在人类多能干细胞中使用CRISPR-CAS9生成定义的基因组修饰

基因功能和疾病的研究受到人类近亲繁殖性质的阻碍。患者特异性和控制 iPS 细胞系的不同遗传背景会影响给定功能测定中的分化效率和表型。使用基因相同或等基因线，其中唯一的区别是特定的兴趣突变是克服这些问题的关键。

许多人类疾病是由异质突变引起的，这些突变很难用CRISPR-Cas9系统产生。这是因为非靶向等位基因的内德尔突变的产生，这种突变可能以非常高的频率发生。我们的技术克服了这个问题，使用两个修复模板，其中只有一个包含感兴趣的突变。

任何尝试这种技术的调查员都应该熟练掌握人类多能干细胞培养。殖民地采摘的视频演示将有助于显示正确的大小和形态以及用于采摘和筛选的技术。证明这个程序将是利奥卡德纳斯。

首先，在6井板中辐照的 MEF 上镀上人类 ESC。准备转染主组合。通过移液和在室温下孵育15分钟。

当细胞达到70至80%的汇合，然后，添加转染主混合下降明智的每个井与细胞和孵育在37摄氏度48小时。每 24 小时更换一次介质。为了收获细胞，首先，在室温下用三重E孵育细胞三分钟，以酶去除 MEF。

加入0.5毫升的 HESC 介质与 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。用300倍g的颗粒细胞3分钟，用10微摩尔 ROCK抑制剂在0.5毫升的人类ESC介质中重新悬浮。通过 35 微米细胞滤株盖将悬浮液过滤成 5 毫升管。

使用荧光激活细胞排序，对活细胞进行闸门，对绿色荧光蛋白阳性细胞进行排序。接下来，将最多1.5倍10的细胞直接转移到一个10厘米的培养皿中，该培养皿涂有1至3个基底膜基质和辐照 MEF 和含有 ROCK 抑制剂的人类 ESC 介质。每天使用无 ROCK 抑制剂的人类 ESC 介质更换介质。

10到15天后，菌落的直径约为1至2毫米。在显微镜下，使用P200移液器小心刮单个克隆，将细胞吸引到移液器中。将细胞分散在96井板的井中，用菌落绘制的介质中轻轻移液三到四次。

然后，为每个引导RNA选择20个菌落，并分配到PCR条管中进行筛选。在10，000次G下离心，将细胞进行5分钟的离心。现在，在20微升蛋白质酶K缓冲液中孵育细胞颗粒，以大力分离DNA和涡流。

在10，000次G下离心5分钟。接下来，对编辑的DNA进行PCR的筛选。将主混合物的20微升加入管中，包括用于放大感兴趣区域的前进和反向底剂，以及5个微升的蛋白质酶K消化。

在执行筛选 PCR 时，使用从控制 iPSC 线路分离的基因组 DNA 确认清洁安培。评估 PCR 产品在 70 至 90 伏特的电泳后，按体积 agarose 凝胶 2.5% 的重量评估 PCR 产品的大小变化。任何大小差异都表示裂痕。

要转染单链寡合DNA和CRISPR-Cas9质粒，在辐照的 MEF 上 6 井盘上将目标细胞系进行板状，经过一夜的孵育后达到 70 至 80% 的汇合。设置上述转染反应。通过移液混合反应，在室温下孵育15分钟。

然后，将转染反应混合物滴入细胞中。48 小时后，将单元格准备为单元格排序，如上。电镀单细胞后约10天，使用200微升移液器将菌落采摘到PCR条管中，并放入预涂明胶和 MEF 的 12 井板井中。

将100微升的细胞转移到24或48井板的每个井中，以前用一种用于岩石抑制剂的人类ESC介质中涂有明胶和辐照的 MEF。使用剩余的100微升进行DNA分离。为了检查单链寡聚DNA的整合成功，请从每个菌落中分离出五微升DNA，使用先前设计的筛选底剂执行PCR。

使用单股寡糖DNA中产生的独特酶位点，净化PCR产品，并准备40微升的限制性酶消化。通过移液混合反应，并在制造商推荐的温度下孵育一到三个小时。然后，将用负载染料添加的 1.5% 重量（由溴化钾 agarose 凝胶）添加的消化 PCR 产品可视化，电泳电压为 80 至 100 伏，使用 40 分钟。

如果成功整合单链寡核DNA，则使用嵌套底转序列特定的突变。在这项研究中，为了指导RNA构造，从1.5%的加糖凝胶中切除了100个碱基对带。细胞转染后，使用2.5%的加糖凝胶对导导RNA切割进行验证。

180 基对 PCR 产品显示了未切割控制和带移指示内德尔形成的不同克隆。不同的指南 RNA 具有不同的切割效率。为了避免CRISPR-Cas9重新切割编辑的等位基因，使用G到A无声突变修改了PAM序列。

PAM 序列中的无声突变生成了唯一的限制位点，这有助于筛选成功集成到一个或两个等位基因中。基因组编辑的干细胞系可用于下游分化和功能测定，以研究给定突变对人类发展和疾病的影响。这种方法允许生成具有特定异质或同源突变的等源细胞系，这些突变涉及各种人类疾病。

这些疾病模型为开发新的细胞疗法铺平了道路，也为药物发现提供了平台。