Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Анализ на кроветчебно-мозговой барьер целостности в Drosophila меланогастер

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

Кроветно-мозговой барьер целостности имеет решающее значение для работы нервной системы. В Drosophila melanogaster, гематоэнцефалический барьер образуется глиальными клетками во время позднего эмбриогенеза. Этот протокол описывает методы анализа для формирования гематоэнцефалический барьер формирования и поддержания в D. melanogaster эмбрионов и третьих личинок instar.

Abstract

Правильное развитие нервной системы включает в себя образование гематоэнцефалического барьера, диффузионного барьера, который жестко регулирует доступ к нервной системе и защищает нервную ткань от токсинов и патогенов. Дефекты в формировании этого барьера были связаны с невропатиями, и разрушение этого барьера наблюдалось во многих нейродегенеративных заболеваний. Поэтому крайне важно определить гены, которые регулируют формирование и поддержание гематоэнцефалического барьера для выявления потенциальных терапевтических целей. Для того, чтобы понять точную роль этих генов в нервном развитии, необходимо проанализировать влияние измененной экспрессии генов на целостность гематоэнцефалического барьера. Многие из молекул, которые функционируют в создании гематоэнцефалический барьер были найдены, чтобы быть сохранены через эукариотических видов, в том числе плодовая муха, Drosophila melanogaster. Фруктовые мухи оказались отличной модельной системой для изучения молекулярных механизмов, регулирующих развитие и функционирование нервной системы. Этот протокол описывает пошаговую процедуру анализа целостности гематоэнцефалического барьера во время эмбриональных и личинок стадии развития D. melanogaster.

Introduction

Во время развития, клеточная связь и взаимодействия имеют решающее значение для создания структуры и функции тканей и органов. В некоторых случаях эти клеточные взаимодействия блокировать органы из окружающей среды для обеспечения надлежащей функции органа. Это относится к нервной системе, которая изолирована гематоэнцефалический барьер (BBB). Дисфункция BBB у людей была связана с неврологическими расстройствами, включая эпилепсию, и разрушение барьера наблюдается при нейродегенеративных заболеваниях, включая рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз1. У млекопитающих BBB образуется тесными соединениями между эндотелиальными клетками2,3. Другие животные, в том числе плодовая муха, Drosophila melanogaster, имеют BBB, состоящий из глиальных клеток. Эти глиальные клетки образуют выборочно проницаемый барьер для контроля движения питательных веществ, отходов, токсинов и крупных молекул в и из нервной системы4. Это позволяет для поддержания электрохимического градиента, необходимого для противопожарного действия потенциалов, что позволяет мобильность и координацию4. В D. melanogaster, глия защитить нервную систему от калия богатых, кровь, как гемолимфа5.

В центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (PNS) D. melanogaster, два внешних глиальных слоя, субпериневральная глия и периневиальная глия, а также внешняя сеть внеклеточной матрицы, нейронная ламелла, образуют гемолимф-мозг и гемолимф-нервбарьер6, называют BBB на протяжении всей этой статьи. Во время развития субпериневральная глия становится полиплоидной и увеличивается, чтобы окружить нервнуюсистему5,6,7,9,10,11 . Субпериневриальное глия образуют перекрестные соединения, которые обеспечивают основной диффузионный барьер между гемолимфой и нервной системой5,6,12. Эти соединения молекулярно похожи на перегородки, как соединения, найденные в паранодах миелинизирующей глии у позвоночных, и они выполняют ту же функцию, что и плотные соединения в BBB млекопитающих13,14, 15 лет , 16 Год , 17. Периневиальная глия разделить, расти, и обернуть вокруг subperineurial глии для регулирования диффузии метаболитов и больших молекул6,10,18,19. Формирование BBB завершается на 18,5 ч после откладки яиц (AEL) при 25 градусах по Цельсию5,8. Предыдущие исследования выявили гены, которые являются критическими регуляторами формирования BBB20,21,22. Чтобы лучше понять точную роль этих генов, важно изучить влияние мутации этих потенциальных регуляторов на целостность BBB. Хотя предыдущие исследования наметили подходы для наблюдения BBB целостности эмбрионов и личинок, всеобъемлющий протокол для этого исследования до сих пор не описано5,7. Этот пошаговой протокол описывает методы для оценки целостности BBB во время эмбриональных и третьих этапов личинок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Коллекция образцов

  1. Коллекция эмбрионов
    1. В каждой клетке коллекции эмбрионов, используйте как минимум 50 девственных женщин с 20-25 самцов для коллекций. Инкубировать эти мухи в бутылке с кукурузной мукой-агар пищи (Таблица материалов) в течение 1'2 дней до начала коллекции23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать больше мух, но соотношение женщины и мужчины должно быть сохранено на уровне 2:1.
    2. Предварительно разогреваея яблочный сок агар пластины (Таблица 1) на 25 градусов по Цельсию на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для правильной постановки эмбрионов. Если пластины быстро высыхают, добавьте в инкубатор миску с водой, чтобы повысить влажность камеры.
    3. Анестезия мух со ступени 1.1.1 с CO2 и передача мух в клетку сбора. Поместите предварительно подогретый яблочный сок агар пластины с небольшим мазком дрожжевой пасты на открытом конце и закрепите в клетку с красным рукавом (Таблица материалов). Для того, чтобы очистить старые эмбрионы, позвольте мухам откладывать эмбрионы/яйца на агарную пластину яблочного сока в течение 1 ч при 25 градусах Цельсия.
    4. Удалите клетку коллекции из инкубатора. Перевернуть клетку сетки стороны вниз и нажмите летит вниз к нижней части клетки. Замените агар яблочного сока новой предварительно подогретой яблочной пластиной с небольшим мазком дрожжевой пасты. Отбросьте первую пластину.
    5. Разрешить мухам откладывать эмбрионы / яйца на новой пластине агар яблочного сока в течение 1 ч при 25 градусах Цельсия. Откажитесь от этой пластины после 1 h коллекции и перейти к следующему шагу, чтобы собрать эмбрионы для инъекций.
    6. Для сбора поздней стадии 17 эмбрионов (20-21 ч AEL), позволяют мухам желаемого генотипа со ступеней 1.1.1.1.5 заложить на новый предварительно подогретый яблочный сок агар пластины с небольшим мазком дрожжевой пасты на 25 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Возрастная пластина для 19 ч в 25 , таким образом, эмбрионы будут 20-21 ч возраста на момент визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть повторен по желанию для нескольких раундов сбора образцов, инъекций и визуализации.
    7. Сбор эмбрионов из пластин в клеточный ситечко с 70 мл нейлоновой сеткой, добавив фосфат-буферный солен (PBS) с 0,1% неионическим сурфактантом (PBTx; Таблица 1) для покрытия поверхности пластины и ослабить эмбрионы от поверхности с помощью кисти.
    8. Dechorionate эмбрионов, собранных в клеточном ситечко в 50% отбеливатель раствор (Таблица 1) в 100 мм Петри блюдо в течение 5 минут с случайным возбуждением при комнатной температуре. Промыть эмбрионы 3x, закрученного ситечко клетки в PBTx в чашке Петри, используя свежее блюдо PBTx каждый раз.
    9. Если все эмбрионы имеют правильный генотип, перейдите непосредственно к шагу 1.1.10. Если генерация эмбрионов правильного генотипа требует креста с гетерозиготными мухами, выберите эмбрионы правильного генотипа с использованием наличия или отсутствия флуоресцентно выраженных балансовых хромосом. Используйте стереомикроскоп с флуоресцентными возможностями для выбора генотипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Балансовые хромосомы, отмеченные деформированным- желтым флуоресцентным белком; Круппель-Гал4,УАЗ-зеленый флуоресцентный белок (GFP); и твист-Gal4,UAS-GFP хорошо работать для выбора генотипа в конце эмбриогенеза (Таблица 2)24,25,26.
    10. Используя стеклянную пипетку, перенесите эмбрионы в PBTx на 2% плиту геля агарозы(таблица 1). Удалите лишнюю жидкость фильтровальной бумагой. Выровнять 6-8 эмбрионов на 2% агарозный гель плиты с задней вправо и сонную сторону вверх(Рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микропил, небольшое отверстие, через которое сперматозоиды попадают в яйцеклетку, находится на передней конце эмбриона. Задний конец более округлен. Трахея выглядит белой и расположена в эмбрионе, что позволяет различать псовую и брюшную стороны эмбриона(рисунок 1B).
    11. Подготовьте слайд с одним куском двусторонней ленты. Твердо нажмите слайд на верхней части эмбрионов, чтобы передать их в двусторонню ленту.
    12. Обезопажные эмбрионы путем инкубации при комнатной температуре в течение 25 мин (не используется дезиккант). После высыхания накройте эмбрионы галоуглеродным маслом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Периоды высыхания могут варьироваться в зависимости от температуры, влажности и вентиляции в помещении. Инкубационный период следует использовать для настройки аппарата для инъекций и конфокального микроскопа для визуализации, как описано в разделах 2 и 3 этого протокола.
  2. Коллекция ларval
    1. Настройте крест с 5–10 девственными самками мух и вдвое меньше самцов желаемого генотипа во флаконе с кукурузной мукой-агаром и инкубировать при 25кв. м. 23.
    2. Через 5–7 дней, в зависимости от генотипа, собирайте блуждающие третьи личинки из флакона мягко с помощью щипц. Промыть личинки в 1x PBS для удаления пищи застрял на личинок. Передача личинок в яблочный сок агар пластины для генотипирования, как описано в шаге 1.1.9, если это необходимо.
    3. Ролл личинок на ткани с помощью кисти, чтобы высушить их. Передача личинок 6'8 на горку, подготовленную с помощью двубортной ленты с помощью щипкеток.

2. Подготовка игл и инъекций образцов

  1. Потяните иглы на выдвижной микропипетец до начала этого протокола. Безопасные капиллярные трубки в иглу шкива и тянуть в соответствии со стандартной формой иглы и параметров для D. меланогастр инъекций (Таблица 3)27. Хранить иглы в чашке Петри, якорь в глине до использования для инъекции.
  2. Загрузите иглу с 5 кЛ 10 kDa dextran, спрягаемым с сульфорходамином 101 кислотным хлоридом(Таблица Материалов) с помощью 20-L гель-загрузки пипетки наконечник в течение 25-минутного периода высыхания для эмбрионов (шаг 1.1.12), или сразу после передачи личинки к слайду (шаг 1.2.3).
  3. Загрузите иглу в держатель иглы и положение в микроманипуляторе, закрепленном на стальном основании(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть почти параллельно стадии микроскопа для инъекций эмбриона и под углом немного вниз для личинок инъекций.
  4. Установите инъекционный аппарат(Таблица материалов) до 50 пси, 5-10 мс с диапазоном 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть необходимо изменить эти настройки для конкретного аппарата инъекций используется.
  5. Поместите слайд на сцене и кисти края иглы против края двусторонней ленты под углом 45 ", чтобы создать угловой, сломанный кончик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эмбрионов необходимо только разорвать кончик достаточно, чтобы обеспечить поток 10 kDa dextran. Идеальная игла имеет слегка угловой кончик и только небольшая капля красителя выйдет с каждой инъекцией. Для личинок, необходимо разорвать кончик больше, но с угловым кончиком, чтобы проникнуть личиночной стенки тела. Большая капля красителя выйдет.
  6. Накачать педаль ноги, пока краситель находится на кончике иглы.
  7. Выровнять иглу так, чтобы она была параллельно с эмбрионом или под углом немного вниз к личинке.
  8. Переместите иглу, чтобы проколоть задний конец образца и ввести образец, накачивая педаль ноги. Введите 2 nL красителя в эмбрионы, и 220 нл красителя в личинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрион или личинка должны затопить красителем, если инъекция удалась.
  9. Обратите внимание на время инъекции для инкубационных целей. Инкубировать эмбрионы в течение 10 минут при комнатной температуре. Инкубировать личинки в течение 30 минут при комнатной температуре.
  10. Продолжить вниз слайд, чтобы придать дополнительные образцы, отметив время инъекции для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от скорости, с которой могут быть выполнены последующие шаги вскрытия и визуализации, можно вводить за один раз 4–8 образцов.

3. Подготовка образцов для визуализации

  1. Изображение эмбрионов
    1. После инъекции подготовьте эмбрионы к визуализации. Нанесите вазелин с хлопчатобумажным аппликатором на правой и левой сторонах образцов на слайде в качестве прокладки для предотвращения повреждения эмбрионов при размещении крышки.
    2. Образцы изображений с помощью конфокального микроскопа на всей глубине эмбриона с целью 20x. Рассчитайте процент от общего количества образцов с красителя наблюдается в брюшной нервной шнур (VNC) с помощью следующего уравнения: % образцов с скомпрометированным BBB - Количество образцов с накоплением красителя в VNC / общее количество образцов, асссссированных.
  2. Рассечение и визуализация личинок
    1. Подготовьте слайды для образцов личинок заранее. Маунт два крышки расположены примерно на 0,5 см друг от друга к слайду с лаком для ногтей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крышки функционируют как прокладки для мозга, поэтому он не поврежден во время монтажного процесса.
    2. После инкубации 30 мин, вскрыть личинки в 1x PBS непосредственно на слайде, который будет использоваться в изображении. Во-первых, используйте одну пару щипцы, чтобы захватить личинки на полпути вниз личинки тела, и использовать вторую пару щипцы, чтобы отделить передние и задние половинки личинки.
    3. Далее, используйте одну пару щипцы для захвата передней области на рот крючки, и использовать вторую пару щипцы, чтобы инвертировать стенку тела над кончиком щипцы захвата рот крючки. Мозг и VNC будут разоблачены.
    4. Отделить мозг и VNC от стенки тела, отделяя нервы, и удалить стенку тела от слайда(Рисунок 1C,D). Удалите воображаемые диски при желании.
    5. Обложка образца с 10 зл и 80% глицерола и место coverslip на верхней части образца для визуализации.
    6. Изображение через глубину ткани нервной системы с помощью 20x цели. Рассчитайте процент от общего количества образцов с красителями, наблюдаемым в VNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Описанные здесь методы позволяют визуализировать целостность BBB по всей ЦНС в эмбрионах D. melanogaster и личинках(рисунок 1). По завершении формирования BBB в конце эмбриогенеза, BBB функции, чтобы исключить большие молекулы из мозга и VNC5. Этот протокол использует эту функцию для ассоциации формирования BBB. Когда дикого типа (Орегон R) поздней стадии 17 (20-21 ч старых) эмбрионы были введены с 10 kDa dextran конъюгированных сульфорходамин 101 кислоты хлорорид флуоресцентный краситель, большая молекула декнулона была исключена из VNC, как и ожидалось(Рисунок 2A). Для того, чтобы продемонстрировать влияние генетических мутаций на целостность BBB, были использованы эмбрионы с мутациями в сыром гене. Ранее было продемонстрировано, что сырой ген регулирует опрокидку зародышевой полосы во время эмбриогенеза, а в последнее время было показано, что он функционирует в глии для регулирования морфологических изменений в ВНК во время развития28. Heterozygous сырых1 мутант эмбрионов выставлены нетронутыми BBB, аналогичные результатам, наблюдаемым в диком типе контроль эмбрионов(рисунок 2B). В отличие от этого, гомозиготные необработанные1 эмбрионы-мутанты продемонстрировали дефекты целостности BBB, с 10 kDa dextran красителя наводнения в VNC, указывая, что BBB не удалось сформировать (Рисунок 2C). Эти результаты демонстрируют способность этой методики для исследования формирования BBB на эмбриональных стадиях.

Предыдущие исследования показали, что дефект в subperineurial глии полиплоидизации приводит к нарушению BBB, которые могут наблюдаться в третьих стадиях личинки7,9. Таким образом, дефекты в формировании и/или обслуживании BBB могут привести к скомпрометированному BBB на более поздних стадиях разработки, что делает его желательным для проверки целостности барьера в третьей стадии личинки. Таким образом, протокол, используемый для наблюдения за целостностью BBB на эмбриональных стадиях, также был оптимизирован для использования в личинках. В Орегоне R контроль образцов, 10 kDa dextran не может проникнуть в BBB и исключается из мозга и VNC (Рисунок 2D, E). Краситель накапливается на периферии BBB.

Figure 1
Рисунок 1: Нервная система эмбрионов стадии 17 и третья личинка в звезде. (A) Схема брюшного вида стадии 17 эмбриональной центральной нервной системы (ЦНС). ЦНС состоит из мозга (Br) и брюшного нервного шнура (VNC), который имеет дорсовентральные каналы (ч). Микропил (mp; наконечник стрелы) на передней части может быть использован для ориентации эмбриона. Задняя вправо. (B) Этап 17 эмбриона ориентированных с нижней стороны вверх и задний вправо, как рекомендуется в шаге 1.1.10. Стрелки указывают на трахею. Стрелка указывает на mp. Задняя вправо. (C) Схема нервной системы в третьей личинке instar. Мозг (Br) и VNC составляют ЦНС, в то время как нервы, простирающиеся от синапса VNC на мышцы стенки тела и являются частью PNS. Задняя вправо. (D) Расчлененный третий взвездённый личинки мозга и VNC. Задняя вправо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ на гематоэнцефалический барьер (BBB) формирования. (A-C) Поздней стадии 17 эмбрионов (20-21 ч старый) вводят задним с 10 kDa сульфорходамин 101 кислотный хлорид декрен. Задняя вниз. Шкала бар 20 мкм. Точки видели в элементах управления являются дорсовентральные каналы, которые охватывают брюшной нервный шнур (VNC). (A) Орегон R управления. Потребление красителя в 6,25% образцов, n No 16. (B) сырой1 / " брат управления. Потребление красителя в 6,67% образцов, n No 15. (C) Гомозигот сырой1/1 мутант. Потребление красителя в 100% образцов, n No 22. (D) Орегон R контроль третий instar личинки мозга. Краситель накапливается на BBB, но не проникает в ЦНС, n No 7. Шкала бар 50 мкм. (E) Орегон R контроль третий instar личинки VNC. Краситель накапливается на BBB, но не проникает в ЦНС, n No 11. Dashed линия очертания VNC. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Морфология мидгута в позднем эмбриональном развитии. Передаваемые световые изображения эмбрионов стадии 13–17 позволяют визуализировать морфологию кишечника (темно-серые области в задней половине эмбриона). Морфология мидгута может быть использована для определения стадии эмбрионального развития, что полезно при определении того, находятся ли эмбрионы в возрасте соответственно для инъекций. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Решение Рецепт
2% Агарозный гель Добавьте 0,8 г агарозы до 40 мл двойной дистиллированной H2O (ddH2O) в колбу Erlenmeyer и микроволновой печи для растворения агара. Налейте в лоток для литья геля и дайте гелю затвердеть в течение 30 минут при комнатной температуре.
Яблочный сок агар пластин Измерьте 45 г агара и 1,5 л ddH2O в колбу 4 л. Автоклав в течение 40-45 мин при 121 градусов по Цельсию. Измерьте 50 г сахара и 0,5 л яблочного сока в стакан 1 л и размешайте на слабом огне (установка 3), чтобы растворить сахар, заботясь, чтобы не сжечь его. После автоклавирования добавьте разогретый сахар и яблочный сок в агар и воду. Перемешать на низком уровне с теплом, чтобы позволить остыть, пока вы не можете прикоснуться к нему. Добавить 15 мл 70% тегосепт и перемешать, чтобы разойтись. Налейте в стакан 0,5 л. Спрей с этанолом, чтобы удалить пузырьки или пламя с горелкой Bunsen. Налейте в 60 мм петри блюда. Разрешить установить, по крайней мере 24 ч, или до тех пор, пока есть минимальный конденсата на крышках чашки Петри и хранить при 4 градусах Цельсия.
50% Отбеливатель Добавьте 15 мл ddH2O и 15 мл бытового отбеливателя в коническую трубку.
80% Глицерол Для 10 мл, добавить 8 мл autoclaved ddH2O и 2 мл глицерола в 15 мл конической трубки. Инкубировать на рокердо до тех пор, пока раствор не станет однородным.
1x PBS Для 1 л, разбавить 100 мл 10x PBS в 900 мл ddH2O.
10x PBS Для 2 л, растворить следующие в 1600 мл ddH2O: 160 г NaCl, 4 г KCl, 28,8 г Na2HPO4, и 4,8 г KH2PO4. Отрегулируйте рН до 7,5 с HCl.
PBTx (PBS - 0,1% неионический сурфактант) Для 1 л, объединить 100 мл 10x PBS, 10 мл 10% неионический сурфактант, и 890 мл ddH2O.
70% Тегосепт Смешайте 1 г p-гидроксибензойной кислоты, метилового эфира на каждые 10 мл 100% этанола. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
10% Нонионический сурфактант Для 50 мл, добавить 45 мл autoclaved ddH2O и 5 мл неионического сурфактанта в коническую трубку. Поверните на рокер, пока решение не станет однородным.
Дрожжевая паста Смешайте сухие активные дрожжи с ddH2O в пластиковом стакане 50 мл до однородной массы.

Таблица 1: Реагенты и буферы, используемые в этом протоколе.

Генотип Фондовая
w 1118;; ln (2LR)Gla, wg -Gla-1/CyO, Пзве-МКЗ-ГАЛ4-twi.G-2.2, Пзвем-МКЗ-УАС-2xEGFP-AH2.2 Блумингтон #6662
ва-э-э; sna'Sco/CyO, Пзвем-МК Блумингтон #8578
ва-э-э; Пл/СИО, Пзве-МКЗ-ГАЛ4-Кр.К.ДК3, Пзве-МК.-УАС-ГПП. S65T-DC7 Блумингтон #5194
Df (1)JA27/FM7c, Пзве-МКЗ-ГАЛ4-Кр.К.К.Д1, Пзве-МКЗ-УАС-ГФП. S65T-DC5, sn Блумингтон #5193
вэ; ry(ry'506) Dr'1/TM6B, P'w-mc-'Dfd-EYFP,Sb 1' Tb'1' ca Блумингтон #8704
и 1 х w» ; ДЗЗгл/ТМ3, Пзвем-МКЗ-ГАЛ4-Кр.К.ДК2, Пзве-МКЗ-УАС-ГФП. S65T-DC10, Sb Блумингтон #5195
Орегон R Доступно несколько штаммов
сырой »1» кню 1 » 1 »sp »1 »/CyO Блумингтон #2749
Пэвем-МВ.Хс(ГавБ) Блумингтон #458
w 1118;; Пзваме (ГМ) «ГАЛ4»-РЕпо/ТМ3, Сб Блумингтон #7415
ПЗУАз-ГФП Доступно несколько штаммов

Таблица 2: Муха штаммов. Fly штаммов обсуждается в рамках этого протокола. Bloomington Drosophila Фондовый центр фондовый номер предоставляется, где это применимо.

Цикл Тепла Тянуть Скорость Время Давления Рампы
1 590 115 15 250 600 X
2 575 130 60 250 600 X

Таблица 3: Настройки выдвижного шкива Micropipette. Настройки micropipette puller, используемые для генерации игл для инъекций в этом протоколе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол содержит подробное описание шагов, необходимых для оценки целостности BBB во время поздних эмбриональных и третьих этапов личинок D. melanogaster развития. Аналогичные подходы были описаны в другом месте, чтобы рассказать о целостности BBB во время развития, а также на взрослых стадиях5,7,29,30. Однако описания процедур в разделах материалов и методов часто носят широкий характер и не имеют достаточной детализации для легкой реализации, что требует значительных устранений неполадок от имени исследователя. Этот протокол содержит полное описание шагов, необходимых для оценки целостности BBB во время эмбриональных и личинок. На каждом этапе необходимо предпринять критические шаги для обеспечения того, чтобы корректная стадия развития была изучена и не была нарушена архитектура тканей, что может поставить под угрозу BBB. Для достижения успеха в этих подходах необходимо было устранить неполадки в нескольких шагах протокола, чтобы дать точные результаты. Критические шаги в эмбриональных и личинок протоколов описаны ниже.

Предыдущие исследования сообщали о создании BBB на 18,5 ч AEL5. Для обеспечения точного времени разработки, важно поддерживать образцы при постоянной температуре во время старения. При сборе эмбрионов, яблочный сок агар пластины должны быть доведены до 25 градусов по Цельсию до использования для сбора. Использование яблочного сока пластин, которые не были предварительно нагревается приводит к более медленному развитию и может дать образцы, которые еще не созданы BBB и, следовательно, проявляют накопление 10 kDa dextran в нервной системе. Таким образом, важно убедиться, что один инъекционных образцов, которые старше 18,5 ч. Кроме того, при выполнении этих экспериментов в эмбрионах, необходимо рассмотреть возможность задержки развития, потому что такая задержка может просто привести к более позднее создание BBB. Для учета любых потенциальных задержек в развитии, образцы были проанализированы на 20'21 h AEL, немного после сообщения о формировании BBB. Использование морфологии других тканей, в частности развивающихся midgut, может помочь в установлении правильной стадии развития эмбриона проходит исследование(рисунок 3). И наоборот, неправильное экспериментальное время проведения может привести к появляются образцы, которые уже являются подвижноии и начали процесс вылупления. Чтобы уменьшить количество личинок, которые уже начали вылупляться, важно выполнить как минимум две коллекции 1 ч, чтобы очистить старые эмбрионы от самок, прежде чем собирать эмбрионы для инъекций. При желании анализа BBB в первых личинках instar, краткое инкубации личинок в 1x PBS в 9-хорошей тарелке на льду может быть использовано для уменьшения подвижности до инъекции. Слайды также можно хранить на пакете со льдом во время процедуры инъекции, чтобы уменьшить подвижность.

Для обеспечения качественных изображений и точных результатов в отношении создания BBB в эмбрионе, дополнительные шаги должны быть тщательно соблюдены на протяжении всей процедуры. При выстраивании эмбрионов на агар плиты, трахея должна быть лицом вверх, так как это тональная сторона эмбриона(Рисунок 1B). Когда эмбрионы передаются на слайд с двусторонней лентой, брюшная сторона эмбриона будет обращена вверх, что позволяет оптимальную визуализацию нервного шнура во время конфокальной визуализации позже в протоколе. Эмбрионы также должны быть надежно соблюдена к двусторонней ленте, чтобы ингибировать движение во время инъекции. Использование плоской 2% агарозной площадки позволяет исследователю нажать слайд с двусторонней лентой твердо на эмбрионы в процессе передачи без риска повреждения эмбрионов. После переноса на горку, высыхание необходимо, чтобы предотвратить разрыв эмбриона при инъекции красителя. Инъекция слишком большого количества красителя может также привести к разрыву эмбриона. Важно только вставить иглу в эмбрион достаточно, чтобы ввести краситель, но не так много, что игла потенциально проколов нервной системы, что даст ложноположительный результат. Слишком большой прокол раны также может привести к гемолимфы и красителя затопления из эмбриона, что приводит к неудачному эксперименту. С этими потенциальными ловушками в виду, инъекция является наиболее успешным с иглой, которая имеет небольшой угол кончика, так что есть небольшая точка, с которой тщательно проколоть эмбриона.

В случае проверки личинок для целостности BBB, проблемы могут возникнуть из-за подвижности образца. Использование высококачественной двусторонней ленты имеет решающее значение, так как оно должно быть эффективным в иммобилизации личинок для инъекций. Если личинка действительно расклеилась, ее можно откатить на ленту и аккуратно отодвинуть вниз, чтобы восстановить ее. При транспортировке личинок для инъекций полезно нести горку в чашке Петри в случае, если личинки расклеяются. Действия, следующие за инъекцией, требуют максимальной осторожности, чтобы избежать нарушения BBB. Для того, чтобы свести к минимуму потенциальный ущерб образцу, проще всего вскрыть образец непосредственно на слайдах, которые будут использоваться для визуализации. Если личинка прочно прижата к ленте при передаче образца для вскрытия, каплю 1x PBS можно добавить в ленту, чтобы ослабить сливку и разрешить перенос на слайд для вскрытия. После вскрытия важно сгладить образец достаточно, чтобы избежать ложноположительных результатов, но не настолько, что целостность образца скомпрометирована. Зажав личинки между крышкой и слайд с помощью дополнительных крышки, как прокладки предотвращает мозг от повреждения, но обездвиживает образец для эффективной визуализации.

Для достижения успеха с протоколами для эмбрионов и личинок, очень важно, чтобы убедиться, что инъекционный аппарат и конфокальный микроскоп настроены до начала обработки образцов. Это позволяет точно ежок при визуализации образцов, что необходимо для сравнения образцов. Другие подходы использовали более продвинутые инъекционные установки, требующие перевернутого микроскопа, созданного для инъекции эмбриона. Этот протокол использует стандартный рассекающий микроскоп и микроманипулятор с регулятором давления. В этом случае, инъекция зебры создана была просто адаптирована для инъекций мухи эмбрионов и личинок. Этот протокол можно было бы еще больше упростить, чтобы использовать микроманипулятор со шприцем для инъекций. Многие из этих инструментов легко доступны в биологических отделах и могут быть даже доступны в лабораторных условиях, что позволяет максимально облегчить реализацию протокола.

Во время процедуры визуализации, это может быть полезно для обозначения клеток нервной системы, чтобы легче определить желаемую область для визуализации. В частности, можно было бы использовать систему GAL4/UAS для выражения GFP в нейронах или глии, используя элав-Gal4 или репо-Gal4 штаммов, соответственно (Таблица 2)31,32,33. Такая маркировка обеспечит контраст с сульфорходамин 101 кислотный хлорид декевен, чтобы визуализировать целостность нервной системы.

Хотя этот метод ориентирован на проверку целостности BBB во время развития D. melanogaster, этот подход может быть адаптирован для изучения целостности других барьеров в различных организмах и тканях. Например, аналогичные протоколы были опубликованы для assaying BBB у мышей34. Кроме того, проницаемость гематоэнцефалического барьера и соматический барьер, окружающий зародышевые клетки во время сперматогенеза в D. melanogaster использовать аналогичный подход29,35. Протокол также может быть адаптирован для использования в других тканях для проверки проницаемости, в том числе в кишечнике. При адаптации этого протокола для использования в других тканях или видах, необходимо будет рассмотреть размер молекул, которые могут проникнуть барьер, так как вполне возможно, что 10 kDa dextran может быть достаточно мал, чтобы пронизывать некоторые барьеры. В целом, этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для поиска целостности BBB во время разработки D. melanogaster, которая может быть легко адаптирована для использования в других условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-ра Ф. Брайана Пикетта и доктора Родни Дейла за использование оборудования для инъекций. Эта работа финансировалась за счет финансирования исследований от Университета Лойола Чикаго до M.D., D.T., и JJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Tags

Биология развития Выпуск 151 Drosophila melanogaster гематоэнцефалический барьер глия нервная система брюшной нервный шнур эмбрион личинки
Анализ на кроветчебно-мозговой барьер целостности в <em>Drosophila меланогастер</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter