Summary
El objetivo de este artículo es describir un método refinado de intubación del ratón de laboratorio. El método no es invasivo y, por lo tanto, ideal para estudios que requieren monitorización en serie de la función respiratoria y/o inscripción de tratamientos en el pulmón.
Abstract
La literatura describe varios métodos para la intubación del ratón que requieren la visualización de la glotis a través de la cavidad oral o la incisión en el cuello ventral para la confirmación directa de la colocación de cánulas en la tráquea. La dificultad relativa o el trauma tisular inducido al sujeto por tales procedimientos puede ser un impedimento para la capacidad de un investigador para realizar estudios longitudinales. Este artículo ilustra una técnica en la que la manipulación física del ratón después del uso de un depilatorio para eliminar el vello del cuello ventral permite la visualización transcutánea de la tráquea para la intubación orotraqueal independientemente del grado de piel Pigmentación. Este método es inocuo para el sujeto y se logra fácilmente con una comprensión limitada de la anatomía murina. Este enfoque refinado facilita la intubación repetida, que puede ser necesaria para controlar la progresión de la enfermedad o la instilación de los tratamientos. El uso de este método puede resultar en una reducción del número de animales y la habilidad técnica necesaria para medir la función pulmonar en modelos de ratón de enfermedad respiratoria.
Introduction
El ratón de laboratorio es un modelo animal común para las enfermedades respiratorias humanas. Por lo tanto, existen varios métodos publicados para la intubación de ratones con el fin tanto de instanición de tratamientos y medición de la mecánica respiratoria. La mayoría de los procedimientos descritos requieren la visualización de la glotis a través de la cavidad oral con equipos especializados como un laringoscopio o fuente de luz de fibra óptica1,2,3,4,5,6,7. Sin embargo, esto puede ser difícil cuando se requiere una cánula relativamente grande, ya que puede oscurecer la visión del investigador. 8 han abordado esta preocupación con un método de intubación en el que se realiza una pequeña incisión cutánea a lo largo de la línea media del cuello ventral que permite la visualización de la tráquea. Después del procedimiento, la incisión se cierra con adhesivo tisular.
Para los estudios que requieren intubaciones repetidas frecuentes, la incisación sucesiva y el cierre de este sitio requiere el desbridamiento de los márgenes de la piel y traumatismos tisulares en el cuello ventral. El propósito del enfoque de visualización traqueal transcutánea a la intubación oral es proporcionar una técnica refinada y no invasiva específicamente adecuada para estudios de intubación repetida, así como eventos de intubación individual en ratones.
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Protocol
Todas las actividades de animales descritas aquí han sido aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio y se llevaron a cabo en instalaciones acreditadas por AAALAC.
1. Preparación del procedimiento
- Construir la plataforma de intubación. Para lograr la pendiente de plataforma adecuada, utilice un aglutinante de tres pulgadas (7,6 cm) de 3 anillos. Doble una longitud de 15 a 20 cm de seda u otro material de rosca por la mitad y adhiera los extremos de la rosca a la parte superior de la plataforma inclinada con cinta para crear un bucle de suspensión(Figura 1).
- Seleccione una cánula del tamaño y la longitud adecuados.
NOTA: Para un ratón de 20 a 30 g, se puede utilizar un catéter de 1 a 1,5 pulgadas (2,5 x 3,8 cm) de largo de hasta 18 G. Para este estudio, se utilizaron hembras DE 18 semanas de edad en BALB/c y ratones C57BL/6 de 10 semanas (n.o 3 de cada cepa). Una funda de catéter blanco opaco proporciona la mejor visualización transcutánea. - Corte un bisel en la punta distal del catéter y alise la superficie cortada con papel abrasivo para crear una punta de bisel redondeada. Cree suavemente una ligera curvatura en la cánula aproximadamente a 1 cm del bisel(Figura 2).
NOTA: Se debe utilizar un nuevo catéter para cada ratón. - Anestetizar el ratón con ketamina (5,4 mg/g de peso corporal) y xilazina (16 g/g de peso corporal) administrados por vía intraperitoneal. Aplique pomada ofthalimática estéril en los ojos.
NOTA: La profundidad anestésica adecuada se logra por falta de respuesta del ratón a un pellizco de dedo del dedo del pecho firme. - Suspenda el ratón en posición supina en la plataforma de intubación enganchando los incisivos superiores alrededor del hilo de seda en la parte superior de la superficie en ángulo(Figura 3). Una vez que el ratón está posicionado al cuadrado en la recumbencia dorsal, agarre suavemente la base de la cola y retraiga la cola hacia la mesa. Coloque un trozo de cinta sobre la base de la cola para fijar el ratón.
- Aplicar crema depilatoria(Tabla de Materiales)en la región cervical ventral durante 30 a 45 s y luego retirar toda la crema depilatoria de la región cervical usando una gasa seca. Repita el proceso de solicitud si es necesario. Enjuague bien la piel con agua salina o destilada para eliminar cualquier residuo y luego seque.
2. Procedimiento de intubación
- Utilice fórceps rectos y planos en la mano no dominante para retraer suavemente la lengua de una manera que abra suficientemente la boca para la introducción de la cánula.
NOTA: Los fórceps del diente de rata no se deben utilizar, ya que esto dañará la lengua. - Con la mano dominante, avanzar la cánula en la boca de tal forma que el extremo que es distal a la ligera curva está contra el techo de la boca del sujeto.
- Suelte la lengua y deslice el borde plano de los fórceps cerrados caudalmente a lo largo del cuello ventral hasta que se alcance el manubrio. Este movimiento desplaza lateralmente las glándulas salivales y aplana el músculo que cubre la tráquea. La tráquea aparece transcutáneamente como una línea blanca(Figura 3A). Si es necesario, gire los fórceps en una dirección craneodorsal mientras mantiene la tensión en la piel en una dirección caudal para hacer que las glándulas salivales desplazadas lateralmente alcancen su punto máximo. Esta maniobra crea más contraste alrededor de la tráquea(Figura 3B).
NOTA: Evite la fuerza excesiva en el cuello ventral, ya que puede colapsar la tráquea y afectar la respiración. - Avance la cánula mientras se angling simultáneamente la punta distal de la cánula ventralmente por la supinación de la mano dominante con flexión simultánea de la muñeca.
- La colocación adecuada de la cánula se indica mediante la visualización de la cánula opaca en la tráquea(Figura 4B,D). Si la cánula se ha avanzado más allá del nivel del origen del músculo maseter y la visualización de la cánula en la tráquea no se ha confirmado, retirar la cánula y volver a intentar la maniobra.
- Confirme la colocación adecuada de la cánula conectando una bombilla de inflado pulmonar a la cánula y observando la expansión torácica con depresión simultánea del dispositivo.
- Sin desplazar la cánula, desenganche cuidadosamente los incisivos del ratón de la plataforma de intubación. Mueva el ratón a una plataforma horizontal(Tabla de materiales)e inserte la cánula en el adaptador del ventilador. Después de la inflación profunda, ventilar el ratón durante 60 s y luego medir la resistencia respiratoria.
3. Recuperación
- Una vez completado el procedimiento, mueva el ratón a una plataforma calentada. Proporcionar estimulación constante a través de pellizcos de dedo del dedo del dedo de la luz o cola para fomentar la respiración espontánea.
- La extubación puede ocurrir cuando el ratón comienza a masticar. Sujete la cánula a la altura del cubo y tire suavemente del tubo cranealmente y lejos del ratón hasta que la cánula se retire completamente de la boca del sujeto.
NOTA: Es preferible proporcionar soporte de las vías respiratorias con la cánula rígida durante el mayor tiempo posible durante el proceso de recuperación. - Una vez extubado, transfiera el ratón a una jaula de recuperación limpia con soporte térmico. Supervise continuamente el ratón hasta que esté completamente ambulatorio y la recuperación se haya completado.
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Representative Results
Monitorización en serie de la función pulmonar basal
Las hembras de dieciocho semanas de edad BALB/c y los ratones C57BL/6 de 10 semanas de edad (n.o 3 de cada cepa) fueron intubados utilizando el método descrito los días 0, 3, 10 y 17. Después de la intubación en cada día, el sujeto se conectó a un respirador mecánico suministrado con 100% de oxígeno(Tabla de Materiales). La resistencia respiratoria (Rrs) se midió utilizando la técnica de oscilación forzada durante 60 s tras una inflación profunda a 25 cm H2O mantenida durante 5 s. Ningún error de software asociado con esta retención de respiración sostenida junto con los valores Rrs dentro del rango fisiológico proporcionan soporte adicional para la colocación adecuada de la cánula. Los datos no revelaron diferencias significativas de Rrs medidos observados entre los puntos de tiempo dentro de cada cepa(Figura 5). Se supone que la ausencia de un aumento de Rrs a lo largo del tiempo indica falta a inflamación asociada al trauma en el sistema respiratorio en cuatro puntos de tiempo sucesivos.
Análisis estadístico
Las estadísticas descriptivas (error medio y estándar) se calcularon utilizando un software de análisis estadístico(Tabla de materiales). El método Kolmogorov-Smirnov se utilizó para verificar la distribución de datos gaussianos. Los análisis estadísticos de los conjuntos de datos fueron realizados por ANOVA no emparejado, con una comparación múltiple Post hoc Tukey-Kramer después de la prueba. Todos los datos se presentan como medias: se consideró estadísticamente significativa la media de SEM.
Figura 1: Plataforma de intubación. La plataforma de intubación consiste en un aglutinante de tres anillos con un bucle de hilo de seda adherido a la parte superior del aglutinante para crear un bucle de suspensión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de cánulas. (A) Vista lateral de la cánula preparada. Observe el ángulo suave creado aproximadamente 1 cm desde el bisel redondeado en el extremo distal del catéter y la orientación del ángulo de cánula en relación con el bisel. (B) Vista dorsoventral de la cánula preparada. Observe el borde redondeado y alisado del bisel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización traqueal. (A) Los fórceps se colocan en el cuello ventral y la piel se retrae suavemente caudalmente para desplazar lateralmente las glándulas salivales y proporcionar la visualización de la tráquea como una estructura blanca en la línea media ventral (flecha negra). (B) La rotación craneodorsal de los fórceps en el cuello ventral crea una protuberancia de las glándulas salivales (*). La tráquea se visualiza como la estructura lineal blanca en la línea media ventral entre las glándulas salivales (flecha negra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Colocación adecuada de la cánula. (A) Ratón C57BL/6 colocado en la plataforma de intubación con la cánula introducida en la cavidad oral proximal. (B) C57BL/6 ratón con la cánula colocada correctamente en la tráquea. Tenga en cuenta que la cánula se puede visualizar fácilmente como la estructura blanca dentro de la tráquea (flecha blanca). (C) ratón BALB/c colocado en la placa de intubación con la cánula introducida en la cavidad oral proximal. (D) ratón BALB/c con la cánula colocada correctamente en la tráquea. La cánula blanca se puede visualizar fácilmente dentro de la tráquea (flecha negra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Medición en serie de la resistencia. No se observan diferencias significativas de Rrs medidos entre los puntos de tiempo dentro de cada cepa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La intubación mediante la técnica de visualización traqueal transcutánea ofrece un enfoque refinado al método de incisión cutánea estándar. Con especial atención a varios pasos clave, la intubación se puede lograr fácil y rápidamente. El animal debe colocarse directamente en la reclinación dorsal en la plataforma de intubación con el ratón asegurado en una suave retracción. Esto extenderá al animal en la alineación vertical y el posicionamiento adecuado para la intubación. Además, la crema depilatoria no debe permanecer en contacto con la piel del animal durante más de 30 a 45 s y debe enjuagarse a fondo para eliminar todos los residuos. El contacto prolongado de la piel con la crema depilatoria causará dolor innecesario para el animal y las ulceraciones pueden obstruir la vista de la tráquea9. Es imperativo utilizar el movimiento de muñeca adecuado, ya que la mano dominante introduce el catéter en la glotis. La muñeca dominante debe flexionarse mientras la mano se mueve en un movimiento de supinación. También es fundamental monitorear el sujeto de cerca mientras el borde plano de los fórceps se presiona en el cuello ventral para visualizar la tráquea. La presión de los fórceps ocluirá la tráquea y causará hipoxia si se mantiene durante una duración prolongada. Si el paciente parece cianótico, deje una breve pausa para que las membranas mucosas vuelvan a un color rosa y para que la respiración se estabilice antes de repetir los intentos.
No era necesaria una amplia experiencia de intubación del ratón para realizar esta técnica. Las complicaciones más comunes en individuos inexpertos incluyen trauma laríngeo e inflamación de las vías respiratorias superiores debido a múltiples intentos de intubación. Es necesario un seguimiento estrecho durante la recuperación de estos pacientes, ya que se puede indicar una intervención médica con antiinflamatorios no esteroideos. Los intentos de intubación fallidos repetidos pueden provocar traumatismos tisulares e inflamación de la cavidad oral distal, lo que podría provocar ruido respiratorio superior, disnea, hipoxemia, recuperación prolongada, incapacidad para realizar intubación repetida o muerte.
Se recomiendan varias modificaciones en caso de que la intubación no se realice correctamente. En primer lugar, asegúrese de que el bisel de la cánula sea liso, redondeado y cortado a la longitud adecuada para el tamaño del animal. El borde biselado se puede alisar con papel abrasivo para minimizar el traumatismo tisular y facilitar la intubación7. Además, compruebe que la cánula presenta una ligera curva de aproximadamente 15o a una tercera distancia del bisel y que la punta de la cánula se bisela en un ángulo de 45o como se describe en Brown et al.6. Compruebe siempre que el catéter esté en la orientación adecuada antes y durante este procedimiento.
Para este estudio, los ratones fueron intubados para pruebas repetidas de la función pulmonar utilizando un sistema de ventilación mecánica para registrar las mediciones de la función pulmonar. Se utilizó una gran cánula de 18 G para crear un sello hermético. Para realizar estudios de función pulmonar repetida en ratones con un diámetro traqueal más pequeño debido a la edad o la tensión, puede ser difícil colocar una cánula más grande. Si se elige una cánula más pequeña para su uso, asegúrese de que todavía se puede lograr un sello adecuado, y que la resistencia de la cánula no es mayor que la resistencia de las vías respiratorias del sujeto de prueba10. Una perturbación de inflación profunda exitosa es la confirmación adecuada de un sello apropiado. Tenga en cuenta que tal sello es innecesario si sólo se desea la instalación de tratamientos en el pulmón.
Aunque el método descrito ha realizado modificaciones que previenen el daño tisular externo, el límite superior de la frecuencia de la intubación sigue siendo una función del trauma acumulativo de la glotis y la tráquea debido a la introducción excesiva de la cánula. Se recomienda la monitorización simultánea de un grupo de control para aumentos significativos en la resistencia de las vías respiratorias durante un estudio, ya que el traumatismo tisular va acompañado de inflamación que dará lugar a una disminución del diámetro luminal de la tráquea. En el estudio actual no se observaron aumentos significativos en la resistencia de las vías respiratorias en el transcurso de procedimientos de intubación repetidos. Los ratones permanecieron clínicamente normales durante la duración del estudio y la necropsia bruta de las estructuras de las vías respiratorias superiores no era notable en la conclusión del estudio en todos los animales.
En resumen, la técnica de intubación descrita ofrece un método no invasivo para colocar cánulas endotraqueales con un equipo mínimo que incluye una superficie inclinada, fórceps, una cánula de polipropileno y suministros depilatorios. Este método refinado permite eventos de intubación repetidos sin traumatismo tisular recurrente y dolor asociado con un sitio de incisión cutánea en el cuello ventral o un procedimiento de traqueotomía. Además, este método reduce el número de ratones necesarios, ya que los ratones individuales pueden ser intubados repetidamente a lo largo de un estudio. También elimina la necesidad de dispositivos de retención de intubación especialmente diseñados, miras o equipos de transiluminación para la visualización de las vías respiratorias. En este estudio se utilizaron cepas BALB/c y C57BL/6 para demostrar el éxito de la técnica tanto en cepas pigmentadas claras como oscuras y animales de una edad relativamente joven y de pequeño tamaño (10 a 20 ratones de una semana de edad). Esta técnica refinada es adecuada para la instilación intratraal de compuestos, lavado broncoalveolar, imágenes o pruebas de la función pulmonar. Este método mínimamente invasivo y versátil se puede implementar para prácticamente cualquier procedimiento que requiera acceso a las vías respiratorias inferiores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph y Lindsey Ferguson por su asistencia técnica y el Laboratorio Universitario de Recursos Animales por su apoyo al cuidado animal. Este trabajo está financiado por NIH T35OD010977 y R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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