entrada Run Time e 2 min na caixa de entrada Interval. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S1D).
    5. Clique em Ler na janela de diálogo intitulada Procedimento. Em seguida, na janela de diálogo pop-up, intitulado Método de Leitura, selecione Fluorescência Intensidade como um método de detecção, Endpoint / Cinética como um tipo de leitura e filtros como tipo de óptica. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S1E).
    6. Na janela de diálogo pop-up intitulada Read Step (Cinética),selecione Green do Conjunto de Filtros. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S2A).
    7. Na janela de diálogo intitulada Procedimento,selecione a tampa de uso e clique na validação para garantir que o protocolo criado seja válido. Isto é confirmado por uma janela de diálogo pop-up(Figura S2B).
    8. Selecione o protocolo na barra do menu e escolha o procedimento (Figura S2C).
    9. Na janela de diálogo intitulada Procedimento,defina os poços a serem medidos(Figura S2D).
    10. Digite o nome do experimento na caixa de entrada de nome de arquivo(Figura S2E).
    11. Carregue a placa com sua tampa no leitor da placa. Certifique-se de que a placa está na orientação certa.
    12. Comece a aquisição clicando leia novo botão na barra de ferramentas(Figura S2F).
  4. Análise de dados
    1. Clique em um dos poços medidos na janela de diálogo intitulado Placa 1 (Figura S3A).
    2. Clique em poços selecionados e inclua todos os poços medidos na janela de diálogo de seleção de poços. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK. (Figura S3B).
    3. Selecione dados na janela de diálogo intitulada Placa 1 para visualizar os resultados tabulados(Figura S3C).
    4. Exportar os dados para uma folha de spread, selecionando a exportação rápida do menu de contexto(Figura S3C).
    5. Na folha de spread, rotule as colunas de dados em conformidade para cada amostra e sonda.
    6. Gerar gráficos cinéticos, usando linha com estilo de marcadores, traçando unidades relativas de fluorescência (RFU) versus tempo (x-eixo: cronograma da reação e eixo y: RFUs).
      NOTA: A descrição da geração de um gráfico é aplicável ao usar programas de planilha (por exemplo, Excel). No entanto, quaisquer outros programas podem ser usados para gerar gráficos a partir dos dados brutos obtidos, traçando RFU versus tempo.
    7. Calcule a taxa da reação enzimática para cada intervalo medido Equation 1 de acordo com a seguinte fórmula25:taxa = , onde se é RFU no ponto de tempo máximo do intervalo e ii é RFU no ponto de tempo mínimo do intervalo, e Tf e Ti são os pontos de tempo máximos e mínimos do intervalo, respectivamente.
    8. Selecione a taxa com o maior valor (Rmax)para cada curva. Se houver mais de um Rmax por amostra, selecione aquele que ocorre no primeiro ponto de tempo de medição.
    9. Calcule a razão entre Rmax e o valor médio do intervalo de tempo em que ocorre Rmax: coeficiente de taxa =Equation 2
    10. Calcule a diferença de dobra (FD) entre o coeficiente de taxa de Salmonella e E. coli para cada sonda.
    11. Considere um valor de diferença de dobra superior a 3 como significativo.
    12. Considere as sondas significativas com os valores de diferença de dobra mais altas (FD) como sondas candidatas e como base para o projeto da biblioteca na próxima rodada de triagem.

5. Critérios de seleção das rodadas de triagem (Figura 1)

  1. Primeira rodada de triagem
    1. Realize o ensaio de atividade nuclease (conforme descrito na seção 4) usando sondas de DNA, RNA e polinucleotídeos.
    2. Avalie a preferência pela química do DNA ou química do RNA comparando o número e o desempenho (valor do FD) das sondas candidatas ao DNA e ao RNA.
    3. Selecione o tipo de química do ácido nucleico tornando o maior número de sondas candidatas, como ilustrado na Figura 1.
  2. Segunda rodada de triagem
    1. Realize o ensaio de atividade nuclease (conforme descrito na seção 4) usando sondas totalmente modificadas e sondas quiméricas projetadas com base no substrato de ácido nucleico selecionado na primeira rodada de triagem.
    2. Avalie a preferência por sequências contendo análogos de nucleosídeo 2'-O-Metil, comparando os resultados obtidos para sondas candidatas modificadas 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl.
    3. Selecione o tipo de modificação analógica nucleosídea tornando o maior número de sondas candidatas, como ilustrado na Figura 1.

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Representative Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho dessa metodologia, que é dividida em duas rodadas de triagem. Na primeira rodada de triagem, usamos 5 sondas de DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C e DNA Poly G) e também 5 sondas de RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly RNA Poly C e RNA Poly G). Os dados brutos desta rodada de triagem podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1. Na segunda rodada, sondas quimicamente modificadas foram sintetizadas substituindo a sequência de RNA por nucleosídeos quimicamente modificados (Todos 2'-Fluoro e All 2'-OMethyl) ou pela combinação de RNA e purinas ou pirimidinas quimicamente modificados (RNA Pyr-2'F, RNA Pyr-2'OMe, RNA Pur-2'F e RNA Pur-2'OMe). Os dados brutos desta rodada de triagem podem ser encontrados na Tabela Suplementar 2. Uma descrição detalhada das sequências pode ser encontrada na Tabela 1. Os resultados obtidos a partir da primeira rodada de triagem são mostrados na Figura 2, onde supernatants cultura Salmonella relatam uma clara preferência por sondas de RNA sobre sondas de DNA. Em contraste, E. coli e controles de mídia de cultura mostram capacidade muito limitada para degradar sondas de RNA. Além disso, calculamos a diferença de dobra (FD) entre os coeficientes de taxa de Salmonella e E.coli (Tabela Suplementar 3 e Tabela Complementar 4),a fim de identificar as sondas com melhor desempenho. Os cálculos foram realizados conforme descrito na seção protocolar.

Estes resultados sugerem a presença de um tipo de atividade RNase derivada de Salmonella. Com base na identificação do RNA como o tipo de ácido nucleico preferido para nucleases de Salmonella, projetamos uma nova biblioteca usando nucleotídeos quimicamente modificados para ser usado na segunda rodada de triagem destinada a aumentar a especificidade do Sondas. A figura 3 mostra os perfis cinéticos das sondas contendo nucleotídeos quimicamente modificados. Curiosamente, RNA Pyr-2'OMe e RNA Pur-2'OMe mostram o comportamento cinético com melhor desempenho quando comparados com RNA Pyr-2'F e RNA Pur-2'F, respectivamente.

Estes resultados sugerem que salmonella tem uma atividade importante RNase que pode ser usado para a seleção de sondas capazes de reconhecer especificamente esta bactéria. Além disso, observamos que os nucleosídeos quimicamente modificados 2'-OMe são mais adequados para o tipo de RNAses secretados pela Salmonella. Com isso em mente, o protocolo descrito nesta contribuição oferece a possibilidade de explorar o uso da atividade nuclease como biomarcador.

Figure 1
Figura 1:Culturas de bactérias e fluxo de trabalho do processo de triagem. Preparação de culturas de bactérias e supernatantes (esquerda). Descrição do fluxo de trabalho para as duas rodadas de triagem. Primeira triagem: A preferência por DNA ou RNA é avaliada usando 10 sondas. Segunda triagem: Com base na preferência por ácido nucleico, sondas adicionais contendo nucleotídeos quimicamente modificados são avaliadas para identificar os substratos de melhor desempenho para uma determinada atividade nuclease. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2:Primeira rodada detriagem cinética. Perfis cinéticos de Salmonella, E. coli e meios de cultura (TSB) usando sondas de DNA e RNA. A atividade nuclease é representada por unidades relativas de fluorescência (RFU). Os gráficos são representativos para pelo menos 3 experimentos realizados individualmente. As diferentes amostras são rotuladas como indicada na lenda do gráfico. Os valores de diferença de dobra (FD) foram calculados usando os coeficientes de taxa de Salmonella e E. coli para cada sonda. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3:Segunda rodada detriagem cinética. Perfis cinéticos de Salmonella, E. coli e meios de cultura (TSB) usando sondas quimicamente modificadas. A atividade nuclease é representada por unidades relativas de fluorescência (RFU). Os gráficos são representativos para pelo menos 3 experimentos realizados individualmente. As diferentes amostras são rotuladas como indicada na lenda do gráfico. Os valores de diferença de dobra (FD) foram calculados usando os coeficientes de taxa de Salmonella e E.coli para cada sonda. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Table 1
Tabela 1: Sequências de sondas de ácido nucleico. Lista de todas as sondas de ácido nucleico utilizadas neste estudo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Figure 1
Figura suplementar 1: Medição configurada. Cliques em botão e diálogo janelas descrevendo o processo passo a passo realizado no software de aquisição para configurar os diferentes parâmetros de medição. (A)Ícone da área de trabalho. (B)Gerente de tarefas dialoga janela. (C)Procedimento e temperatura configurar janelas de diálogo. (D)Procedimento e janelas de diálogo cinética. (E)Procedimento e Método de Leitura dialogam janelas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Figure 2
Figura suplementar 2: Medição configurada. Cliques em botão e diálogo janelas descrevendo o processo passo a passo realizado no software de aquisição para configurar os diferentes parâmetros de medição. (A)Procedimento e Ler Etapa (Cinética) Diálogo janelas. (B) Janela de diálogo de procedimento (C) barra de menu "Protocolo". (D)Janela de diálogo de seleção bem. (E)Caixa de entrada do nome de arquivo. (F) Executar novo ícone usado para iniciar a aquisição dentro do software. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Figure 3
Figura suplementar 3: Análise de dados. Button clica e dialoga janelas descrevendo o processo passo a passo realizado no software de aquisição para exportar dados adquiridos em uma folha de spread para análise mais aprofundada. (A)Janela de diálogo Plate Matrix. (B)Placa e seleção de poços dialogam janelas. (C)Janela de diálogo de placa e menu de contexto de exportação rápida. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Figure 4
Figura suplementar 4: Terceira rodada de triagem (otimização de preferência de sequência). Descrição das diferentes etapas envolvidas em uma rodada de triagem adicional destinada a avaliar as variações de sequência. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Figure 5
Figura Suplementar 5: Quarta rodada de triagem (rodada de avaliação de especificidade). Descrição das diferentes etapas envolvidas em uma rodada de triagem adicional destinada a aumentar a especificidade. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Figure 6
Figura suplementar 6: Quinta rodada de triagem (otimização do parâmetro de reação). Descrição das diferentes etapas envolvidas em uma rodada de triagem adicional destinada a reduzir a reatividade cruzada não-alvo modulando a atividade nuclease. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Table 1
Tabela suplementar 1: Dados brutos da primeira rodada de triagem. Para cada sonda (rotulada em vermelho, por cima), o tempo de aquisição e os valores brutos de fluorescência foram relatados para TSB, E. coli e Salmonella,juntamente com o valor calculado da taxa para cada intervalo. Os cálculos foram realizados conforme descrito na seção de métodos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Supplementary Table 2
Tabela complementar 2: Dados brutos da segunda rodada de triagem. Para cada sonda (rotulada em vermelho, por cima), o tempo de aquisição e os valores brutos de fluorescência foram relatados para TSB, E. coli e Salmonella,juntamente com o valor calculado da taxa para cada intervalo. Os cálculos foram realizados conforme descrito na seção de métodos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Supplementary Table 3
Tabela suplementar 3: Análise de dados para a primeira rodada de triagem. Para cada sonda (rotulada em vermelho, no topo), os seguintes valores foram obtidos para TSB, E. coli e Salmonella:valores máximos de taxa, pontos de tempo de intervalo mínimos e máximos, coeficiente de taxa, valores de diferença de dobra entre Salmonella e E. coli sobre TSB e dobrar valores diferença entre Salmonella e E. coli (destaque em amarelo). Os cálculos foram realizados conforme descrito na seção de métodos e as fórmulas de cálculo e os cálculos passo a passo são mostrados na planilha. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Supplementary Table 4
Tabela complementar 4: Análise de dados para a segunda rodada de triagem. Para cada sonda (rotulada em vermelho, no topo), os seguintes valores foram obtidos para TSB, E. coli e Salmonella:valores máximos de taxa, pontos de tempo de intervalo mínimos e máximos, coeficiente de taxa, valores de diferença de dobra entre Salmonella e E. coli sobre TSB e dobrar valores diferença entre Salmonella e E. coli (destaque em amarelo). Os cálculos foram realizados conforme descrito na seção de métodos e as fórmulas de cálculo e os cálculos passo a passo são mostrados na planilha. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Alterações da atividade nuclease têm sido associadas a uma grande variedade de fenótipos de doenças, incluindo diferentes tipos de câncer e infecções bacterianas. Estas alterações são propostas para ser o agente causal de uma condição14,enquanto em outros casos são consequência de um evento fisiológico prejudicial20 ou agente patogênico16,26. Não surpreendentemente, as tentativas de usar nucleases e atividade nuclease como um biomarcador diagnóstico foram descritas15,22,23,26,com considerável promessa. Assim, o estabelecimento de uma abordagem de rastreamento robusta e reproduzível para a avaliação sistemática da atividade nuclease na doença e para a identificação de repórter específico e sensível parece pertinente. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma plataforma de rastreamento robusta, modular e fácil de implementar com base em um ensaio de fluorescência, que permite a descoberta de novos biomarcadores de doenças e a identificação de sondas de ácido nucleico sensíveis e específicas em paralelo, usando a ação catalítica dos nucleases.

Poderosas ferramentas de triagem, como triagem de alta de vesperidão de moléculas pequenas (HTS)27,evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX)28 ou exibição de fagos29 foram relatadas anteriormente, que permitem o identificação de moléculas de alto reconhecimento de afinidade (por exemplo, pequenas moléculas, aptamers ou peptídeos de ligação). Em comparação, a abordagem de triagem aqui apresentada permite a seleção de sondas que podem identificar a atividade de nuclease conhecida e desconhecida. Além disso, essa abordagem é compatível com modelos de triagem in vitro, ex vivo e in vivo. Além disso, a natureza reativa das nucleases confere uma vantagem óbvia sobre as abordagens acima mencionadas, na medida em que a interação sonda-nuclease não é uma estática, mas um processo dinâmico. Isso significa que a atividade dos nucleases se torna um módulo de amplificação de sinal intrínseco para as sondas repórter, uma vez que várias sondas repórter pode interagir com uma única nuclease.

Como em qualquer outro método de triagem, a geração e gestão da biblioteca inicial é essencial. A natureza das sondas de ácido nucleico proporciona grande flexibilidade no projeto e criação de uma biblioteca e permite a introdução de diferentes graus de complexidade, dependendo da aplicação de triagem. A complexidade da biblioteca pode ser introduzida em diferentes níveis, incluindo motivos de sequência, química de nucleotídeos, química da espinha dorsal de fosfato e comprimento de oligonucleotídeos. A modulação da complexidade da biblioteca permite identificar sondas, não apenas por sua capacidade de identificar com sucesso a atividade nuclease associada à doença, mas também para propriedades compatíveis com as aplicações in vivo subsequentes. Além disso, uma biblioteca de base de ácido nucleico oferece várias vantagens sobre seus homólogos de anticorpos ou peptídeos. Por um lado, a produção de anticorpos é bem conhecida por ser complicada, exigindo animais ou sistemas complexos de cultura eucariótica, que aumentam o custo e introduzem a variabilidade do lote30,31. Além disso, o alto peso molecular e imunogenicidade limitar a sua aplicação28,32. Por outro lado, a geração de bibliotecas de peptídeos biológicos geralmente requer sistemas de expressão viral ou bacteriana29,30,aumentando a complexidade do processo de triagem. Bibliotecas peptídeos químicos evitar este problema, à custa do uso de sistemas condizizados à base de contas ou várias rodadas de síntese peptídeo caro33. Todos esses problemas são contornados usando uma biblioteca de ácido nucleico. Uma vez que a biblioteca inicial foi estabelecida, os métodos de triagem são rápidos e diretos. O método aqui descrito serve como uma plataforma para rodadas de triagem adicionais, como otimização de sequências (Figura Suplementar 4),avaliação de especificidade(Figura Suplementar 5)ou otimização de elementos modulatórios de atividade nuclease, como cofatores metálicos (tipicamente cations divalentes) e quelantes, que são muito úteis para aumentar a especificidade das sondas selecionadas(Figura Suplementar 6).

O ensaio fluorométrico cinético utilizado neste estudo pode ser otimizado para culturas bacterianas e celulares, com a triagem sendo realizada em placas de microtiter amigáveis. No caso dos ensaios celulares, esse protocolo é compatível com as culturas de suspensão e monocamada, que, pós-otimização, podem ser utilizadas de acordo com as necessidades do modelo in vitro que está sendo estudado. Identificamos várias etapas críticas que exigem otimização antes da triagem. Estes incluem o número celular ou densidade bacteriana a ser atenta, concentração de sonda, detector de flódromo obter configurações de ganho ou a implementação de métodos de correção de fundo embutidos. Uma limitação dessa tecnologia é a necessidade de uma atividade de nuclease alterada associada à condição patológica de interesse. Sem esse recurso, a abordagem de triagem para a seleção de sondas candidatas não é viável. Outra limitação é a capacidade auto-saciante das guaninas quando estão próximas do fluorofofóbico. Essa característica precisa ser considerada ao projetar a biblioteca.

A natureza enzimática da reação que está sendo medida torna necessário considerar os tempos de carregamento da placa. Minimizar os tempos de carregamento reduzirá as diferenças de fundo entre diferentes condições experimentais. Existem várias opções para superar esse problema, como retardar a reação enzimática durante o carregamento usando reagentes gelados ou usando sistemas de carregamento automatizados, embora este último aumente consideravelmente os custos, mas também a taxa de produção. Além disso, as medições cinéticas são uma grande melhoria em relação às medições estáticas, proporcionando uma imagem completa e mais realista da dinâmica da atividade catalítica dos nucleases.

Em resumo, nosso protocolo oferece um método de rastreamento versátil, robusto e reprodutível para a identificação de sondas de ácido nucleico sensíveis e específicas para a detecção da atividade nuclease associada à doença, que supera os principais obstáculos de métodos de triagem alternativos. Prevemos que esta tecnologia de triagem permitirá o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico em uma infinidade de condições, com fácil traduzibilidade para a clínica.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer Luiza I. Hernandez (Universidade linköping) por sua cuidadosa revisão do manuscrito e conselhos valiosos. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Knut e Alice Wallenberg e pela Área de Pesquisa Estratégica do Governo Sueco em Ciência de Materiais em Materiais Funcionais Avançados na Universidade de Linköping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

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